서     론

   두경부암은 인간의 상부 호흡 소화관 및 경부에 흔히 발생하는 암으로, 후두암은 전체 두경부암의 25%를 차지하며 90% 이상이 편평세포암종에 해당된다.¹⁾ 전세계적으로 발병률이 년간 50만 건에 이르고 있으며, 지나친 흡연과 만성적인 음주가 발병의 주원인이고, 아직까지 이 질병에 관한 분자적 변화를 정확히 설명할 수 없으나, 최근 수많은 유전적인 변화들이 발병 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 특히 두경부암에서는 3p, 9p, 11q, 13q 및 17p 부위같은 여러 염색체에서 이형접합성 상실(loss of heterozygosity, LOH)이 빈번하게 나타난다.²⁾
   암 발생에 관여하는 유전인자에는 암유전자(oncogene)와 종양억제유전자(tumor suppressor gene)가 있다. 이중 종양억제유전자는 정상 세포 성장에 있어 negative regulator로 작용하여 neoplastic phenotype을 억제한다. 종양억제유전자의 돌연변이는 유전자 산물의 기능 소실을 초래하고 이에 따라 세포의 증식 및 성장을 억제하는 기능이 상실되어 malignant transformation으로 진행된다고 한다.³⁾ 두경부암에서 많은 유전적 변화를 보인 염색체와 관련된 종양억제유전자로서 p53, Rb, p16 등을 들 수 있다. 이 유전자들은 cyclin-dependent kinase(CDK)의 억제 작용에 직접·간접적으로 작용하여 세포의 주기 조절에 관여한다.⁴⁾ p53의 경우는 염색체 17p13에 위치하여 세포 주기와 세포고사 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. p53과 더불어 종양억제유전자 산물로 잘 알려진 Rb 단백질은 13q14에 위치하며, G1/S 단계에서 세포주기를 조절한다. 이 Rb 단백질은 여러 세포주기 조절자들에 의해서 상태가 조절되며,⁵⁾ CDK 저해자인 p16과 Rb는 암형성을 촉진하는 세포 성장을 억제한다. p16은 염색체 9p21 부위에 위치하며, 여러 종류의 암에서 이 부위에서 결실이 일어나는 것을 자주 볼 수 있다. 두경부암에서 p16의 종양억제유전자로서의 역할은 명확하게 알려져 있지 않지만, 두경부암 발생 과정에 관여하는 것으로 생각되어져 왔다.
   최근 Ohta 등⁶⁾의 클로닝을 통해 염색체 3p14.2에 위치하는 종양억제유전자인 Fragile Histidine Triad(FHIT)가 확인되었는데 FHIT 단백질은 histidine triad(HIT) 가족의 일원으로서, in vitro상에서 Ap₃A(diadenosine triphosphate) hydrolase로서 작용하는 것으로 알려졌다.⁷⁾ 또한 Sipra-shvili 등⁸⁾에 의한 무흉선 nude mice에 이식된 사람 암세포에서, FHIT 단백질이 암 발생을 억제한 것으로 암 억제 기능이 증명되었고, 이러한 FHIT의 암 억제 활성은 FHIT·Ap 3A 복합체와 관련이 있는 것으로 생각된다.⁹⁾ 그러나 아직까지 FHIT의 활성에 관한 세포 기전과 FHIT의 활성과 암과의 관련은 아직 명확하지 않다.
   본 연구에서는 FHIT 유전자 위치인 3p14, p16 유전자 위치인 9p21, p53 유전자 위치인 17p13 및 Rb 유전자 위치인 13q14의 4개의 종양억제유전자 위치에서 이형 접합성 상실을 살펴보아, 후두 편평 세포암종에서의 이들 암 억제 유전자들이 암 발생 과정에 어느 정도 영향이 있는지를 관찰하고, 최근 부각되어지고 있는 FHIT 유전자의 후두 편평세포암종에서의 불활성화 기전을 알아보기 위해 FHIT 유전자의 단백질 발현 부위인 exon 5~9를 polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism(PCR-SSCP)와 염기서열 분석을 통해 각 exon의 결실과 변이를 관찰하였다.

