교신저자：조승호, 150-713 서울 영등포구 여의도동 62 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   종양세포의 침윤과 전이는 구조변화를 매개하는 단백질 분자에 의하여 세포와 세포사이 그리고 세포와 기질과의 부착에 의하여 세포가 탈락과 부착을 반복하는 복잡한 단계를 거쳐 일어난다. 종양조직에서 세포부착분자가 감소하면 종양세포는 탈분화하고 세포 부착과 극성 배열이 소실되어 세포와 세포 그리고 세포와 기저막사이의 부착력이 감소하여 침윤성을 갖게 된다. 그러므로 종양조직에서 이 세포부착분자의 소실은 침윤과 전이에 중요한 역할을 한다.¹⁾ 세포부착분자는 100가지 이상이 밝혀졌고 현재 cadherin, integrin, immunoglobulin superfamily, selectin, CD44 등의 5군으로 나누어져 있으며, 이들 각 군의 분자는 생화학적 혹은 유전학적 특징은 다르나 기능은 서로 연관되어 있다.¹⁾
   세포부착분자 중 cadherin은 세포표면의 당단백질로서 칼슘의존성의 세포간 접착물질로 작용하여 태아의 발달과 성인의 조직 구조 유지에 주된 역할을 한다.²⁾ 여러 종류의 cadherin 분자들 중에서 E-cadherin은 거의 모든 상피세포들 사이에 작용하여 유착 접합부(adherens junctions) 형성에 관여한다. 몇몇 상피성 암종에서 E-cadherin 발현의 감소가 관찰되었으며 발현 감소는 종양의 분화 정도, 침윤성, 그리고 전이와 연관되어 있다고 밝혀졌다.³⁾⁴⁾ 또한 E-cadherin은 세포질에 존재하는 catenin 단백질과 복합체를 형성하는데 이 복합체 역시 세포골격 구성요소와 함께 세포간 유착 접합부 형성에 중요한 역할을 한다.⁵⁾ Catenin은 분자량과 기능에 따라 세 가지로 분류되며, 그 중 β-catenin은 접착반(desmosome)과 유착 접합부의 주요소로 조직의 기관발생과 형태발생에 관여하는 것으로 알려져 있다.⁶⁾ β-catenin 발현의 감소는 식도, 위, 대장의 종양에서 관찰되었고,^7)8)9)10) 또 E-cadherin-β-catenin 복합체의 발현이 비정상적으로 발현하거나 감소하는 것을 몇몇 종양에서 관찰되었다.^11)12)13) 두경부종양에서는 주로 식도암에서 많은 연구가 있었으며,⁹⁾¹²⁾ 비인강암에서의 연구도 보고되었으나,¹³⁾ 구강의 종양에서 E-cadherin-β-catenin 복합체의 발현에 관한 연구는 많지 않다.¹⁴⁾ 저자들은 한국인의 설 편평세포암종에서 면역조직화학방법으로 E-cadherin과 β-catenin의 발현정도를 관찰하여 설 편평세포암종의 조직학적 분화도, 림프절 전이와 원격전이의 유무 및 임상병기와의 상관관계를 살펴보았고, 또한 E-cadherin과 β-catenin 발현양상 상호간의 연관성을 알아보고자 본 연구를 실시하였다.

대상 및 방법

대  상
   가톨릭대학교 강남성모병원에서 1994년부터 2000년까지 설 편평세포암종으로 진단된 39예를 대상으로 하였다. 총 39예의 설 편평세포암종 환자의 연령 분포는 37세부터 90세까지였으며, 평균 연령은 60.5세였다. 남자는 31예(79%)이었고, 여자는 8예(21%)였다. 대조군으로는 정상 구강의 편평세포가 포함된 조직 5예를 이용하였다. 연구대상 환자의 의무기록과 병리조직보고서를 검토하여 나이, 성별 및 병기, 종양의 위치, 분화정도 및 림프절 전이 유무를 조사하였다.

