교신저자：지장훈, 134-701 서울 강동구 길1동 445 한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
                  전화：(02) 2224-2448 · 전송：(02) 482-2279 · E-mail：jhcent@orgio.net 

서     론

   진주종성 중이염은 주변의 측두골을 파괴하는 특징이 있는데, 이 골파괴 과정은 주로 오랜 기간에 걸쳐서 서서히 진행하지만 진주종이 갑작스럽게 성장하면서 유발되는 경우도 있다. 진주종의 골파괴는 진주종 자체에 의한 기계적인 골파괴와 여러 분해 효소에 의한 생화학적인 골파괴로 나뉘며, 이 과정에 관여하는 여러 효소와 cytokine 들이 알려져 있다.^1)2)3)4)
   Matrix metalloproteinase(이하 MMP)는 세포외 기질을 분해하는 매우 중요한 효소로서 현재까지 약 20종이 알려져 있다.⁵⁾ 그 중에서도 collagen을 분해하는 효소는 MMP-1, 8, 13의 3가지가 알려져 있는데, 특히 MMP-13(Collagenase-3)은 연골 및 골흡수작용이 강하고, 최근에는 두경부의 편평상피세포암에서 종양의 침습도를 나타낸다는 보고도 있다.³⁾⁶⁾ 특히 진주종에 의한 골파괴와 MMP와의 관계에 대해서는 몇건의 보고가 있어서 MMP-1, 8의 경우에는 진주종과 육아조직에서 피부보다 분포와 활성도가 강함을 증명하였으나,¹⁾⁷⁾ 아직 MMP-13(Collagenase-3)과 진주종의 골조직 파괴에 관한 상관관계에 대한 발표는 없었다. 이에 저자들은 중이 수술 시에 획득한 중이 진주종 조직과 중이 육아조직, 정상 중이점막조직 및 외이도 피부조직을 이용하여 면역화학적 염색을 시행하여 MMP-13이 중이진주종에서 발현되는 여부를 확인하고 향 후 진주종에 의한 골파괴 과정을 밝히는 기초가 되고자 하여 본 실험을 계획하였다.

방     법

   중이수술시에 중이 진주종조직, 중이 육아조직, 정상 중이점막조직, 정상 외이도 피부조직을 각각 5개씩 획득하여 10% buffered neutral formalin에 1일간 고정한 후에 파라핀에 포매하였다. 특히 정상 중이점막조직은 myringoplasty를 시행시에 획득하였으며, 고막과 중이의 유착을 방지하기 위하여 하고실 점막을 채취했다. 각 조직을 Silanecoated slide(DAKO Co., Carpinteria, USA)에 붙이고, 56°C 보온기에서 30분간 처리하여 xylene으로 2회 탈파라핀화 시킨 뒤 100%, 90%, 80%, 70% 알콜로 각 3분간 처리하고 증류수로 함수 시켰다. 10 mM citrate buffer에 조직절편을 담근 후 약 10분 정도 3회 반복하여 microwave oven에서 끓인 다음 citrate buffer에서 약 20분 정도 식혔다. 조직내의 내인성 과산화 효소의 활성을 억제시키기 위하여 3% 과산화수소와 무수알코올이 1：9의 비율로 혼합된 용액에 20분간 처리하였다. 조직내의 비특이적 항원 항체 반응을 억제하기 위하여 조직을 정상 혈청에 30분간 처리한 후, monoclonal Anti-MMP-13 Antibody(Oncogene, Cambridge, USA)로 37도에서 약 2시간동안 반응시킨 후, biotin이 결합된 2차항체로 약 30분간 반응시키고, TBS로 씻고 Streptavidin-peroxidase(DAKO Co., Carpinteria, USA)로 실온에서 약 10분간 반응시켰다. 발색제인 DAB(DAKO Co., Carpinteria, USA)로 약 5분간 반응시키고, Hematoxyline으로 약 3분간 대조염색을 시행한 후, Semisynthetic crystal mount(DAKO Co., Carpinteria, USA)로 mounting한 후, cover glass로 덮어서 광학현미경으로 관찰하였다. 각 과정의 사이에는 Tris buffer saline(10 mM, pH 7.5, Sigma chemical Co., St. Louis, USA)을 사용하여 씻었다.
   양성대조군으로는 이미 본 교실에서 실험하여 MMP-13의 발현이 강하게 증명된 편도선 악성종양 조직⁸⁾을 사용하였으며, 음성대조군으로는 1차 항체 대신에 mouse serum을 사용하였다.