재료 및 방법

재  료

   본 연구에서는 후두 편평세포암종으로 진단받은 환자 20명의 표본 제작된 암 조직 slide를 재료로 사용하였다. 대상 환자의 남녀비는 16：4이었으며, 연령분포는 50세부터 71세로 평균 연령은 61세였다. 환자의 흡연 과거력이 있는 경우는 16명이었다(Table 1).

방  법

DNA 분리
   2회의 xylene과 2회의 100% ethanol 처리로 파라핀을 제거한 slide로부터 정상조직과 70%이상의 암조직을 현미경 하에서 바늘을 사용하여 긁어내어 각 eppendorf 시험관에 담고, proteinase K용액(50 mM Tris[pH 8.5], 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20, 200 μg/ml proteinase K)을 50~100μl 넣어서 55°C에서 밤새동안 반응시킨 다음, 100°C에서 15분동안 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 동량의 phenol/chloroform/isoamylalcohol(25：24：1)을 넣어 원심 분리시켜 상층액을 취하여 0.1배의 3M sodium acetate(pH5.2)와 2배의 100% 에탄올을 넣어 ­20°C에 하룻밤동안 방치해두었다. 원심 분리하여 얻은 DNA 침전물을 증류수로 녹인 다음 PCR에 사용하였다.

종양억제유전자 FHIT, p16, Rb, p53의 이형 접합성 상실 분석

극소위성 표지자에서의 이형 접합성 상실 분석

극소위성 표지자 및 primer
   이형 접합성 상실을 분석하기 위한 표지자로 FHIT 유전자의 경우에는 염색체 3p14부근에 있는 D3S1285, D3S1481를, p16 유전자의 경우엔 9p21 부근에 있는 D9S171을 선택하여 사용하였다. Primer는 Research Genetics에서 제시한 염기서열을 인용하여 합성한 것을 사용하였다(Bioneer Corp. Korea).
극소위성 분석
   PCR은 100 ng의 template DNA, 1×PCR 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.3 at 25°C；50 mM KCl；1.5 mM MgCl 2), 1 unit Taq polymerase^®(Takara Shuzo Corp., Shiga, Japan), 20 mM 각 dNTP, 각 해당하는 10 pmol의 sense 및 antisense primer를 최종 반응 부피 50 μl가 되게 혼합한 후 GeneAmp PCR System 9600(Perkin Elmer Corp., Norwalk, U.S.A.)을 사용하여 반응시켰다. 반응조건은 94°C에서 3분 동안 변성시키고, 94°C에서 1분간 denaturation 단계, D3S1285와 D9S171은 55°C, 1분, 그리고 D3S1481은 42°C, 1분간 annealing 단계, 72°C에서 1분간 extension 단계를 주기로 하여 35회 반복 시행시킨 후 72°C에서 7분 동안 extension 반응을 추가로 시켰다. 8% non-denaturing acrylamide gel에 PCR 산물 10 μl를 250V로 15시간동안 전기 영동한 후, 은 염색으로 발색하여 band를 분석하였다. band의 분석으로 대립유전자 결실(allelic deletion)은 정상 DNA에서 나타난 band 강도와 비교해서, band가 나타나지 않았거나 육안적으로 강도가 감소된 것을 기준으로 하였다.

