| Expression of Transforming Growth Factor-Beta(TGF-beta) in Middle Ear Cholesteatoma. |
| Sang Won Yeo, Yong Soo Park, Jin Han Kang, Byung Do Suh |
1Department of Otolaryngology, Pediatrics, Catholic University Medical College, Seoul, Korea.
2Department of Pediatrics, Catholic University Medical College, Seoul, Korea. |
| 중이 진주종에서 Transforming Growth Factor-Beta(TGF-β)의 발현 |
| 여상원1 · 박용수1 · 강진한2 · 서병도1 |
| 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실1;소아과학교실2; |
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| ABSTRACT |
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The role of transforming growth factor-beta(TGF-beta) in the proliferation and progression of the epithelium of middle ear cholesteatoma was studied. We eluciated the site and degree of expression of the TGF-beta mRNA in middle ear choleasteatoma using in situ hybridization method and compared with that in epidermis of external auditory canal skin, cholesterol granuloma and cervical lymph node.
TGF-beta mRNA was intensely expressed in lymphatic cells of cervical lymph nodes while canal skin and cholesterol granuloma did not express TGF-beta mRNA. Expression of TGF-beta mRNA was detected in the basal layer of epithelium of cholesteatoma in 12(83%) and in all layer of epithelium of cholesteatoma in 7(50%) of 14 samples even though it was more intense in the basal layer of epithelium. The results of the present study suggest that TGF-beta may play a role of immunoregulator in a mechanism of epithelial basal cell proliferation in middle ear cholesteatoma. |
| Keywords:
Middle ear cholesteatomaㆍTransforming growth factor-betaㆍIn situ hybridization |
서론
중이 진주종은 중이강과 유양봉소내에 각화된 편평상피(keratinized squamous epithelium)의 이동(migration)을 특징으로 하는 질환으로서 케라틴의 축적과 감염등이 중이진주종을 더욱 진행시키는 것으로 알려져 있다. 진주종에 의한 골파괴는 진주종의 상피와 상피하 육아조직에서의 염증반응에 의해 발생하는 여러가지 효소와 싸이토카인에 의해 유발되기도 한다.2)12)18) 최근 진주종의 상피에서 interleukin 11)2)11)21), epidermal growth factor(EGF)15), interleukin 6와 interleukin 81)등이 관찰되면서 이들 싸이토카인과 성장 인자들이 진주종의 발생과 증식에 중요한 역할을 하고 있음을 시사하고 있다.
Transforming growth factor-beta(TGF-β)는 T림파구, 호중구, 단핵세포 등에 화학주성을 갖고 있어 interleukin 1, interleukin 6, tumor necrotic factor, fibroblast growth factor(FGF) 등의 생산을 촉진하며, EGF의 기능을 강화시키고, basic FGF 수용체의 수를 증가시키며, 내피세포를 자극하여 맥관형성(angiogenesis)을 촉진시키고, 교원질(collagen)의 합성과 피부상처의 치유를 증진시킨다.3)17)27)
각화(keratinizing) 상피세포들의 증식과 분화가 중이 진주종의 발생에 매우 중요한 요인이며 또한 염증반응이 진주종의 형성을 촉진시킬 수 있다.16)21) 중이 진주종의 발생에 TGF-β가 관여할 수 있다고 생각되나 이에 대한 연구가 아직까지는 보고된 바가 없다. 본 연구는 in situ hybridization 방법을 이용하여 사람의 중이 진주종 조직에서 TGF-β의 발현의 유무와 발현장소를 확인하고 중이진주종 상피의 증식과 분화에 대한 TGF-β의 영향을 연구하고자 한다.
재료 및 방법
1. 연구재료
만성 진주종성 중이염 환자 14명으로부터 수술동안에 절취한 진주종 조직을 본 연구에 사용하였으며 주변의 골조직은 채취하지 않았다. 음성 대조군으로서는 외이도의 정상피부(3명)를, 양성 대조군으로는 만성 화농성 중이염에서 염증성 비후를 일으킨 경부 림프결절(4명)을 절취하여 사용하였으며 그외 중이강내 콜레스테롤 육아종(cholesterol granuloma)(2명)도 수집하여 본 연구를 시행하였다. 떼어낸 조직들은 4% paraformaldehyde(pH7.4)에 24시간동안 고정한 후 4% paraformaldehyde를 포함한 30% sucrose용액에 3∼4일간 재고정시켰으며, OCT compound에 포매냉동한 후 동결절편기를 이용하여 약 5∼10μm의 두께로 자른 후 poly-L-lysine 처리가 된 유리슬라이드에 부착시켰다. 이들 조직 슬라이드들은 진공처리한 후 in situ hybridization을 시행할 때까지 -20℃ 냉동기에 보관하였으며, 각조직의 연속된 슬라이드의 일부는 H & E 염색을 시행하여 1차적으로 관찰하였다.
