교신저자：박성국, 614-735 부산광역시 부산진구 개금동 인제대학교 의과대학 부산백병원 이비인후과학교실
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서     론

   맥관형성(angiogenesis)은 종양과 같은 병리적인 상태나 발생과정에서 일어나는 새로운 미세혈관의 발달과 성장을 의미하며 혈관형성 없이 단순히 확산에 의하여 산소나 영양소를 공급받는 경우는 종괴의 직경이 1~2 mm이상은 자랄 수 없다.¹⁾ 미세혈관계는 오랜 기간동안 활동하지 않으나 저산소증,²⁾ 종양의 성장,³⁾ 배란, 상처치유, 만성염증, 면역 반응과 같은 병리학적인 환경에서 생리학적 요구에 의해 빠르게 모세관이 성장하는 능력을 나타낸다.⁴⁾ 불충분한 혈관 공급과 그에 따른 조직 산소 분압의 감소는 조직의 요구를 충족시키기 위해서 종종 신생혈관화(neovascularization)를 유도하기 때문에 저산소증은 일반적으로 맥관형성의 근본적인 자극으로 생각되어 진다.²⁾
   지금까지 밝혀진 맥관형성인자는 fibroblast growth factor(FGF), angiogenin, transforming growth factor-α와 β(TGF-α and β), tumor necrotic factor-α(TNF-α), vascular endothelial growth factor(VEGF), platelet derived-endothelial cell growth factor(PD-ECGF), granulocyte-colony stimulating factor(G-CSF), placental growth factor, interleukin-8(IL-8), hepatocyte growth factor, proliferin 등이며⁵⁾ 저산소증은 VEGF와 PD-ECGF의 합성을 자극한다고 알려져 있고 VEGF와 bFGF는 heparin과 친화력이 있으며 인간의 종양에 있어 맥관형성의 제일 중요한 결정인자라 알려져 있다.⁶⁾
   비용에서 국소적으로 분비된 성장인자들은 상피와 세포외 기질의 재형성에 관여하며 국소적 맥관형성과 혈장삼출을 가지는 혈관재형성은 비용의 성장과정에서 중요한 역할을 할 수 있으나 혈관의 재형성에 관해서 알려진 것은 적다.⁷⁾ 이에 저자들은 비용에서 맥관형성인자 중 bFGF, VEGF, PD-ECGF의 발현을 RT-PCR/Southern hybridization과 면역조직화학적염색 방법으로 관찰함으로써 비용의 성장인자를 규명하는데 도움이 되고자 본 연구를 시행하였다.

재료 및 방법

재  료
   비용을 동반한 만성 부비동염 환자 중 비알레르기 증상이 없고 Multiple Allergen Stimulation test(MAST Immunosystem, CA, USA)상 음성, 천식 및 피부알레르기의 과거력이 없으며 수술전 최소한 1달간 아무런 처치를 받지 않거나 항생제 이외에 다른 처치를 받지 않은 환자 23명(남자 12명, 여자 11명, 연령 14~76세 평균연령 37.3세)을 대상으로 하였다. 대조군으로는 수술전 비과적 처치를 전혀 받지 않은 비중격 만곡증 및 비후성 비염 환자의 하비갑개점막 10예(모두 남자, 15~42세로 평균 27.5세)를 대상으로 하였다. 수술시 비용과 하비갑개의 점막을 채취하여 일부는 즉시 eppendorf tube에 분리하여 넣은 후 액화질소용기에서 냉동시켜 곧 바로 -70°C에서 냉동 보관하였으며, 일부는 면역조직화학적 검사를 위해 10% 포르말린에 고정한 후 파라핀 고정과정을 거쳤다.

방  법

Total RNA 추출 및 first strand cDNA 합성
   Qiagen사의 total RNeasy kit(Germany)를 이용하여 각 조직의 total RNA를 추출하였다. 1% mercaptoethanol이 첨가된 lysis buffer 1 ml을 조직에 첨가한 후 조직파쇄기(Biospec product, USA)와 QIAshredder 칼럼(Qiagen, Germany)을 이용하여 조직을 완전히 파쇄하였다. 조직 파쇄액에 70% 에탄올을 동일 부피로 첨가하여 RNeasy 칼럼에 loading하고 wash buffer로 3회 세척한 후 3차 증류수로 RNA를 용출하였다. 0.8% agarose 젤에 전기영동을 하여 RNA의 추출정도를 확인하였다.
   약 2 μg의 total RNA에 oligo(dT)_15-18 2 μg을 넣고 70°C에서 10분간 전 처리한 후 1 mM dNTP(Takara, Japan), 200 unit Moloney murine leukemia virus(MMLV) 역전사효소(promega, USA)와 1X 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2, 10 mM DTT)을 최종 25 μl가 되게 넣고 42°C에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 역전사효소의 활성을 제거하기 위해 95°C에서 5분간 열변성 시켰다.