Variable number of tandem repeat(VNTR)에 의한 이형 접합성 상실 분석

Rb 유전자의 분석
   Rb(13q14)의 intron 20에 있는 VNTR 부위를 사용하였다. Primer 염기서열은 upstream：5'-CTCCTCCCTACTTACTTGT-3'과 downstream：5'-AATTAACAAGGTGTGGTGG-3'이다.
p53 유전자의 분석
   p53 유전자 부위(17p13)에서 대립인자의 손실을 감지하기 위해, p53 유전자의 intron 1에 위치하는 100bp VNTR marker를 PCR을 사용하였다. VNTR 대립인자들은 PCR 산물의 크기 차이에 의해 결정된다. 여러 대립인자들이 “AAAAT”의 서열의 반복 횟수에 따라 달라진 최종 길이에 따라 정해진다. 이 부위를 seminested PCR을 다음과 같이 행하였다. 3-10 μl의 genomic DNA, 5 μl의 10×PCR 반응 완충액, 20pmol의 각각의 primer(upstream：5'-AAGAGCTGAGACTCCGTCTCAAAAT-3', downstream：5'-TGCCAAATTTGTCATCAGATTTGCTA-3'), 2 μl Taq polymerase^®를 최종 부피 50 μl되게 하였다. PCR 증폭 크기는 567 bp로 반응은 다음과 같이 행하였다. 91°C에서 400 초를 행하고 65°C에서 90초, 72°C에서 90초, 91°C에서 90초를 주기로 30회 반복 시행한 후, 65°C에서 2 분, 72°C에서 400 초를 시행하였다. PCR의 특이성을 조절하기 위해, p53 유전자의 intron 1에 있는 100 bp 부위를 5'-ACAAAACATCCCCTACCAAACAGC-3' 서열의 primer를 첨가하여 seminested PCR을 행하였다. 1차 PCR 반응물을 1：10으로 희석하여 2차 PCR에 첨가하고 새로 첨가한 primer에 대한 annealing 온도는 66°C이며, PCR 산물은 8% non-denaturing acrylamide gel에 PCR 산물 10 μl를 250V로 15시간동안 전기 영동한 후, 은 염색으로 발색하여 band를 분석하였다.

Restriction fragment length polymorphism(RFLP)에 의한 이형 접합성 상실 분석

Rb/ Xba I RFLP
   Rb(13q14) 유전자의 intron 17에 있는 Xba I 다형성을 분석하였다. Xba I 인식 부위는 exon 17의 downstream 21.8 kb 근처에 있으며, primer 서열은 5'-TTCCAATGAAGAACAAATGG-3'와 5'-GGAAT TGCACAATCCAAGTT-3'이다. PCR은 template DNA, 1X PCR 완충액(10mM Tris-HCl pH 8.3 at 25°C；50mM KCl；2mM MgCl 2), 1 unit Taq polymerase^® 20 mM 각 dNTP, 각 해당하는 20pmol의 sense 및 antisense primer를 최종 반응 부피 50 μl가 되게 혼합한 후 GeneAmp PCR System 9600을 사용하여 반응시켰다. 반응조건은 94°C에서 5분 동안 변성시키고, 94°C에서 1분간 denaturation 단계, 50°C에서 1분간 annealing 단계, 72°C에서 1분간 extension 단계를 주기로 하여 35회 반복 시행시킨 후 72°C에서 7분 동안 extension 반응을 추가로 시켰다. 증폭시킨 PCR 산물을 Xba I으로 밤새동안 반응시킨 후, 2% agarose gel에 전기 영동시켜 대립 유전자(allele)를 확인하였다. 대립 유전자에는 A1(945 bp), A2(630 bp과 315 bp)이 있으며, A1만 혹은 A2만 gel상에 나타나는 경우를 동형 접합적(homozygous)이라 하고, A1과 A2가 동시에 보이는 경우를 이형 접합적(heterozygous)이라 하였다.
p53/Acc II RFLP
p53(17p13) 유전자의 exon 4에 위치한 Acc II RFLP 부위를 사용하였다. Exon 4/Acc II RFLP primer는 5'-CT TGCCCTCAACAAGATGTT-3'와 5'-TTGGGCAGTGCTAGGAAAGA-3'이고, PCR은 template DNA, 1X PCR 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.3 at 25°C；50 mM KCl；2 mM MgCl₂), 1 unit Taq polymerase^® 20 mM 각 dNTP, 각 해당하는 20 pmol의 sense 및 antisense primer를 최종 반응 부피 50 μl가 되게 혼합한 후 GeneAmp PCR System 9600을 사용하여 반응시켰다. 반응조건은 94°C에서 5분 동안 변성시키고, 94°C에서 1분간 denaturation 단계, 62°C에서 1분간 annealing 단계, 72°C에서 1분간 extension 단계를 주기로 하여 35회 반복 시행시킨 후 72°C에서 7분 동안 extension 반응을 추가로 시켰다. 증폭시킨 PCR 산물을 Acc II로 밤새동안 반응시킨 후, 2% agarose gel에 전기 영동시켜 대립유전자를 확인하였다. 대립유전자의 종류는 A1(296 bp), A2(169 bp와 127 bp)가 있으며, Rb/Xba I RFLP에서와 같은 방식으로 동형 접합적인 경우와 이형 접합적인 경우를 구분하여 이형 접합적인 경우만을 이형 접합성 상실 분석에 사용하였다.

