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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(1): 34-41. |
| Antigen Presenting Cells in the Palatine Tonsils and Adenoids. |
| Myung Whun Sung, Won Ho Chung, Seung Ha Oh |
| Department of Otolaryngology, Seoul National University College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 구개편도와 아데노이드에서의 항원제공세포의 분포 |
| 성명훈 · 정원호 · 오승하 |
| 서울대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| ABSTRACT |
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The functions of the palatine tonsils and adenoids have been investigated for many years, but there are still a lot of debates on their immunological roles. The aim of this study was to investigate the distribution of the antigen presenting cells in the palatine tonsils and adenoids, and to reveal their possible association with middle ear effusion. Tissues were collected from 18 pediatric patients who underwent tonsillectomy and adenoidectomy. In 8 of 18 cases, middle ear effusions were coexistent. The immunohistochemical staining using monoclonal antibodies, major histocompatibility complex(MHC) class II, CD1a, CD35, intercellular adhesion molecule(ICAM)-1 and B7 were done. In 10 cases of them, the cells which express MHC class II and ICAM-1 molecules were quantified by flow cytometry. The distribution patterns of the antigen presenting cells between the palatine tonsils and adenoids were not so different, but CD1a-positive cells were more abundant in the tonsils than in the adenoids. Middle ear effusion had no effects on the distribution of the antigen presenting cells in the tonsils and adenoids. Our data suggested both of the palatine tonsils and adenoids might have the same immunological roles, but the tonsils are more active in the antigen-recognizing stage than the adenoids. |
| Keywords:
Antigen presenting cellㆍMHC class IIㆍCD1aㆍICAM-1ㆍCD35 |
서론
구개편도와 아데노이드(adenoids)는 mucosaassociated lymphoid tissue(MALT)에 속하는 것으로서 구강이나 비강을 통하여 유입되는 항원에 대한 일차 면역반응을 담당하며 주로 항체생성에 의한 체액면역반응에 관여한다고 생각된다.3)4)7)13) 이들은 50∼65%의 B 림프구와 40%의 T 림프구로 이루어져 있으며, 3% 가량의 세포는 형질세포로 구성되어 있다.
T 림프구와 B 림프구가 면역반응을 수행하기 위해서는 항원인지단계에서 항원제공세포의 역할이 필요하다. 면역반응이 일어나기 전에 항원단백이 세포내에서 major histocompatibility complex(MHC) 분자와 결합하여 항원으로서 T 림프구에 전달되는 펩티드 조각으로 분리되는 과정을 거치게 되는데, 이러한 과정을 항원제공과정이라 하고 이를 담당하는 세포를 항원제공세포라고 한다. 항원제공세포에는 수지상세포와 대식세포, 상피세포, B 림프구들이 있으며, 특히 수지상세포는 매우 강력한 항원제공세포로서 일차 면역반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.11)12) T 림프구 지역에 있는 interdigitating dendritic cell(IDC)은 CD4 조력 T 림프구에 항원을 제공하고 T 림프구를 활성화시키게 된다. 조력 T 림프구가 활성화되면 T 림프구의 증식이 일어나게 되고, cytokine이 분비되면서 세포면역반응과 함께 B 림프구에도 영향을 주어 체액면역반응에도 영향을 주게 된다. 배중심에 존재하는 follicular dendritic cell(FDC)도 항원제공세포로서 B 림프구의 활성화 및 증식에 중요한 역할을 할뿐만 아니라 면역글로블린의 isotype switching이나 memory B cell의 생성에 관여하는 것으로 알려져 있다.11)
구개편도나 아데노이드에는 면역학적으로 활성화된 세포들이 많이 침윤되어있고, 유소아기에 비해 나이가 들어감에 따라 실질이 수축하고 효과기 세포의 수도 감소한다.1) 항원제공세포는 B 림프구와 T 림프구를 활성화시키는데 반드시 필요하므로 이들 조직에서 항원제공세포의 분포를 관찰하는 것은 항원인지단계에서 이들 조직들의 면역학적인 기능을 이해하는데 도움이 될 수 있다.6)11)
본 연구에서는 구개편도와 아데노이드에서 조력 T 림프구에 항원을 제공하기 위해 필수적인 MHC class Ⅱ의 발현양상을 관찰하고, 강력한 항원제공세포로 알려진 수지상세포, 면역반응의 ‘co-stimulator’로서 T 림프구의 활성화에 꼭 필요한 B7 분자와 유착분자인 intercellular adhesion molecule(ICAM)-1의 분포양상을 비교하여 이 두 조직간의 차이점을 확인하고, 또한 삼출성중이염의 유무가 편도와 아데노이드의 항원제공세포의 분포와 어떤 상관관계가 있는지 알아보고자 하였다.
