| Correlation of Apoptosis with HPV, p53 Expression, and PCNA Expression in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma. |
| Chan Seung Hwang, Gi Bum Kim, Byung Sang Han, Hoon Sik Yang, Chun Gil Kim |
| Department of Otolaryngology, College of Medicene, Chung-Ang University, Seoul, Korea. |
| 후두편평세포암에서 HPV, p53 및 PCNA 발현양상과 세포고사와의 관계 |
| 황찬승 · 김기범 · 한병상 · 양훈식 · 김춘길 |
| 중앙대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
후두편평세포암ㆍ세포고사ㆍHPVㆍp53ㆍPCNA. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Programmed cell death (apoptosis) is distinctive form of cell death manifested by characteristic chromatin condensation and DNA fragmentation, whose function is the deletion of cells in normal development, organogenesis, immune function, and tissue growth, but which can also be induced by pathologic stimuli.
The purpose of this study was to analyze the relationship between apoptotic index and HPV, p53 and PCNA expression, and clinicopathological findings in laryngeal squamous cell carcinomas.
MATERIALS AND METHODS:
Fourty-one cases of laryngeal squamous cell carcinomas were analyzed for the detection of HPV DNA by in situ hybridization, the expression of p53 and PCNA by immunohistochemical technique, and detection of apoptotic bodies by in situ hybridization.
RESULTS:
HPV DNA was detected in 8 (19.51%), p53 was expressed in 26 (63.41%) out of 41 cases, and the PCNA expression rate was 48.39+/-21.06%. The average apoptotic index was 9.38+/-2.89, there was no relationship between apoptotic index and HPV and p53 expression (p>0.05). The apoptotic indices were 11.26+/-1.86, 8.17+/-2.55, and 4.32+/-2.41 in well differentiatied, moderately differentiatied and poorly differentiatied carcinoma, respectively. The histopathological differences were statistically significant (p<0.05). Also there was an inverse proportion between apoptotic index and PCNA expression.
CONCLUSION:
The apoptotic index was related to cellular differentiation regardless of HPV and p53 expression. Also these results suggest that the numbers of apoptotic bodies in the tumor tissues can make it possible to presume indirectly the malignant potentiality of the tumor and will help us to understand the biologic behavior of head and neck cancer. |
| Keywords:
Human papillomavirusㆍp53ㆍPCNAㆍApoptosisㆍLaryngeal carcinoma |
서론
암의 발생은 여러 인자들이 작용하고 또한 여러 단계를 거쳐서 일어나며, 최근 분자생물학의 발전으로 세포의 악성변형(malignant transformation)이 바이러스감염, 암억제유전자의 이상, 암유전자의 활성화 등 다양한 유전학적 변이가 복합적으로 관여하여 발생한다고 밝혀졌다.
세포고사란 유전자 발현의 변화로 발생하는 세포자신의 파괴로 다세포기관의 성장, 분화 및 사멸의 생체균형을 유지하는데 꼭 필요한 정상 생리적 과정이며,1) 종양조직내에서는 종양세포의 성장속도를 조절하고2) 방사선 치료나 항암제 치료에 대한 종양세포의 반응정도에 관여하는3) 중요한 과정이다. 세포고사는 c-myc, p53, pRB, c-fos, bcl2, bax와 같은 유전자나 HPV E6, E7 암단백, adenovirus E1A, E1B 암단백에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있으나,3) 후두편평세포암에서 종양세포의 분화도, 후두편평세포암의 한 원인인자로 알려진 human papillomavirus(HPV)와 p53 단백 발현에 따른 세포고사 정도에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
따라서 저자들은 후두편평세포암에서 HPV 검출율, p53 단백의 발현 및 PCNA 발현율을 알아보고 세포고사와의 관계를 관찰함으로써 후두편평세포암의 생물학적 특성을 이해하는데 도움을 얻고자 하였다.
재료 및 방법
재료
중앙대학교 의과대학 이비인후과학교실에서 조직검사로 진단된 후두편평세포암 41례(성문상부암 23례, 성문암 18 례)를 대상으로 하였다. 대상례의 연령분포는 47∼78세로 평균연령은 60.2세 이었고, 성별분포는 남자 39례, 여자 2례로 남녀비는 19.5：1이었다. 대상례의 조직표본 재료는 적출된 조직의 hematoxylin-eosin 염색표본을 검토하여 종양이 50% 이상 포함되고 파라핀 포매조직의 보관상태가 양호한 부위를 선택하였다.