FHIT 유전자의 Exon-특이적 PCR에 의한 결실 및 변이 분석
   FHIT 유전자의 유전자 상에서의 결실과 변화를 보기 위하여, FHIT 유전자의 exon 5-9에 해당하는 부위를 Druck 등¹⁰⁾에 의한 방법에 의해 PCR-SSCP를 행하였다. 그에 해당되는 염기 서열은 다음과 같다(Table 2). PCR 산물 5 μl에 loading dye(95% foramide, EDTA 20mM, 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol) 5 μl를 첨가하여 100°C에서 5분간 변성시킨 후 재빨리 얼음에 넣어 반응산물을 처리하였다. 5×TBE(44.5 mM Tris-borate；44.5 mM boric acid；1 mM EDTA), 10% acrylamide 용액을 섞은 후 0.45 μm filter를 사용하여 여과한 다음 10% ammonium persulfate 400 μl와 TEMED 40 μl을 넣어 만든 gel에, 처리한 산물을 10 μl씩 4°C에서 30W로 3~4시간동안 전기 영동시킨 후, 은 염색으로 발색시켜 band를 관찰하였다.
   PCR-SSCP에서 band를 감지할 수 없을 때는 ERCC I 유전자의 exon 4(5'-CAGAGGGGCAATCCCGTACT-3'와 5'-GCAGAGCTCACCTGAGGAAC-3'；118 bp) primer와 함께 PCR을 다시 행하였다. Exon 9인 경우는 β-globin(5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3'와 5'GAAGAGCCAAGGACAG GTAC-3')을 사용하여 PCR을 하였다. PCR 조건은 94°C에서 30초, 57°C에서 30초, 72°C에서 1분을 주기로 30회 행한 후, agarose gel 상에서 ethidium bromide로 염색하여 UV하에 관찰하였다. 이러한 multiplex 반응은 PCR 산물의 부재가 PCR 반응의 실패가 아닌, 결실(deletion)에 의한 것임을 확인하고자 함이다. SSCP 상에서 보이는 정상조직에서 보이는 band와 다른 band는 잘라내어 PCR product direct sequencing kit(USB, Cleveland, U.S.A.)을 사용하여 염기 서열 반응을 시행하여 염기서열의 변화 여부를 확인하였다.