2. In situ hybridization
각 조직표본들은 1차적으로 0.25% pepsin(pH2.0)으로 상온에서 2분간, 100% ultraformamide로 100℃에서 3분간 처리하였다. 그후 25% ultraformamide, 25% 20X-SSC, 0.1% Tween-20 50μl, chondroitin 0.25g, 1M sodium phosphate buffer 2.5ml 등으로 hybridization 용액 50ml를 만든 후 9 random primer를 1:100,000으로 혼합하고, 이 용액에 digoxigenin-labeled TGF-β oligonucleotide probe를 1:50,000으로 희석시켜 조직표본에 반응시킨 후 90℃에서 10분간 변성(denaturation), 40℃에서 1시간동안 annealing을 시행하였으며 상온에서 밤새도록 배양시켰다. 그 후 1:200,000의 antidigoxigenin antibodyalkaline peroxidase로 45℃에서 20분간 배양한 후 Fast Red TK chromogen으로 반응시킨 후 그 결과를 관찰하였다.
결과
TGF-β probe를 이용한 in situ hybridization 검사에서 대조군으로 사용된 경부 림파결절의 림프구들은 4명의 환자들 모두에서 광범위하게 TGF-β mRNA를 발현하고 있었으며 림프결절의 부위 및 환자에 따른 차이를 보이지 않았다(Fig. 1). 그러나 3명의 정상 외이도피부의 조직절편에서는 상피세포층 및 간질층에서 TGF-β mRNA가 관찰되지 않았으며(Fig. 2), 또한 2명의 콜레스테롤 육아종의 조직절편에서도 TGF-β의 signal을 관찰할 수 없었고 염증세포의 침윤도 발견되지 않았다(Fig. 3). 중이 진주종의 조직절편에서는 14명의 환자중 12명(86%)에서 진주종 상피의 기저세포층과 기저상부세포층(suprabasal layer)을 따라 TGF-β signal이 다소 강도의 차이는 있으나 발현되었으며 특히 기저세포층에서 더 강하였다(Fig. 4). 또한 일부 진주종 조직표본에서는 TGF-β의 signal이 간질층에서 침윤된 염증세포들에 나타나기도 하였다. 진주종 상피의 전층에서 TGF-β mRNA의 발현이 14명의 환자중 7명(50%)에서 관찰되었으나 특히 기저세포층에서 뚜렷하였으며(Fig. 5), 5명(36%)에서는 기저세포층과 그주위에서만 TGF-β의 signal이 관찰되었고 나머지 2명(14%)에서는 TGF-β mRNA의 존재를 확인할 수 없었다.
고찰
중이 진주종은 고도의 증식능력을 가지고 있는 상피가 중이강과 유양봉소를 침범하여 골파괴를 일으키는 질환이다. 여기에는 여러가지 성장인자(growth factor)들이 관여하는 것으로 알려져 있고15), TGF-β가 특히 진주종의 발생에 중요한 역할을 할 것으로 기대되나 이에 대한 연구는 매우 부족한 상태이다. TGF-β는 비종양세포를 배양시 표현형의 급성변형(acute phenotypic transformation)을 일으키는 polypeptide로 처음 관찰되었으며6) carboxy-terminal의 112 아미노산 전구물질(precursor)에서 생산된 25kD의 homodimeric protein이다.7) TGF-β는 적어도 5개의 superfamily를 가지고 있으며 그중 TGF-β 1, β 2, β 3가 포유동물에서 발견되고 있다. 이들은 서로 70∼80%의 sequence homology를 가지고 있으며 질적으로도 매우 유사한 활동을 하고 있고 그중 TGF-β 1이 가장 풍부한 것으로 알려져 있다.7)24) TGF-β는 염증반응의 초기에 혈소판, CD4 세포, CD8 세포, 대식세포 등에서 분비되어 염증반응의 매개체(mediator)의 역할을 한다.4)