대상 및 방법
1. 대상의 선정
본 연구에서는 빈번한 편도의 염증이나 편도나 아데노이드의 과도한 증식으로 편도-아데노이드적출술을 시행받은 4세에서 6세의 소아환자 18례로 부터 얻은 수술조직을 이용하여 실험을 시행하였다. 중이염의 병력이 없고 술전검사시 중이질환의 증거가 보이지 않았던 환자군과 술전 3개월내에 삼출성중이염의 병력을 보였던 군으로 나누어 관찰결과를 비교하였다. 삼출성중이염의 판정은 현미경을 통한 고막소견 및 tympanometry에 근거하였다. 18례중 삼출성중이염을 동반한 예는 8례, 중이질환을 보이지 않았던 예는 10례 있었다.
모든 조직은 조직의 일부를 적출 즉시 포르말린 고정액에 고정하여 파라핀 포매하에 면역조직화학염색을 시행하였고, 10례에서는 일부 조직을 phosphate buffered saline(PBS) 용액에 넣어 실험실로 가져와서 즉시 유세포분석을 시행하였다. 양성세포의 정량적인 분석을 위해 MHC class Ⅱ, ICAM-1, B7의 경우에는 유세포분석을 이용하였고, CD1a 양성세포의 분석은 광학현미경으로 고배율(x400)하에서 대표적인 6개의 시야를 이용하여 양성세포를 세어 그 평균값으로 계산하였다. 양성세포의 수는 전혀 염색된 세포가 보이지 않을 경우는 음성(-), 가끔 양성세포가 보이는 경우는(±), 10개 미만의 양성세포가 보일 때에는(＋), 10개에서 100개 사이의 양성세포가 보일 때는(＋＋), 100개 이상일 때는(＋＋＋)로 표기하였다.
2. 면역조직화학염색
파라핀에 포매된 조직을 xylene으로 처리하여 파라핀을 제거하고 알코올을 이용하여 재수화시켰다. 펩신으로 3분간 처리한 후 증류수로 세척하고, 구연산 완충액내에서 10분간 microwave속에 놓아둔 후 3% H 2O 2로 3분간 처리하여 내재된 peroxidase를 제거하였다. 이후 PBS로 10분간, blocking reagent로 30분간 처리하였다. 일차항체로 2시간 반응시킨 후 10분간 PBS로 세척하고, 이차항체를 30분간 반응시킨 후 PBS로 10분간 세척을 하였다. Conjugated horse radish peroxidase로 30분간 반응시킨 후 PBS로 10분간 세척하고 3, 3-diaminobenzidine으로 5분간 반응시켰다. 증류수 세척 후 Meyer’s hematoxyline으로 counter-staining하고 mounting하였다. 일차항체로는 MHC class Ⅱ(1：200, DAKO, Glostrup, Denmark), CD1a(1：10, Immunotech, Marseille, France), CD35(1：20, DAKO), ICAM-1(1：50, DAKO), B7(1：20, Becton-Dickinson, San Jose, CA)를 사용하였다.
3. 유세포분석
유세포분석을 위해 PBS에 넣어 운반된 편도와 아데노이드 조직을 4회 세척하고 조각을 2×2mm 절편으로 잘게 자른 후 조직을 피펫으로 여러번 흡인과 배출을 반복시행하고 나일론 mesh를 통과시켰다. 걸러진 용액을 1200rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 분리하였다. Pellet을 2회 세척한 후에 100% Ficoll-Hypaque으로 2000 rpm, 30분 동안 원심분리를 하고 형성된 림프구층을 분리하였다. 유세포분석용 튜브에 림프구의 수가 1×10 6가 되도록 100μl의 용액을 넣고 적정한 농도의 항체(MHC class Ⅱ；1：100, ICAM-1；1：50, B7；1：20)와 4℃에서 30분간 반응을 시켰다. 일차항체와의 반응이 끝난 후 2회 세척하고 이차항체와 30분간 반응을 시켰다. 이차항체는 FITC가 붙은 goat anti-mouse 항체(1：100, DAKO)를 사용하였다. 모든 반응이 끝나면 2회 세척한 후에 4% paraformaldehyde 고정액으로 고정하고 Becton-Dickinson FACStar Plus로 유세포분석을 시행하였다.