결     과

   중이 진주종 조직은 anti-MMP-13에 대해 5예 전부에서 강한 발현을 보였으며, 진주종 상피층의 전층에 걸쳐서 비교적 고른 분포를 보였지만 기저층에서 약간 더 강한 염색상을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 중이 육아조직은 5예중 2예에서만 발현을 보였고 그 발현의 정도는 진주종의 경우보다 약했으며 전반적으로 퍼져 있었고(Fig. 2), 나머지 3예에서는 전혀 발현되지 않았다. 정상 중이 점막과 외이도 피부 조직에서는 전례에서 발현되지 않았다(Figs. 3 and 4).

고     찰

   중이 진주종은 골주직을 흡수하고 파괴함으로써 계속적으로 진행하는 특징이 있다. 이러한 중이 진주종의 골조직 파괴는 크게 기계적인 골파괴와 생화학적인 골파괴로 나뉜다. 기계적인 골파괴는 keratin debris들이 모여서 주위의 골조직을 압박하여 혈액공급에 장애를 유발하여 골조직의 파괴를 유발한다고 알려져 있으며, 생화학적인 골파괴는 진주종의 상피에서 여러가지 단백분해효소들이 분비되어서 골조직을 파괴하고, 이 과정에는 Tumor necrosis factor(TNF)-α, Transforming growth factor(TGF)-β1과 β2, Interleukin(IL)-1과 6, Parathyroid hormone related peptide(PTH-rP), Fibroblast growth factor(FGF) 등 여러 cytokine들이 관련되어 있다고 알려져 있다.^1)2)3)4)
    Matrix metalloproteinase(이하 MMP)는 zinc-dependent endopeptidases family에 속하며 세포외 기질의 구조성분을 분해하는 효소로 1962년 올챙이 꼬리가 소실되는 과정에서 발견된 이후 계속적으로 발견되어, 현재는 약 20 종의 MMP가 존재하는 것으로 알려져 있으며,⁵⁾⁹⁾ 특히 우리 몸에서 세포외 기질을 분해하는 단백분해효소에서 매우 중요한 비중을 차지하는 효소이다.^1)2)7)9)10) 그 기능은 주로 고형암의 전이나 침윤에 관여하는 것으로 알려졌으나, 정상인에서도 인체내 정상 remodeling 과정에 관여하며 태생기 성장, 조직재생, 혈관형성, 골재생 및 유방퇴축과 같은 생리적인 작용과 관절염, 치주염, 피부 자가면역성 수포성 질환이나 다발성경화증 등의 비종양성 질환의 병인에도 관여함이 확인되었다.^1)9)10) 이러한 일련의 MMP군은 세포의 기질성분중에서 적어도 한가지 이상을 분해시키며, 아연이온과 결합하는 HEXGH motif를 함유하는 catalytic domain을 공유하므로 chelating agent에 의해서 단백분해기능이 억제되고, 비활성형의 zymogen으로 분비되어 aminoterminal이 분리되는 활성화 과정을 거쳐서 단백분해기능을 가지며, Tissue inhibitor of MMP(TIMP)에 의해서 그 기능이 억제되는 특징이 있다.⁹⁾¹¹⁾
   MMP는 기질의 특이성, 억제제의 결합부위, 세포막에서의 존재부위에 따라서 fibrillar collagen을 분해하는 Collagenase, proteoglycan과 glycoprotein을 분해하는 Stromelysin, nonfibrillar denatured collagen(gelatin)을 분해하는 Gelatinase, 그리고 기질을 분해하는 Matrilysin 등 크게 4가지 군으로 나뉜다.⁹⁾ 그 중에서도 골조직 단백질의 90%를 이루는 제1형 및 2형 콜라겐을 분해할 수 있는 것은 Collagnease로, MMP-1, 8, 13 등의 3 종류가 알려져 있으며, 이를 각각 Collagenase(Collagenase-1), Neutrophil collagenase(Collagenase-2), Collagenase-3라고도 한다. 상기한 효소들은 골조직 콜라겐의 3중 나선구조를 가수분해함으로써 콜라겐을 분해하는 작용을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁾ MMP-1은 특정 자극에 의해서 keratinocyte 또는 여러 결체조직 세포에서 새로 생성된 후, 바로 분비되어 세포 밖에서 활성형인 42 KDa 또는 glycosylated 46 KDa의 형태로 작용을 하며, MMP-8은 골수에서 호산구가 성숙되는 과정에서 생성되며 호산구내에서 과립의 형태로 저장되어 있다가 호산구가 자극을 받으면 탈과립화되어 작용을 한다.¹⁾