TGF-β는 interleukin 2(IL-2) 의존형의 T세포와 B세포의 성장 및 B세포에 의한 IgM과 IgG의 생산을 억제하는 반면에14) IgM과 IgG의 IgA로의 class switching을 촉진시키고5), 또한 IL-1 혹은 IL-2 의존형의 림프구 증식을 억제하기도 한다.26)28) 그외에 TGF-β는 cytotoxic T lymphocyte(CTL)19)22), CD3-NK세포20), lymphokine activated killer(LAK) cell9)10)13)의 활동력 등을 억제시킨다. TGF-β는 또한 항염증성 물질로서 H 2 O 2 분비, 세포독성 활동력(cytotoxic activity), 싸이토카인(IL-1, tumor necrotic factor-alpha) 분비등과 같은 대식세포의 기능을 억제시키며 다른 싸이토카인에 의해 발생하는 자극신호에 대한 negative feed-back signal을 제공하기도 한다.25) TGF-β는 또한 EGF의 기능을 강화시키고 bFGF 수용체의 수를 증가시키며 내피세포를 자극하여 맥관형성을 촉진시키고 교원질의 합성과 피부상처의 치유를 증진시킨다.3)17)27)
진주종의 병인의 규명을 위한 연구가 근래 활발히 이루어져 왔는데, 특히 진주종의 상피에서 tumor necrosis factor23), Ki-678)16), EGF15)등의 발현을 관찰하므로서 이들 단백질들이 진주종 상피의 증식, 특히 기저세포층에서 세포증식을 통한 중이 진주종의 발생 및 진행을 설명하였다. 본 연구에서는 TGF-β mRNA는 정상 외이도 피부에서는 발현되지는 않았으나 대부분의 중이 진주종 상피의 기저세포층에서 뚜렷하게 발현되었다. 또한 일부 진주종에서는 상피의 전층에서 TGF-β mRNA가 발현되기도 하였으나 그중 기저층에서 가장 강하였다. 이러한 연구결과는 TGF-β가 진주종의 상피세포 특히 기저세포층의 세포들에서 분비되어 직접적으로 혹은 EGF, interleukin 1 및 2등의 싸이토카인의 활성화를 통한 간접적인 방법에 의해 상피세포의 증식을 일으키는 것을 의미한다. 또한 일부 중이진주종조직에서는 상피세포층 뿐만 아니라 간질층의 염증세포들에서도 TGF-β의 signal이 관찰되므로서 TGF-β가 간질내 염증세포에서 분비되어 2차로 진주종상피의 증식을 유발할 수 있으며 그와는 반대로 중이진주종에서 Keratin debris의 축적으로 인해 이차로 간질층에서 육아조직의 형성 및 기타 염증반응을 일으키고 그로 인해 진주종 상피의 증식을 더욱 자극할 수도 있다.
그러나 2례의 진주종에서 TGF-β의 signal이 발현되지 않은 것은 정확히 알 수는 없으나 아마도 진주종을 떼어낸 후 고정액에 의한 고정이 불완전하였기 때문인 것으로 추측된다. 그외에 TGF-β의 signal이 콜레스테롤 육아종에서 발견되지 않으므로서 콜레스테롤 육아종이 적혈구의 성분인 콜레스테롤 crystal에 대한 항원-항체 반응에 의해 발생하나 콜레스테롤 육아종의 병인에 TGF-β가 관여하지 않음을 시사하고 있으나 콜레스테롤 육아종의 병인과 성장인자와의 관계에 대해서는 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다. 또한 염증성 비후를 일으킨 경부 림프결절의 림프구들이 TGF-β mRNA를 발현하므로서 TGF-β probe의 성능과 실험방법에 오류가 없었음을 알 수 있었다. 중이진주종의 병인에서 TGF-β의 역할을 더욱 확실히 규명하기 위해서는 진주종의 증식에 직접적으로 영향을 미치는 물질들과 TGF-β과읜 관계를 연구하고 진주종의 발생과정에 따른 TGF-β의 발현변화에 대한 연구가 필요할 것이다.
맺음말
중이진주종의 발생과 진행에 있어 TGF-β의 역할을 규명하기 위해 사람의 중이진주종 조직, 외이도 정상피부조직, 콜레스테롤 육아종 조직, 경부 림프결절조직에서 in situ hybridization 방법을 통해 TGF-β mRNA의 발현을 관찰하였다.
TGF-β mRNA는 14례의 중이 진주종 조직중 12례(85%)에서 진주종 상피의 기저세포층에서 강하게 발현되었으며 그중 7례(50%)에서는 진주종 상피의 전층에서 발현되었으나 기저세포층에서 더 뚜렸하였고 또한 5례(36%)에서는 단지 기저세포층에서만 관찰되었다. 그러나 정상 외이도 피부조직과 콜레스테롤 육아종 조직에서는 TGF-β mRNA의 발현은 관찰되지 않았다.
이러한 연구결과는 TGF-β가 지금까지 알려진 진피층의 증식기능뿐만 아니라 진주종 상피의 기저세포의 증식을 유발시켜 진주종의 발생과 진행에, 또한 중이 진주종에서 병발하는 중이 염증반응에 대해 영향을 미칠 수 있음을 시사하고 있다.
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