림프구를 활성화하기 위하여 분리된 림프구를 RPMI 1640 배지에 phytohemagglutinin(PHA, 5μg/ml)을 넣고 배양을 시행하였다. 활성화된 림프구는 배양 3일째 B7에 대한 항체를 이용하여 유세포분석을 시행하였다.
통계학적인 분석은 구개편도와 아데노이드조직간의 차이, 삼출성중이염군과 삼출성중이염이 없는 군간의 유의성을 검증하기 위하여 Mann-Whitney U test를 시행하였다.
결과
1. 면역조직화학염색
Table 1은 각 부위별로 염색된 세포의 분포를 보여주고 있다.
MHC class Ⅱ： MHC class Ⅱ는 배중심부위와 외투층에서 가장 강하게 염색이 되었고, 특히 외투층부위를 향하여 염색된 세포가 밀집되어 있는 양상을 보였다. 소포간부위에도 염색되는 세포들이 많이 존재하였다. 상피세포에서는 특히 기저세포를 따라서 강하게 염색되는 경향을 보였고 기저상부세포에서도 염색되는 세포들을 다수 관찰할 수 있었다. 이러한 염색된 세포의 분포양상은 구개편도와 아데노이드조직간에 차이를 보이지 않았고, 삼출성중이염의 유무에 따라서도 분포의 차이가 없었다.
CD1a：편도 상피세포내와 상피하층에서 수지상모양의 세포가 강하게 염색되는 것을 관찰할 수가 있었으며, 소포간부위에도 국소적으로 염색되는 양상을 보이고 있었다(Fig. 1). 특히 음와주변에서도 염색되는 세포들이 많이 관찰되었다. 배중심내에는 염색되는 세포를 확인할 수 없었다. 아데노이드에 비해 구개편도에서 관찰된 세포수가 많았으며 상피세포와 소포간부위에서 대부분 관찰되었다. 편도 상피세포에서의 양성세포의 수는 고배율(×400) 시야에서 평균 21개이었고, 아데노이드에서는 11개이었다. 소포간부위에서는 편도에서는 평균 15개, 아데노이드에서는 4개의 양성세포가 존재하였다. 따라서 편도에서의 양성세포수가 아데노이드에 비해 많이 존재하였고, 상피세포층에서 소포간부위보다 양성세포의 분포가 높았다. 아데노이드 조직에서도 상피세포층이 소포간부위보다 양성세포가 많이 발견되었으며 그 수도 구개편도에 비해서 적게 나타났다. 삼출성중이염과 CD1a 양성세포의 분포와의 관계에서는 별다른 유의성을 발견할 수 없었다.
CD35：Follicular dendritic cell과 반응하는 CD35는 배중심과 외투층에서만 염색되는 양상을 보였다(Fig. 2). 또한 특징적으로 외투층부위를 향하여 염색되는 세포가 밀집되는 양상을 보이면서 염색된 세포들이 외투층부위로 빠져나가는 양상을 보여주고 있었다.
ICAM-1：구개편도나 아데노이드조직에서 모두 소포간부위 및 음와주변, 상피하층에 염색된 세포들이 분포하였다. 구개편도조직에서 아데노이드보다 염색된 세포의 수가 많이 발견되었으며 소포내에서도 몇몇 세포들이 염색되었다.
B7：면역조직화학염색으로 구개편도나 아데노이드 조직에서 염색된 세포를 발견할 수가 없었다.
2. 유세포분석
유세포분석상 MHC class Ⅱ의 발현을 보이는 세포는 구개편도에서는 32.8±10.1%, 아데노이드에서는 30.6±10.5%로 두 조직간이나 삼출성중이염의 유무와 관계없이 유의한 차이는 보이지 않았다(Table 2).
ICAM-1이 발현된 세포의 빈도는 구개편도와 아데노이드조직에서 각각 35.3±10.9%, 34.7±13.6%였고, 이중 삼출성중이염이 있는 군의 아데노이드조직에서 43.8 ±7.3으로 발현빈도가 높았으나 통계적으로 유의하지 않았다(Fig. 3).