방법
HPV의 검출
전처치
파라핀에 포매된 조직을 5 μm 두께로 절편하여 L-lysin으로 처리된 슬라이드에 부착한 후 하룻밤 오븐에 두어 조직을 잘 부착시키고, xylene으로 조직을 탈파라핀 후 100%에서 70%까지의 에탄올에서 순차적으로 처리후 증류수에 담가 함수과정을 거친 다음 공기중에 건조시켰다.
변성과정(denaturation)
Pepsin/Hcl 용액에 37℃로 10분간 담가 digestion시킨 후 증류수로 씻어내고 공기중에 건조시켰다. DAKO사의 FITC-labelled HPV type 16, 18 probe를 한 방울(15 μl) 떨어뜨린 후 coverslip으로 덮고 90℃ heating block plate에 슬라이드를 6분간 놓아서 probe와 target DNA를 denaturation시켰다.
보합과정(hybridization)
humidified chamber에서 37℃로 60분간 incubation하여 probe를 target DNA에 hybridization시켰다. Stringent 세척후 T1 buffer(0.1% Triton X-100을 함유한 0.05 M Tris buffer)에 1시간 정도 담궈 놓아 자연적으로 coverslip이 떨어지게 하였다.
검출과정(detection)
비특이적 반응을 제거하기 위하여 T3 buffer(20% normal rabbit serum을 함유한 T2 buffer)에 10분간 담가 놓은 후, T2 buffer(3% bovine serum albumin을 함유한 T1 buffer)로 100배 희석한 anti-FITC/AP 시약으로 30분간 반응시켰다. 검출계로는 biotin과 avidin 사이의 강한 결합력을 이용하여 complementary target과 결합한 biotinylated probe를 검출할 목적으로 avidin-alkaline phosphatase를 사용하였다. T1 buffer로 세척한 후 alkaline phosphatase buffer에 5분간 반응시켰다. 발색제로 사용한 NBT/BCIP(nitroblue tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3-indolyphosphate)와 내재성 alkaline phosphatase를 억제하기 위하여 추가한 levamisol(1 μl/ml)의 혼합용액을 alkaline phosphatase buffer로 50배 희석하여 만든 용액에 1시간 반응시킨 후 T1 buffer로 세척하였다. 대조염색으로 ethyl green을 사용하였으며 광학현미경하에 관찰하였다. 양성반응의 양상은 종양세포의 핵에 국한되어 짙은 푸른색으로 염색된 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 1).
p53 단백의 검출
전처치
조직이 부착된 슬라이드를 60℃ 오븐에서 1시간 처리하고, xylene으로 탈파라핀 후 에탄올로 함수시켰다. 내재성 과산화수소를 제거하기 위하여 2.5% hydrogen peroxide에 30분간 처리하고 10 mM citric acid에 담궈서 microwave oven으로 5분간 가열하고 실온에서 30분간 식힌 후, 다시 microwave oven으로 5분간 가열한 후 0.05 M Tris buffered saline(pH 7.6)으로 10분간 2회 세척하였다. 비특이적 항원-항체반응을 억제하기 위하여 정상 염소혈청으로 1시간 반응시켰다.
LSAB법
일차항체는 단클론성 항체(clone DO-7, Novocastra Lab., Ltd. Newcastle, U.K.)로 정상형(wild type)과 변이형(mutant type)의 p53 유전자를 확인할 수 있는 항체이며 1：30으로 희석하여 실온에서 하룻밤 반응시켰다. Tris buffer로 3회 세척한 다음 biotin과 결합된 이차항체를 15분간 반응시킨 후 streptavidin-horseradish peroxidase를 15분간 반응시켰다. AEC chromogen 용액으로 발색시켜 Meyer’s hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 양성반응의 양상은 종양세포의 핵에 국한되어 담갈색으로 염색된 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
PCNA의 검출
방법
PCNA 검출은 p53 단백 검출 방법과 동일한 면역조직화학염색법을 사용하였으며, 일차항체는 단클론성 항체 PC 10(DAKO사)을 1：60으로 희석하여 사용하였다.