FHIT 유전자의 염기 서열 결정
   PCR 산물의 5 μl를 1.5 ml tube에 exonuclease 1 μl(10unit/μl), shrimp alkaline phosphatase 1 μl(2unit/μl) 넣은 후 37°C에서 15분간 반응시켜 과량의 primer와 dNTP를 제거한 후 80°C에서 15분간 반응시켜 효소를 불활성화시켰다. 전처리된 PCR산물 5 μl, primer(10 pmol/μl) 1 μl, 증류수 4 μl를 혼합하여 100°C에서 2분간 가열 후 얼음물에 5분간 식히는 annealing reaction후 얼음 속에 보관하였다. 표본 하나 당 4개의 1.5 ml를 만들어 G, A, T, C를 표시한 후 각각의 tube에 termination mix[ddG termination mix(80 μM dNTP, 8 μM ddGTP, 50 mM NaCl)] 2.5 μl를 넣은 후 37 °C에 두었다. Annealing시킨 templateprimer 혼합액에 0.1M DTT 1 μl, 1：5로 희석한 labeling mix 2 μl, (α- ³⁵S)dATP(10 μM) 0.5 μl, 반응 완충액 2 μl, sequenase 2 μl를 섞어 상온에서 2분간 반응시킨 후 3.5 μl씩 각각의 termination mix에 분주하여 37°C에서 5분간 반응 후 정지용액 4 μl를 넣어 반응을 정지시켰다. 20X glycerol tolerant gel buffer(Tris base 216 g, Taurine 72 g, Na₂EDTA·2H₂O/1 ℓ) 4 ml, acrylamide 38 g, NN-methylenebisacrylamide 2 g으로 만든 40% 용액 12 ml, urea 40 g을 녹여 80 ml의 gel을 만들고 0.45 μm filter를 사용하여 여과한 다음 10% ammonium persulfate 400 μl와 TEMED 40 μl을 넣어 gel을 만들었다.
   반응이 끝난 표본을 100°C에서 2분간 변성을 시켜 3.5㎕씩 gel에 분주한 다음 1500 V, 55 W, 35 A로 2시간 전기영동을 하였다. 전기영동이 끝난 gel은 gel dryer로 옮겨 80°C에서 2시간 건조시킨 후 필름을 덮어 상온에서 48시간 지난 후 X-ray을 현상하여 관찰하였다.

결     과

이형 접합성의 상실 분석
   FHIT의 경우, D3S1285에서는 이형 접합적인 경우 12명중에서 상실을 보인 경우가 1명으로 8%의 이형 접합성 상실을 보였으며, D3S1481에서는 이형 접합성 상실을 보이지 않았다. 그리고, p16의 경우, D9S171에서는 이형 접합적인 경우 11명중에서 상실을 보인 경우가 2명으로 18%의 상실을 보였다(Table 1, Figs. 1 and 2). p53 Acc II RFLP에서는 이형 접합적인 경우 7명중에서 상실을 보인 경우가 1명으로 14%의 이형 접합성 상실을 보였고, Rb Xba I RFLP에서는 이형 접합적인 경우가 1명이었으며 이 1명에서 이형 접합성 상실을 보여 100%의 빈도를 보였으나 1명밖에 되지 않아 다른 결과와 비교해석은 어려웠다. p53 VNTR 에서는 이형 접합적인 경우 9명중에서 상실을 보인 경우가 2명으로 22%, Rb VNTR에서는 이형 접합적인 경우 6명중에서 상실을 보인 경우가 1명으로 17%의 이형 접합성 상실을 나타냈다(Table 1, Figs. 3 and 4).
   4개의 종양억제유전자 위치에서 이형 접합성 상실을 보이는 경우는 모두 흡연자였지만 통계적 의의는 없었다.

FHIT 유전자 exon-특이적인 PCR 및 염기서열 분석

   후두 편평세포암종 환자를 대상으로 FHIT 유전자 각 exon 5, 6, 7, 8, 9에 대해 intronexon 주변부에 위치하는 primer set를 가지고 PCR로 증폭시켜서 FHIT coding region에 동형 접합성 결실(homozygous deletion)과 점돌연변이(point mutation)가 있는지를 보았다. PCR로 증폭한 결과 동형 접합성 결실은 볼 수 없었으며, PCR 산물을 SSCP 분석으로 돌연변이를 본 결과, 13번과 19번 환자에서 정상과 다른 band를 볼 수 있었다(Fig. 5). 이 band를 용출(elution)하여 염기서열 분석을 실시한 결과, 2례 모두에서 동일하게 exon 8의 nucleotide 656의 codon 98에서 T→C로 바뀌었으나 아미노산(histidine)에는 영향을 미치지 않는 잠재적인 치환(silent substitution)임을 알 수 있었다(Fig. 5). 이렇게 FHIT 유전자의 잠재적인 치환을 보이는 2례 모두 이형 접합성 상실을 보이지 않는 경우였다.