   MMP-13은 transformed epidermal keratinocyte에서 생성되어 세포막에 결합되어 있는 상태로 존재하다가 특정자극에 의해서 활성화되는 것으로 알려져 있다.³⁾⁶⁾⁹⁾ MMP-13은 유방암세포에서 처음 발견된 이래 두경부의 편평세포암과 연골육종(chondrosarcoma)에서 강하게 발현되는 것으로 밝혀졌다. 또한 그 작용도 매우 강력하고 광범위해서 모든 fibrillarcollagen 특히 제 2 형 콜라겐을 효과적으로 분해시키며, 연골의 proteoglycan aggrecan, 제 4 형 collagen fibronectin과 tenacin을 포함하는 세포외 기질과 기저막을 분해시키는 것으로 알려져 있다.⁶⁾¹²⁾ 특히 연골육종과 두경부 편평상피암 조직에서 강하게 발현되며, 종양이 퍼져가는 변연부에서 강하게 발현되고 주위의 정상적인 피부와 점막조직에서는 발현이 없음을 보고하여, transformation이 일어난 epidermal keratinocyte, chondrocyte에서 발현이 증가됨을 보고하였다. 이처럼 MMP-13은 종양이 진행될수록 발현 정도가 강하게 나타나므로, 종양의 침습도(invasiveness)를 나타내는 지표로 사용될 수 있다고 보고하고 있다.³⁾⁶⁾ 또한 Vaalamo 등¹³⁾은 위궤양 조직에서 MMP-1은 궤양표면 바로 아래에서, MMP-13은 궤양 bed의 깊은 곳에서 강하게 발현이 되고, 이를 근거로 MMP-1은 재상피화 과정에, MMP-13은 만성적인 염증에서 콜라겐 기질을 remodel하는 과정에 관여한다고 추정하였다. 이러한 MMP-13의 mRNA는 배양된 편평세포암 조직에서 TNF-α, TGF-α 및 β, Keratinocyte Growth Factor(KGF)와 FGF 등에 의해서 발현이 증가됨을 보고하였다.³⁾ 즉 염증세포에서 유발된 TNF-α나 TGF-β1 등이 MMP-13의 발현을 유도하고 결국에는 편평세포암이 주변의 콜라겐을 비롯한 결체조직을 분해함으로써 암종이 주변을 침습해서 성장한다고 하였다.³⁾
   진주종에 의한 골파괴에 있어서 collagenase의 역할에 대하여 Banerjee 등¹⁾¹⁰⁾이 진주종 조직에서 SDS PAGE Zymography를 이용하여 관찰한 바에 따르면 MMP-1은 외이도 피부에서는 발현되지 않았으나 중이 진주종과 육아조직에서 강하게 발현되었으며, MMP-2와 MMP-9은 중이 진주종과 외이도 피부에서 비슷하게 발현이 되었고, Schonermark 등⁷⁾은 면역조직화학적염색 결과 MMP-2, 3, 9는 중이 진주종 상피의 기저층 및 상기저층에 국한되어 나타났고 MMP-8은 중이 진주종 상피층과 육아조직 모두에서 전반적으로 퍼진 형태로 발현되었으며, 이는 MMP에 속하는 여러 효소들이 중이 진주종에 의한 측두골의 염증 및 골파괴에 있어서 활발한 역할을 할 가능성을 시사한다고 하였다.
   본 연구에서는 MMP-13이 정상 외이도 피부와 중이 점막 전례에서 발현되지 않았지만, 중이 육아조직의 경우는 5예중 2예에서만 약하게 발현되었고, 중이 진주종조직의 경우에는 전례에서 강하게 발현되었으며, 특히 세포 활동이 활발한 기저층에서 좀더 강하게 발현되었다. 이는 MMP-13이 염증 등의 병적인 상태에서 증가하며 특히 진주종에 의한 골파괴에 있어서 특정한 역할을 할 가능성을 시사한다고 사료된다. 특히 진주종에서는 이미 언급한 대로 TGF, KGF, EGF와 Interferon 등이 증가하며, 이에 따라 MMP-13이 증가하고 결체조직을 분해하여 주변 골파괴를 유발시킨다고 추론할 수 있다. 이는 MMP-13이 진주종상피의 기저층에서 좀더 강한 발현을 보이는 것으로도 그 설명이 가능하다고 사료된다. 하지만 본 연구에서 시행한 면역조직화학적 염색만으로는 발현된 MMP-13이 활성형인지 비활성형인지를 구분하기는 힘들고, 따라서 이를 보완하기 위해서는 Zymography, Western blotting 등의 방법이 병행될 경우에 진주종의 골파괴 과정에 있어서 MMP-13의 역할을 좀 더 규명할 수 있을 것으로 사료된다. 다른 정상조직과는 달리 염증조직에서 발현이 없거나 약하게 나타나다가 진주종에서 강하게 발현되는 사실은 MMP-13이 중이 진주종에서 골파괴 과정 또는 염증의 진행에 있어서 특정한 역할을 할 가능성을 시사하지만, 정확한 역할을 규명하기 위해서는 좀더 많은 연구가 필요하다고 사료된다.