역전사중합효소 연쇄반응
   각각의 angiogenesis factor들에 대한 특이 primer쌍(Table 1) 20 pmol과 cDNA 2 μl를 Premix PCR kit(바이오니아, Korea)에 혼합하고 멸균된 증류수를 첨가하여 최종 20 μl가 되도록 하여 Perkin Elmer 2400(Perkin-Elmer corp., USA)으로 중합효소 연쇄반응을 실시하였다. 96°C에서 5분간 predenaturation을 하고 94°C 20초, 62°C(β-actin) 또는 60°C(angiogenesis factors)에서 20초 그리고 72°C에서 1분의 cycle을 35회 거친 후 72°C에서 7분간 postelongation을 하였다. 반응이 끝난 후 표적서열(target sequence)의 증폭여부는 1.5% agarose 젤 전기영동으로 확인하였다. 실험에 사용하는 검체의 total RNA양을 동일하게 조정하기 위해서 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭된 β-actin의 양을 agarose 젤 전기영동과 southern hybridization을 실시하여 실험에 반영하였다.

Southern hybridization
   β-actin을 기준으로 정량화된 각 점체의 중합효소 연쇄반응액을 1.5% agarose 젤에서 TBE 완충액(50 mM Tris-borate, 1 mM EDTA, pH 8.0) 조건으로 3.3 V/cm로 1시간동안 전기영동을 한 후, ultraviolet illuminator(UVP Inc, USA)를 이용하여 전기영동 사진을 찍었다. 젤을 depurination buffer(0.25 M HCl)과 denaturation buffer(1.5 M NaCl, 0.5 N NaOH)에 차례로 처리하여 DNA를 외가닥으로 만든 다음 진공펌프(TransVac-TE80；Scientific Instrument Inc, USA)로 Hybond-N＋ membrane(Amersham, England)에 tranfer하였다.
   DNA가 부착된 Hybond-N+ membrane을 prehybridization 용액(6X SSC；0.01 M sodium phosphate, pH 6.8, 1 mM EDTA, pH 6.8, 0.5% SDS, 100 μg/ml salmon sperm DNA)이 들어 있는 hybridization chamber에 넣고 68°C에서 blocking시켰다. [γ-³²P] ATP로 end-labelling된 probe들을 1×10⁶ cpm/ml이 되게 첨가하고 62°C에서 hybridization을 실시하였다. Geiger counter로 측정하여 background noise가 거의 사라질 때까지 2X SSC, 0.1% SDS로 세척한 후, membrane을 Kodak X-AR(Kodak, USA)필름에 -70°C에서 18시간 노출시킨 후 현상하였다.
   NIH image analysis(Scion Inc. USA)를 사용하여 밀도를 구하고, 동일조직에서의 β-actin band와 밀도비(density ratio)로 mRNA의 발현정도를 비교 분석하였다.