B7의 경우 당일 유세포분석을 시행한 경우는 양성세포가 보이지 않았으나 림프구를 활성화시키기위하여 PHA를 넣고 3일간 배양을 시행한 후 유세포분석을 시행하였을 경우에 편도에서는 14.5%, 아데노이드에서는 8.3%에서 양성세포가 나타남을 알 수 있었다(Fig. 4).
고안
외부의 항원이 인두림프조직으로 들어오게 되면 항원인지단계에서 항원제공세포가 활동하게 된다. 항원제공세포는 T 림프구와 B 림프구가 활성화할 수 있도록 들어온 항원을 조작하여 면역세포에게 전달하여 주는 역할을 한다. 항원이 편도와 아데노이드의 상피를 통하여 들어오게 되면 MHC class Ⅱ와 연계하여 항원제공세포를 통해 조력 T 림프구가 자극을 받게 된다. 자극을 받은 조력 T 림프구는 소포내에서 B 림프구를 자극하여 항체를 생성하기도 하고 기억 B 림프구를 만들기도 한다. T 림프구의 활성은 또한 cytokine과 유착분자의 생성을 조장시키게 되고 따라서 MHC class Ⅱ의 발현도도 높아지게 된다.6) IDC 또는 Langerhans’ cell은 이러한 항원제공세포로서의 기능을 잘 수행하는 대표적인 세포로 알려져 있다.
외부항원이 T 림프구에 의한 세포면역반응을 일으키기 위해서는 MHC class Ⅱ와의 결합이 반드시 필요하다. MHC class Ⅱ의 발현은 항원제공세포의 기능을 가지는 모든 세포에서 관찰되는데 편도조직에서 HLA-DR 양성세포를 보이는 세포는 주로 B 림프구이고, 이 밖에 수지상세포나 대식세포들에서도 발현된다.6) 편도조직에서 HLA-DR 양성세포는 Hemlin 등 8)은 50∼80%, Cortesina 등5)은 30∼40%에서 나타난다고 보고하였고, 본 연구에서도 구개편도와 아데노이드에서 약 30%의 양성을 보였다. 상피세포의 기저층을 중심으로 HLA-DR 양성세포가 많이 분포하고 있는 것에 대해서 Kimura 등은 HLA-DR 의 발현이 상피세포에서 높아질수록 T 림프구의 침윤이 증가되어 세포면역반응을 효율적으로 수행하기 때문이라고 보았다.10)
구개편도나 아데노이드조직에서 가장 강력한 항원제공세포는 interdigitating dendritic cell(IDC)로 알려져 있으며 조력 T 림프구로의 항원제공기능을 맡고 있다. 조력 T 림프구는 소포간부위에 주로 분포하며, 상피층이나 배중심으로도 이동하는 것으로 알려져 있다.6) 따라서 T 림프구로의 항원제공기능을 가지는 IDC, monocyte, macrophage 등의 항원제공세포는 대개 소포간부위와 상피세포에 분포하게 된다. 구개편도와 아데노이드에서도 CD1a 양성세포의 빈도의 차이를 보였는데 이는 소포발달의 차이와 아데노이드의 상피세포의 형태에 기인하였다. 즉 같은 환자에서도 아데노이드의 소포의 발달이 편도에 비해 적게 나타날 경우 아데노이드에서의 CD1a 양성세포가 적게 나타났다. 또한 호흡상피세포로 덮인 아데노이드에서는 상피세포에 발현되는 양성 세포의 수도 적게 나타났다. 통계학적인 유의성은 없었지만 전반적으로 구개편도에서 아데노이드에 비해 CD1a 양성세포의 빈도가 높은 것으로 보아 한 환자에서도 두 조직간에 항원제공세포활성상태나 그 이후의 면역반응의 활성도에 차이가 있을 가능성을 시사하였다.