결     론

   MMP-13은 중이 진주종에서 다른 조직에 비해서 강한 반응을 보였으며, 이는 진주종에 의한 골파괴 시에 MMP-13이 관여할 수 있음을 시사한다.

1. Banerjee AR, James R, Narula AA, Lee RJ. Matrix Metalloproteinase-1 in cholesteatoma, middle ear granulations and deep meatal skin: A comparative analysis. Clin Otolaryngol 1998;3:515-9.

2. Kaharl VM, Johansson N, Grenman R, Airola K, Saarialho-Kere U. Ex-pression of colagenase-3 (MMP-13) by tumor cells in squamous cell carcinomas of the head and neck. Adv Exp Med Biol 1998;451:63-8.

3. Johansson N, Airola K, Grenman R, Kariniemi U, Saarialho-Kere U, Kahari VM. Expression of collagenase-3 (matrix metalloproteinase-13) in squamous cell carcinomas of the head and neck. Am J Pathol 1997;151:499-508.

4. Ahn JM, Huang C-C, Abramson M. Interlekin 1 causing bone destruction in middle ear cholesteatoma. Otolaryngol Head Neck Surg 1990;103:527-36.

5. Chintala SK, Tonn JC, Rao JS. Matrix Metalloproteinases and their biological function in human gliomas. Int J Dev Neurosci 1999;17:495-502.

6. Uria JA, Balbin M, Lopez JM, Alvarez J, Vizoso F, Takigawa M, et al. Collagenase-3 (MMP-13) Expression in Chondrosarcoma Cells and its Regulation by Basic Fibroblast Growth Factor. Am J Pathol 1998;153:91-101.

7. Schonermark M, Mester B, Kempf HG, Blaser J, Tschesche H, Lenarz T. Expression of matrix-metalloproteinases and their inhibitors in human cholesteatomas. Acta Otolaryngol (Stockh) 1996;116:451-6.

8. 노영수·송병철·박준영·김  진. 두경부 편평세포암중에서 MMP-13의 발현과 임상인자와의 상관관계에 대한 연구. Proceedings of the 6th Korean Combined Otolaryngologic Congress;2000 April 21-22: Cheonan, Choongchungnam-Do;2000. p.84-5.

9. 정현철. Matrix Metalloproteinase. 대한생화학·분자생물학회소식 1999;6:17-21.

10. Banerjee AR, James R, Narula AA. Matrix Metalloproteinase-2 and matrix metalloproteinase-9 in cholesteatoma and deep meatal skin. 1998;23:345-7.

11. Woessner JF Jr. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in connective tissue remodeling. FASEB J 1991;5:2145-54.

12. Fosang AJ, Last K, Knauper V, Murphy G, Neame PJ. Degeneration of cartilage aggrecan by collagenase-3 (MMP-13). FEBS Lett 1996;380:17-20.

13. Vaalamo M, Mattila L, Johansson AL, Karjalainen-Lindsberg ML, Kahari VM, Saarialho-Kere U. Distinct populations of stromal cells express collagenase-3 (MMP-13) and collagenase-1 (MMP-1) in chronic ulcers but not in normally healing wounds. J Invest Dermatol 1997;109:96-101.