고     찰

   암질환에서 나타나는 변화들 중 가장 주목할 만한 것은, 염색체 상에서 빈번하게 나타나는 이형 접합성 상실이다. 암세포에서 나타나는 특정 부위의 유전자 결손은 부모로부터 유전된 한 쪽 대립 유전자의 변이에 이어서 다른 한 쪽의 정상적인 대립 유전자가 상실되어, 그 유전자가 기능을 제대로 발휘하지 못하여 암으로 발전하게 된다는 새로운 암 발생에 대한 패러다임을 제시하였고,¹¹⁾ 암을 억제하는 기능을 갖는 유전자의 존재를 인식시켰다. 두경부암에서 유전자 결손이 빈번하게 일어나는 부위는 특히 염색체 3p, 9p, 11q, 13q 및 17p로 보고되었으며,²⁾ 이러한 부위와 연관된 종양억제유전자들이 두경부암 발생에 관여될 것으로 생각되어져 왔다. 두경부암에서 많은 유전적 변화를 보인 염색체와 관련된 종양억제유전자로서 p16, Rb, p53 등을 들 수 있다. 이 유전자들은 CDK의 억제 작용에 직접·간접적으로 작용하여 세포의 주기 조절에 관여를 한다.⁴⁾
   최근 Erber 등¹²⁾의 연구에 의하면 p53과 DNA에 접촉하는 부위에 돌연변이가 생기면 이형 접합성 상실이 생기도록 선택적으로 작용하며, 이는 두경부암 진행 과정을 과속화하여 치료 효과를 감소시키는 역할을 한다고 하였다. 즉 이형 접합성 상실이 암 발생 과정에 있어서 중요하게 작용한다는 점을 간접적으로 언급하고 있다. 두경부암에서는 p53과 Rb 부근에서의 유전적 변화가 각각 38%, 37%로 나타나며, 이러한 변화는 낮은 생존률과 관련이 있으며 둘 다 이상이 생길 경우, 암이 침습되기 쉬우며 불량한 예후 지표로 사용될 수 있다고 보고된 바 있다.¹³⁾
   본 연구에서 p53과 Rb에 대해서는 RFLP와 VNTR 분석을, p16에 대해서는 극소위성 표지자인 D9S171를, FHIT에 대해서는 극소위성 표지자인 D3S1285와 D3S1481를 사용하여 분석한 결과 p53, Rb, p16, FHIT 순서로 유전자 변화를 관찰할 수 있었다.
   두경부암에서 빈번한 변화 부위 중 하나가 염색체 3p 부위이며 이 부위와 연관된 종양억제유전자로 Von Hippel-Lindau(VHL) 유전자를 들 수 있는데 이 유전자는 특발성 신장암에서는 상당히 불활성화되나 폐암이나 두경부암 같은 다른 암에서는 변이가 거의 없는 것으로 보고되었다. 그러므로 3p와 관련된 또 다른 유력한 종양억제유전자로 부각된 것이 최근 Ohta 등⁶⁾에 의해 클로닝된 FHIT유전자이다. FHIT는 특정한 독성 물질에 노출되었을 때, genome내에 간격이 생기는 부위, 즉 깨지기 쉬운 부위인 FRA3B내에 위치하며,¹⁴⁾ 가족성 신장암과 관련된 t(3；8) 전좌(translocation) 부위를 포함하고 있다.¹⁵⁾ 또한 여러 종류의 암에서 관찰되는 3p 대립유전자의 상실(allelic loss)이 FRA3B/ FHIT부위에서 일어나는 것으로 보고되었다.¹⁶⁾ 폐암의 경우, 흡연과 FHIT유전자 결실이 밀접한 관련이 있었으며, 폐암 발생 과정에서 이 FHIT 유전자의 관여가 입증되었다.¹⁷⁾ 이 밖에도 위장암, Merkel 세포암 같은 암에서도 FHIT 유전자의 변화가 자주 관찰되었다.