B 림프구는 주로 배중심과 외투층에 분포하고 있다. 외투층에 존재하는 B 림프구는 주로 안정화된 B 림프구이거나 기억 B 림프구라고 생각되어지고 있고 배중심에 있는 세포는 주로 활성화되는 B 림프구라고 알려져있다.2)3)4) 배중심에서 일어나는 B 림프구의 활성화는 배중심의 FDC가 중요한 역할을 하게된다. 외부에서 들어온 항원은 IgM이나 IgG 형태의 항체와 결합하여 보체를 포함한 면역복합체 형태로 FDC에 붙어 있게 된다. 보체의 활성화가 일어나게 되면 염증성 매개체가 생성되고 이들에 의해 iccosome이 형성되어 B 림프구에 붙게 된다. 복합체내의 항원은 B 림프구에 흡수되어 MHC class Ⅱ와 부착되어 조력 T 림프구에 제공되게 되고 활성화된 T 림프구는 B 림프구의 증식 및 분화를 일으키게 된다.3)4)
FDC의 C3b 수용체에 결합하는 CD35 항체를 이용하면 배중심과 외투층에 국한되어있는 FDC를 확인할 수 있는데, 긴돌기가 서로 엉켜있는 모양을 하기 때문에 정확한 세포의 모양을 확인하기가 어렵다. 염색되는 세포는 주로 외투층부위를 향하여 빈도가 많아지는 경향을 보였고 배중심에서 외투층으로 빠져나가는 양상을 보이고 있었다. 이는 배중심을 dark zone, basal light zone, apical light zone으로 분류하여 apical light zone에서 T 림프구와 B 림프구의 작용이 활발히 일어난다는 보고에 따른다고 볼 수 있다.14)
T 림프구의 활성화가 일어나기 위해서는 MHC class Ⅱ 이외에도 costimulator의 역할이 필수적이다. 현재 알려진 costimulator로는 B7 분자가 대표적인데 이는 항원에 특이적이지 않지만 이 분자가 없으면 T 림프구가 항원에 접하더라도 세포는 죽게되거나 anergy상태에 빠지게 된다.9) B7 분자는 naive T 림프구의 CD28 분자와 결합하는 B7.1과 감작된 T 림프구의 CTLA-4에 결합하는 B7.2로 나누고 있으며, 이들 분자는 항원제공세포의 역할을 수행하는 수지상세포와 B 림프구, 대식세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다. Janeway 등은 B7이 항상 발현되고 있는 세포는 수지상세포이고 B 림프구나 대식세포는 이들 세포가 활성화되었을 때 발현이 증가하게 된다고 하였고9), Vyth-Dreese 등은 배중심에서 각 부위별로 B7.1과 B7.2가 다르게 발현됨을 보고하여 B7.1은 주로 B 림프구의 증식에 B7.2는 B 림프구의 분화에 관여하는 등 각 분자의 기능이 다르다고 보고하였다.14) 본 연구에서 사용한 분자는 CD28를 ligand를 갖는 B7.1으로서 구개편도나 아데노이드 모두 수술 후 바로 처리한 조직에서는 면역조직화학적인 염색이나 유세포분석하에서 B7 분자의 발현을 발견하지 못하였다. 그러나 PHA를 이용하여 분리된 림프구를 배양하여 림프구를 활성화시켰을 때 약 10%정도의 발현율을 나타내었고 발현율도 아데노이드보다 구개편도에서 비교적 높이 나타나는 경향을 보였다.
유착분자도 또한 T 림프구를 활성화시키는 데 없어서는 안되는 costimulator이다. B7 분자와 같이 어떤 신호를 전달해주지는 않지만 항원제공세포와 T 림프구간의 결합력을 안정화시켜 T 림프구의 활성화를 일으키게 된다. 특히 수지상세포가 항원제공세포의 역할을 효과적으로 할 수 있는 이유는 수지상세포가 MHC class Ⅱ 분자의 발현율이 높고, 형태학적으로 세포돌기가 뻗어나와 T 림프구와의 접촉면적이 넓은 까닭도 있지만 ICAM-1 이나 ICAM-2와 같은 유착분자의 발현이 높기 때문이다.12)
결론
편도와 아데노이드의 면역학적인 기능을 항원제공세포의 분포의 측면에서 볼 때 구개편도가 아데노이드에 비해 항원제공세포의 수가 높게 나타났다. 그러나 같은 조직에서 삼출성중이염이 동반유무에 따른 비교에서는 유의한 차이점을 발견할 수가 없었다. 이러한 결과는 한 개체에서도 구개편도가 아데노이드에 비해 항원에의 노출과 이에 대한 반응이 더욱 활발하여 항원제공세포의 활성화이후 항원인지단계에서 면역학적인 활성도가 편도가 아데노이드보다 왕성할 가능성을 시사한다.
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