판독
염색된 모든 조직표본은 저배율(100배 시야)로 염색이 잘 된 부분을 선택하여 고배율(400배 시야)에서 관찰하여, 총 종양세포의 합계에서 양성으로 염색된 세포의 개수를 백분율로 나타내었다.4) 이때 각 슬라이드 표본당 10개의 고배율 시야에서 구한 값의 평균값으로 PCNA index를 산출하였다. 양성반응의 양상은 종양세포의 핵에 국한되어 담갈색으로 염색되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3).
고사체(apoptotic bodies)의 검출
방법
파라핀에 포매된 조직을 4∼5 μm 두께로 절편하여 L-lysin으로 처리된 슬라이드에 놓고 오븐에서 가열하여 접착시켰다. xylene에 5분간 2회 씻어 탈파라핀 과정을 거친 후 에탄올에 순차적으로 함수하고 단백분해효소(proteinase K)에 15분간 반응시켰다. 반응된 슬라이드를 Oncor사 제품의 동소고사감지 시약(in situ apoptosis detection kit, ApopTag TMkit)을 이용하여 in situ hybridization을 시행하였다. 먼저 DNA 편절의 끝에 붙어 있는 3‘-OH기를 digoxigenin-nucleotide(deoxyribonucleotide triphosphate)로 치환하기 위하여 슬라이드를 중화제로 처리 후 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase) 효소를 넣고 37℃에 1시간 항온 반응시켰다. 반응시킨 슬라이드는 준비된 중화제로 30분간 씻은 후 antidigoxigenin peroxidase를 첨가하여 상온에서 30분간 처리하였다. 가습된 슬라이드를 phosphate buffered saline으로 씻고 3,3‘-diaminobenzidine으로 발색 후 methyl green으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
판독
관찰부위는 종양세포가 정상 조직을 침습하는 변연부는 가능한 피하고 종양세포로만 이루어진 현미경시야를 선택하였으며, 현미경시야에 조직괴사 부위는 포함되지 않도록 하였다. 저배율(100배 시야)에서 위에 기술한 조건을 만족시키는 부위를 선택하여 고배율(400배 시야)에서 고사체 수를 세었으며, 각 슬라이드 표본당 10개의 고배율 시야에서 관찰된 고사체 수의 평균값으로 세포고사지수(apoptotic index)를 산출하였다.5)
고사체 및 괴사부위는 DNA 편절 및 세포와 핵막의 파괴에 의하여 노출된 핵질 때문에 갈색으로 염색된다. 괴사조직과의 차이는 고사체가 대개 2 μm 크기면서 괴사조직 세포보다 더 짙은 갈색으로 염색되고, 둥글거나 초생달 모양의 일정한 형태를 갖추고 있어 구분이 가능하였다(Fig. 4).
통계학적 검정
세포고사지수와 HPV 검출율, p53 단백 발현율 및 세포분화도 등과의 관련성 검정은 t-test와 ANOVA를 이용하였으며, PCNA 발현율과의 관련성 검정은 Pearson’s correlation analysis를 이용하였다.
결과
HPV 검출과 p53 단백 및 PCNA 발현
In situ hybridization(ISH)법을 이용한 HPV의 검출 결과는 HPV type 16 3례, HPV type 18 5례로 후두편평세포암 41례중 8례(19.51%)에서 HPV가 검출되었다.
면역조직화학염색법을 이용한 p53 단백 발현된 예는 후두편평세포암 41례중 26례(63.41%)이었으며, PCNA 발현율은 11.26%에서 84.76%로 평균 48.39±21.06%이었다(Table 1).
고사체(apoptotic bodies) 검출
세포고사지수와 HPV 검출, p53 단백 발현과의 연관성
면역조직화학염색법을 이용한 세포고사지수는 3.8에서 13.2로 평균 9.38±2.89이었으며, HPV가 검출된 경우 세포고사지수는 7.94±1.93, HPV가 검출되지않은 경우는 9.72±3.00로 HPV가 검출되지않은 예에서 세포고사지수는 높았으나 통계학적으로 유의한 차이는 없었다.
p53 단백이 발현된 경우 세포고사지수는 9.14±2.85, p53 단백이 발현되지 않은 경우는 9.79±3.01로 p53 단백이 발현되지 않은 예에서 세포고사지수는 높았으나 통계학적으로 유의한 차이는 없었다(Table 2).
원발병소의 T 병기와 세포고사지수와의 연관성
원발병소의 T 병기에 따른 세포고사지수는 제1기 10.85 ±0.07, 2기는 10.41±2.60, 3기는 8.94±2.95, 4기는 9.15 ±3.21로 T 병기와 세포고사지수는 연관성이 없었다(Table 3).