방  법
   면역조직화학염색은 설 편평세포암종 39예의 파라핀 포매조직으로부터 5 μm 두께로 절편을 얻어 급속한 온도 조절기능이 있는 microprobe immunostaining station(Biomeda Co., USA)을 사용하여 모세관법을 이용하여 다음과 같이 실시하였다. 조직절편을 85°C 오븐에 30분간 넣은 후 xylene으로 실온에서 2분간 4회 반복 처리하여 파라핀을 제거하였다. 100% 알코올로 10초간 4회 처리하여 xylene을 완전히 제거한 후 10% citrate buffer(Zymed, San Francisco, CA, USA)에 담근 후 121°C의 고압멸균기에서 10분간 가온하고 20분간 실온에서 방치하였다. 20배로 희석한 Tris buffered saline(TBS) and Tween 20(Lab vision, Fremont, CA, USA)에 4회 세척한 후 조직내의 내인성 과산화 효소를 제거하기 위하여 3% 과산화수소용액에 45°C에서 5분간 방치하였다. TBS and Tween 20으로 4회 수세한 후, 비특이 단백질의 결합을 억제하기 위하여 비면역 염소혈청(Zymed Lab. Inc., USA)을 45°C에서 5분간 작용시켰다. E-cadherin(Monoclonal, 1：50, Zymed Co, USA)과 β-catenin(Monoclonal, 1：40, Zymed Co, USA)을 일차항체 희석액(Zymed)으로 각각 1：50, 1：40배로 희석시킨 후 약 1시간 실온에서 반응시켰다. TBS and Tween 20으로 4회 세척한 후 biotinylated 이차항체(swine IgG, anti-mouse, rabbit and goat, Zymed)을 45°C에서 7분간 작용시킨 후 다시 TBS and Tween 20으로 4회 세척하였다. Streptavidin HRP detection system(Zymed)으로 45°C에서 7분간 작용시켜 biotinstreptavidin 결합을 유도하고 AEC (3-amino-9-ethylcarbazole, Lab vision)로 실온에서 10분간 작용시켜 발색시킨 후에 Meyer's hematoxylin(Zymed)으로 대조 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

결과 판독
   정상 세포가 정상적인 세포와 세포사이의 막성으로 염색되는 같은 조건에서 실험을 진행하였고, E-cadherin과 β-catenin이 세포질 내 혹은 세포막을 따라 균일하게 적갈색 과립으로 염색되면 이것을 정상 발현의 양성 반응으로 판독하였다. 두 명의 병리의사가 전체 슬라이드 중 무작위로 다섯 부분을 관찰하여, 그 중 세 부분 이상에서 동일한 염색 결과를 보일 때를 기준으로 하였다. 종양조직에서 염색결과를 대조군의 편평상피와 비교하여 세 등급으로 나누었는데, 양성반응의 강도가 비종양성 조직의 반응강도와 같이 세포막을 따라 균일하게 염색되면 강양성(＋＋), 반응강도가 약하거나 부분적인 양성을 보이면 약양성(＋), 전혀 양성반응을 보이지 않으면 음성(-)으로 분류하였다(Figs. 1 and 2).¹¹⁾¹⁴⁾ 판독의 정확도를 기하기 위하여 이미 판독한 조직을 무작위 추출하여 반복 관찰하였다.

통계 분석
   임상적 및 병리학적인 인자들과 편평세포암종의 E-cadherin과 β-catenin 단백질의 발현정도의 차이를 카이제곱검정(Chi-square test) 방법을 사용하여 분석하였고, p 값이 0.05 이하일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

결     과

   또 39예의 설 편평세포암종 환자 중 고분화성 암종(well differentiated carcinoma)은 26예, 중등도 분화성 암종(moderately differentiated carcinoma)은 10예, 저분화성 암종(poorly differentiated carcinoma)은 3예이었다. 임상적 병기에 따라 구분하여 보면 국소병기(T)는 T1 14예, T2 17예, T3 4예 그리고 T4는 4예이었다. 림프절 전이(N) 병기는 N0 22예, N(＋) 17예이었다.

E-cadherin과 β-catenin의 면역조직화학적 발현 양상
   E-cadherin과 β-catenin의 발현은 전체 39예에서 각각 15예(39%), 20예(51%)에서 감소하거나 음성발현을 보였다. 정상 점막에서 간질이나 세포질에는 염색되지 않았으며, 종양세포에서의 염색 양상은 정상 점막에서와 같이 세포막 혹은 세포질과 세포질사이의 막성 염색을 나타낸 경우, 세포질과 세포질사이의 막성 염색을 나타낸 경우, 세포질 염색이 같이 동반된 경우로 다양하였다(Figs. 1 and 2). β-catenin은 2예의 중등도 분화성 암종과 2예의 고분화성 암종에서 세포질과 핵내에 미만성으로 염색되었다.