⁶⁾ 이러한 비정상적인 전사체들은 exon 부위가 결실되거나 삽입, 혹은 결실과 삽입이 같이 일어남으로써 생긴 결과로 현재까지 많은 종류의 암에서 비정상적인 FHIT 전사체가 발견되었으나, 대장암이나 식도암같은 위장성 암에서는 완전한 정상적인 FHIT 서열과 전사체가 관찰된 바와 같이 이러한 위장성 암에서는 FHIT의 역할이 예상외로 작거나 다른 불활성 기전에 의해 암이 발생할 것으로 보고 있다. 물론 Virgilio 등¹⁸⁾에 의한 두경부암 세포주에서 보인 결과에서 FHIT가 두경부암 발생 과정에 있어 중요한 역할을 할 것으로 주장하고 있으나, 실제 두경부암에 있어서의 그 역할이 명확하게 규명되지 않았다. 그러므로 본 연구에서는 두경부암 중 후두암에서 FHIT 유전자의 불활성화 기전을 살펴보기 위해 SSCP와 염기서열 분석을 통해 DNA 수준에서 FHIT 유전자 exon 부위의 결실 여부와 변이를 관찰하였다.
   보통 종양억제유전자의 불활성은 두 가지 방식으로 일어날 수 있다.¹¹⁾ 즉 그 발현이 양적으로 변경되거나 과오돌연변이(missense mutation)나 nonsense mutation 등에 의한 단백질의 기능이나 구조에 영향을 미치는 질적인 변경이 일어날 수 있다. 본 연구에서는 FHIT 유전자의 genomic DNA상에서의 결실 여부와 변이를 각 exon별 primer를 사용하여 SSCP와 염기서열 분석을 통해 관찰한 결과, 2례에서 exon 8 내의 codon 98에서 염기 치환(CAT→CAC)이 일어났으며 Druck 등¹⁰⁾과 Mao 등¹⁹⁾이 두경부 편평세포암 세포주에서 실험한 결과와도 일치한다. 이러한 염기의 치환은 FHIT단백질의 구조나 기능에 영향을 미치지 않는 잠재적인 치환(silent substitution)이다. 구강암의 경우, 구강 편평세포암종 뿐만 아니라 전암성 병변에서도 염색체 3p의 이형 접합성 상실을 보여주어 임상적인 종양 표지자로 제시하기도 하였고,²⁰⁾ 구강 편평세포암주에서 55%의 FHIT의 이상이 나타나고 65%의 FHIT 이형 접합성 상실을 나타낸 바 있지만¹⁸⁾ 본 연구에서는 FHIT의 이형 접합성 상실율도 가장 낮았고, DNA 수준의 변화도 단백질의 구조나 기능에 영향을 미치지 않는 잠재적인 치환임을 볼 때, 후두의 편평 세포암 발암 과정에서는 FHIT의 역할이 적을 것으로 생각된다.
   본 연구의 결과에서 p53에서 이형 접합성 상실이 나타난 경우에는 Rb에서 이형 접합성 상실이 나타나지 않았고, Rb에서 이형 접합성 상실이 나타난 경우에는 p53에서 이형 접합성 상실이 나타나지 않은 것으로 보아 두 종양억제유전자가 상호 보완적일 가능성이 있고 이와는 달리 FHIT에서 이형 접합성 상실이 나타난 경우, p53에서도 이형 접합성 상실이 나타났음을 볼 때, FHIT의 암 억제 기전은 p53이나 Rb와는 다르다는 것을 추정할 수 있다. 따라서 FHIT 단백질의 세포 내에서의 생물학적 기전이 더욱 연구되어야겠다.

결     론

   후두 편평세포암종에서 종양억제유전자의 변화를 본 결과, p53, Rb, p16과 FHIT유전자 순서로 유전적 변화를 관찰할 수 있었으나 통계적 의의는 없었다. 또한 FHIT유전자에서 DNA 수준의 변화도 단백질의 구조나 기능에 영향을 미치지 않는 잠재적인 치환임을 볼 때, 후두 편평세포암종의 발암 과정에서 FHIT의 역할은 크지 않을 것으로 생각된다.

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