림프절 전이 유무와 세포고사지수와의 연관성
림프절 전이가 없었던 경우 세포고사지수는 9.06±2.81, 림프절 전이가 있었던 경우는 9.93±3.05로 림프절 전이가 있었던 예에서 세포고사지수가 높았으나 통계학적으로 유의한 차이는 없었다(Table 4).
세포고사지수와 세포분화도, PCNA 발현율과의 연관성
세포분화도가 좋은 경우 세포고사지수는 11.26±1.86, 중등도 분화도의 경우 8.17±2.55, 분화도가 나쁜 경우는 4.33±2.41로 세포분화도가 좋을수록 세포고사지수는 높았으며 통계학적으로 유의한 차이가 있었다(Table 5). 또한 PCNA 발현율과 세포고사지수와의 관계는 Pearson’s correlation analysis상 유의하게 역비례의 관계가 있었다(r＝-0.46, p<0.01).
고찰
생체균형을 유지하는데 꼭 필요한 세포사망의 기전은 두 종류로 대별하여 세포고사(apoptosis)와 세포괴사(necrosis)이다. 세포고사는 세포의 괴사나 퇴행성 사망과는 다르게 유전자의 조절에 따라 진행되고, 세포가 스스로 자멸하는 능동적, 생리적 과정이며 생체의 항상성기능(homeostatic function)에 작용한다.1) 반면에 세포괴사는 우발적으로 발생할 수 있고, 심한 손상으로 인하여 세포가 파괴됨으로써 염증반응과 함께 발생한다.
세포고사는 성장과정중 조직의 개형, 내분비 또는 다른 자극 후 조직위축과정에서 세포소멸, 정상 조직 교체과정시 생리적인 세포사망 등의 정상 생리적인 상태뿐 아니라, 영양결핍, 세포와 기질간의 상호관계의 파괴, 암유전자의 비정상적인 발현, DNA 손상, 바이러스 감염 등 병적 상태에서도 일어난다.3)6)7) 이와같이 정상 조직의 항상성 유지에 매우 중요한 역할을 하는 세포고사과정에 문제가 발생하면 다단계 발암기전중 하나의 기전으로 작용할 것으로 생각된다.8) 또한 종양조직에서 종양세포의 성장속도를 조절함으로써 전체적인 종양의 크기를 조절하는 자기조절기전에 관여하고,3) 항암제나 방사선 치료에 대한 종양세포의 반응성(susceptibility)을 증가시키는 것으로 알려져 있다.9)
형태학적으로 세포괴사와는 달리 핵형질이 치밀해진 후 핵막에 작은 덩어리가 형성되고, 핵분절이 일어나며, 세포질이 농축되어 세포표면이 꽃자루모양돌기 형태를 취한 후 돌기들이 떨어져 나와 고사체를 형성한다.3) 이러한 고사체는 주위 세포나 대식세포에 존재하는 vitronectin 수용체를 통하여 탐식작용이 일어나며, 세포괴사과정에서 대식세포의 탐식작용시 neutrophil chemotactic mediator가 분비되어 염증반응을 유발하는데 반하여 vitronectin 수용체에서는 염증반응이 일어나지 않는다.3) 세포고사의 생화학적 기전은 확실하게 증명된 바는 없지만 세포질내 칼슘치가 증가되어 칼슘의존성 endonuclease가 활성화 되어 세포질내 단백질의 cross-linking이 일어나 세포질이 농축되고 수액이 밖으로 빠져 나가 고사체를 형성한다.3)
고사체는 생체내에서 짧은 시간에 탐식되고 소화되기 때문에 광학현미경하에서는 수시간 밖에 나타나지 않아 조직학적으로 관찰하기 용이치 않다.10) 그러나 면역조직화학적 방법으로 DNA 분절을 염색하면 전기영동보다 민감도가 높고 종양조직내에서 직접 관찰할 수 있다.11) 또한 hematoxylin-eosin 염색으로도 고사체를 관찰할 수 있으나 면역조직화학적 방법을 이용하면 조직의 직접 비교가 가능하고, 무작위로 추출한 고배율 시야에서 관찰된 고사체수의 평균값을 구하여 고사체 발현의 객관적 지표로 사용할 수 있다.12)