임상양상과 E-cadherin의 발현
   E-cadherin과 임상병리학적 지표와의 상관관계를 분석해 보았을 때 종양의 조직학적 분화정도가 저등급일수록(p＝0.001), 림프절 전이가 진행될수록 E-cadherin의 발현감소나 음성발현의 비율이 높아져 E-cadherin의 발현정도와 의미있는 관련성이 있었고(p＝0.006), 종양의 크기(T stage)와는 통계적으로 유의한 연관성이 없었다. 음성발현을 보인 경우는 분화도가 나쁜 미만성으로 침윤하는 종양에서 주로 관찰되었다.

임상양상과 β-catenin의 발현
   β-catenin은 종양의 조직학적 분화정도가 저등급일수록 발현 감소나 음성발현의 비율이 높아져 통계적으로 의미있는 관련성을 보였으나(p＝0.001), 종양의 크기와는 연관성이 없었다. β-catenin과 림프절 전이와의 상관관계는 림프절 전이가 있으면 β-catenin의 발현이 보존되는 비율이 감소하고 발현감소의 비율이 증가하는 경향을 보였지만 통계적 유의성은 없었다(Table 1).

E-cadherin과 β-catenin 발현 양상의 상관관계
   종양세포에서 E-cadherin의 발현이 보존된 24예 중 β-catenin의 발현이 같이 보존된 예는 19예(79%)였으며, E-cadherin의 발현이 감소되거나 음성인 15예 중 β-catenin이 감소 혹은 음성발현된 예는 15예(100%)로 나타나 설편평세포암종에서 E-cadherin의 발현과 β-catenin의 발현 사이에는 통계적으로 유의한 관련성을 보였다(p＝0.001)(Table 2).

고     찰

   세포부착분자는 형태조절분자로서 이 세포부착분자에 의하여 매개되는 신호전달은 세포의 부착, 이동, 성장, 세포괴사, 특이 유전자 발현 등을 조절하여 세포의 증식과 분화에 영향을 준다.¹⁵⁾ 현재 이러한 세포부착분자는 cadherin, integrin, immunoglobulin superfamily, selectin, CD44의 5군으로 나뉘어져 있으며 이들 각 군의 분자는 생화학적, 유전학적 특징은 다르나 기능은 서로 연관되어 있다.¹⁾
   Cadherin은 척추동물에서 발견된 120 kD의 막성 당단백질로서, 칼슘을 제거하면 트립신에 의하여 분해되는 칼슘이온-의존성의 동종 친화성 상호작용으로 세포를 연결시킴으로써 태생기의 발달과 성인의 조직 구조 유지에 주된 역할을 한다.²⁾ 면역학적 성질과 분포하고 있는 조직에 따라 현재 11종류가 알려져 있으며, 그 중 E-cadherin은 모든 점막 상피의 세포 경계에 국한되어 발현하여 상피의 구조를 유지하는 데 중요한 성분으로 세포간 접착물질로 작용한다. 또 E-cadherin은 배아발생, 형태학적 발달, 그리고 정상구조의 기능유지에도 중요한 역할을 한다.¹⁶⁾ 최근 부착분자의 발현 변화는 세포의 분화와 이동에 영향을 주어 종양의 침윤과 전이과정에 중요한 역할을 한다는 보고가 있다.¹⁾ 즉 종양조직에서 세포간의 분리가 종양의 침윤과 전이에 일차적인 필수과정이므로 E-cadherin의 발현 감소는 암종의 분화도, 림프절 전이, 그리고 환자의 임상병기와 관계있음이 밝혀졌다.³⁾⁴⁾
   Catenin은 cadherin과 복합체를 형성하여 세포간 유착 접합부 형성에 중요한 역할을 하는 세포질 내 단백질로 α-catenin(120 kD), β-catenin(88 kD), γ-catenin(80 kD)의 세 가지 종류로 나뉜다.⁵⁾ Cadherin의 기능은 이들 세포내 단백질에 의하여 조절되며 처음에는 α-catenin이 cadherin 접착계에 영향을 미친다고 하였으나,¹⁷⁾ 최근에는 β-catenin의 역할이 더 큰 것으로 알려져 있다.¹⁸⁾ Hepatocyte growth factor, v-src, epidermal growth factor 등에 의하여 β-catenin이 티로신 인산화 되고, 이 인산화로 인한 catenin 분자의 생화학적 변형이 일어나면 상피층의 극성화에 중요한 cadherin-cateninactin 복합체가 만들어지지 못하여 불안전한 세포간 접촉에 의해 신호전달 과정에 이상이 초래될 수도 있다.¹⁹⁾ β-catenin 발현의 감소는 위, 대장의 종양에서도 관찰된다.^7)8)9)10) E-cadherin과 β-catenin 발현의 감소와 종양조직의 분화정도 및 예후와 연관성은 식도암에서도 관찰된다.⁹⁾¹²⁾ Zheng 등¹³⁾은 비인강암에서 이들 세포부착분자와 임상병기, 림프절 전이 및 생존과 연관성이 있음을 보고하였다.
   E-cadherin과 β-catenin의 발현감소의 기전에 대해서는 아직까지 정확하게 알려져 있지는 않지만,¹³⁾ Kimura 등에 의하면 첫째 cadherin 표현의 하향조절과 유전자 돌연변이, 둘째 E-cadherin의 비정상과 결손, 셋째 catenin의 생화학적 수정의 세 가지 가설이 제시되고 있다.²⁰⁾
   본 연구에서는 E-cadherin의 경우 설 편평세포암종에서 주변 정상조직에 비하여 발현이 감소하였으며, β-catenin의 발현도 감소하는 경향을 보였다. E-cadherin과 β-catenin의 발현은 정상조직에서 모두 강양성을 보였으나, 설 편평세포암종에서는 각각 39%, 51%의 발현감소 또는 음성발현을 보였다. 이는 식도암⁹⁾(각각 80%, 80%), 비인강암¹³⁾(각각 63%, 69%), 구강암¹⁴⁾(각각 63%, 85%)에서의 결과와 비교하여 볼 때 조금 낮은 발현감소율을 보였다. 이는 본 연구의 조직이 다른 연구보다 고분화성 암종이 상대적으로 많아서 나타난 결과로 사료된다. 또 E-cadherin의 경우 조직분화 정도(p＝0.001) 및 림프절 전이와(p＝0.006) 연관성이 있고, β-catenin은 조직분화 정도(p＝0.001)와 연관성이 있음을 관찰하였다.
   본 연구에서 E-cadherin과 β-catenin의 상관관계를 보면 E-cadherin의 발현이 감소된 경우 β-catenin도 의의있게 발현이 감소되었으며 E-cadherin의 발현이 보존된 경우 β-catenin의 발현도 의의있게 보존된 것으로 나타났다. 두 가지 단백질의 발현보존과 감소에 있어서 상호간에 매우 밀접한 연관성을 보여(p＝0.001) E-cadherin이 세포내 골격에 연결될 때 β-catenin이 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.
   이러한 결과는 지금까지 알려진 상피의 구조를 유지하는 E-cadherin과 β-catenin의 기능과 일치하는 것으로 E-cadherin과 β-catenin의 발현감소가 세포와 세포 사이의 접촉 유지에 영향을 미침으로써 종양이 원발부위로부터 다른 곳으로 전이되게 되는 것으로 생각되며, 세포부착분자의 발현감소가 설 편평세포암종 환자의 불량한 예후와 밀접한 관련이 있는 것으로 사료된다.
   본 연구에서는 중등도 분화성 암종 10예 중 2예와 저분화성 암종 3예 중 2예에서 β-catenin의 세포질 발현을 관찰할 수 있었다. 이는 β-catenin의 두 가지 기능, 즉 세포부착부위에서 cadherin과 연결되어 세포와 세포간 부착에 관계하는 것과 세포질이나 핵에 위치하여 세포의 변환(transformation)에 관계하는 것, 이 두 가지 중 후자와 관계되는 것으로 세포질이나 핵에서의 β-catenin 발현은 편평상피의 발암과정 중에 흔히 나타난다고 보고되고 있다.²⁰⁾

결     론

   E-cadherin과 β-catenin의 발현감소는 설 편평세포암종에서 암종의 분화도, 림프절 전이와 관련이 있으며 앞으로 예후인자로 이용될 가능성에 대한 세밀한 임상적 연구가 필요하다.

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