세포고사를 조절하는 인자로는 HPV type 16, 18 E6, E7 유전자, adenovirus E1A, E1B 유전자, c-myc, p53, bax, ras, bcl2, pRB 유전자들이 관여하며, 특히 E7, E1B, c-myc, bax, p53 유전자 등은 세포고사를 촉진하며, E6, E1A, bcl2, ras, pRB 유전자 등은 세포고사를 억제하는 것으로 알려져 있다.8)13)14)
HPV type 16, 18의 E7 유전자는 c-myc 유전자 발현을 촉진하고, pRB 유전자를 억제함으로써 세포고사를 촉진하며, E6 유전자는 p53과 결합하여 분해시킴으로써 세포고사를 억제하는 것으로 보고되고 있다. 7) HPV type 16, 18 감염시 E6, E7 유전자중 어떤 유전자가 세포고사에 우세하게 영향을 미치는지는 규명되지는 않았지만, 종양세포의 억제는 p53 유전자가 E7 기능에 비하여 더 우세하게 작용하는 것으로 알려져 있다.15) Shoji 등16)은 자궁경부암종에서 HPV type 16, 18 감염과 세포고사와는 직접적인 연관성이 없으며 세포악성도와 밀접한 연관성이 있다고 하였다. 저자들의 연구에서도 HPV가 검출되지않은 예에서 세포고사지수는 9.72로 HPV가 검출된 예에서의 세포고사지수 7.94보다 높았으나 통계학적 의의는 없었다.
암억제유전자로 잘 알려진 정상형 p53 유전자는 세포주기중 G1 단계에서 세포성장을 억제하고17) 세포고사를 촉진함으로써18) 생체내에서 중요한 항증식기능을 갖고 있는 유전자이다. 그러나 돌연변이나 viral oncogene과 결합하여 정상형 p53 유전자의 기능이 소실되면 세포고사가 억제되고 종양세포의 증식이 촉진된다.8) 저자들은 면역조직화학염색법을 통하여 p53 단백을 검출하여 p53 단백 발현과 세포고사와의 연관성을 알아 본 결과, p53 단백 발현이 안된 예에서 세포고사지수는 9.79로 p53 단백 발현이 된 예의 세포고사지수 9.14보다 높았으나 통계학적 의의는 없었다. 그러나 면역조직화학염색시 발현되는 p53 단백은 대부분 변이형 p53 단백으로 생각할 수 있으며, 변이형 p53 단백은 세포고사를 억제하여 p53 단백 발현이 관찰된 예에서 세포고사지수는 더 작은 것으로 생각된다.
Shoji 등16)은 자궁경부암종에서 세포고사는 세포악성도와 밀접한 연관성이 있다고 보고하였으며, Leoncini 등19)도 비호즈킨병에서 세포악성도가 높을수록 고사체가 많이 발견된다고 보고하였다. 그러나 Oh 등20)은 두경부암에서 상반되는 결과를 보고하였으며, 저자들의 연구에서도 통계학적으로 유의하게 종양세포의 분화도가 좋을수록 고사체가 더 많이 관찰되었다. 또한 종양세포 악성도의 지표로 생각되는 PCNA 발현율과는 상반되는 결과를 얻었다. 이는 두경부암의 생물학적 특성이 서로 달라 종양의 악성도에 따라 그 결과가 다르게 나온 것으로 생각된다. 세포분화도가 좋을수록 고사체수가 더 많이 관찰되는 이유는, 종양조직에서 유전자의 손상이 있다고 하나 분화도가 좋은 경우에 보다 적은 유전자의 변화가 있을 것이고, 세포고사와 같은 유전자에 의한 생리적, 능동적 세포행태도 더 잘 보존되기 때문인 것으로 생각된다.
결론
이상의 결과를 요약하면 HPV type 16, 18, p53 유전자 및 세포고사과정의 이상은 후두편평세포암의 다단계 발암기전에 관여할 것으로 생각된다. 후두편평세포암에서 세포고사는 HPV 및 p53 단백 발현보다는 종양세포의 분화도와 밀접한 연관성이 있을 것으로 생각되고, 세포분화도가 나쁘면 세포고사가 적어서 암의 크기가 급격히 증가될 수 있을 것으로 생각된다. 향후 세포고사를 조절하는 보다 많은 유전자에 대한 연구가 필요할 것으로 생각되며, 이러한 연구를 통하여 발암기전의 규명, 암의 치료 및 예후판정에도 많은 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.
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