면역조직화학적 검사
   수술로 얻은 비점막 조직은 10% 중성 포르말린에 하루동안 고정하고 일반적인 방법에 따라 파라핀 블록을 제조하였다. 비점막 조직은 파라핀 블록에서 4 μm두께의 절편을 박절하여 silane(Sigma Chemical Co., SL, USA)이 처리된 유리 슬라이드에 부착시켰으며 비점막 조직이 부착된 슬라이드는 60°C에서 1시간, 100% xylene에서 10분간 2회 탈 파라핀 과정을 거친 후 슬라이드는 90%, 85%, 80%, 70%, 60%, 50% 계열 알코올로 함수과정을 거친 후 증류수로 세척하였다. 내인성 peroxidase을 억제하기 위하여 메탄올과 30% 과산화수소수가 9：1의 비율로 섞인 용액에 10분간 처리하여 tris buffered saline(TBS, pH 7.4)로 3회 수세하였다. 슬라이드는 항원성 회복을 위하여 1% zinc sulfate(Sigma Chemical Co., SL, USA)가 포함된 10 mM citrate buffer(pH 6.0)에 넣고 microwave 오븐을 이용하여 5분간 3번 가열하였으며 슬라이드는 항체에 대한 비 특이적 반응을 억제하기 위하여 0.5% 염소혈청 혹은 0.5% 토끼혈청(Dako, CA, USA)을 함유한 TBS용액에 30분간 실온에서 처리하였다. 슬라이드로부터 혈청을 제거한 후 일차항체를 첨가하여 4°C에서 하루동안 반응시켰다. 본 연구에 사용한 일차항체의 종류와 희석농도는 Table 2와 같다(Table 2). 일차항체의 처리가 끝난 슬라이드는 1% Tween 20(Bio-Rad, CA, USA)이 포함된 TBS로 10분간 3차례 수세하였으며 일차항체가 PD-ECGF로 처리된 슬라이드는 이차항체로 biotinylated rabbit anti-goat IgG(Dako, CA, USA)를 사용하였으나, 그 외 본 실험에서 사용한 나머지 일차항체로 처리된 슬라이드는 이차항체로 biotinylated goat anti-mouse IgG(Dako, CA, USA)를 이용하여 실온에서 30분간 반응시켰다. TBS로 3차례 수세한 후 슬라이드는 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated streptavidin(Dako, CA, USA)과 실온에서 30분간 결합시킨 후 TBS로 3차례 수세하였다. 발색은 0.05% 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Sigma Chemical Co., SL, USA)/0.01% H2O2가 함유된 TBS로 실온에서 10분간 반응시켰으며 음성대조는 일차항체 대신 TBS를 사용하여 위와 동일한 과정에 의해 염색하였다. 대조염색은 Mayer's hematoxylin을 이용하였으며 염색결과의 분석은 두 명의 병리의사가 독립적으로 광학 현미경으로 관찰하여 판정하였다. 비점막과 비용은 상피세포, 기저막, 염증세포, 혈관내피세포로 각각 분류하여 판독하였고, 각 세포에서 발현되는 정도는 전혀 발현되지 않는 경우를 0점, 전체세포 중 5% 미만으로 발현되는 경우를 1점, 5%~30% 발현되는 경우를 2점, 30~50% 발현되는 경우를 3점, 50% 이상 발현되는 경우를 4점으로 표기 분류하였다.

통계학적 처리
   통계학적 검증은 SAS(release 6.12) 통계 패키지를 이용하여 Wilcoxon rank sum test를 실시하였으며 통계학적인 유의성은 p값이 0.05이하인 경우로 하였다.

결     과

역전사중합효소 연쇄반응
   β-actin에 대한 역전사중합효소 연쇄반응 산물의 예상크기는 544 bp이며, bFGF는 391 bp, VEGF는 406 bp, PD-ECGF는 561 bp이며 역전사중합효소 연쇄반응 결과 중합효소 연쇄반응 산물의 크기를 확인할 수 있었다. 모든 조직에서 β-actin은 PCR에 양성이었다(Fig. 1). bFGF의 역전사중합효소 산물은 Southern hybridization하여 그 발현양상을 조사한 결과 비용군에서는 23예중 14예, 하비갑개군에서는 10예중 8예가 발현되었으며 VEGF는 비용군에서는 23예중 4예, 하비갑개군에서는 10예중 3예, PD-ECGF는 비용군에서 23예중 17예, 하비갑개군에서는 10예중 1예가 발현되었다(Table 3). β-actin band와 밀도비의 평균은 bFGF의 경우 비용군에서는 0.4716±0.4904, 하비갑개군에서는 0.6326±0.6967로 하비갑개군에서 높은 값을 보였으나 통계적인 유의성은 없었고 PD-ECGF의 경우 비용군에서는 0.7252±0.6742, 하비갑개군에서는 0.0826±0.2611로 비용군에서는 통계적으로 유의하게 높은 발현을 보였다(p<0.05). VEGF는 발현이 미미하여 밀도비는 구할 수가 없었다(Table 4).

면역조직화학검사
   모든 비용조직과 하비갑개조직에서 bFGF, VEGF, PD-ECGF는 염증세포, 상피세포, 내피세포에서 발현되었으나 기저막에서는 발현되지 않았다(Fig. 2). 발현정도를 점수로 계산하여 비교해 본 결과 bFGF는 비용조직과 하비갑개조직이 비슷한 발현을 보였고 VEGF와 PD-ECGF는 비용조직이 하비갑개보다 유의하게 높은 발현을 보였다(p<0.05).

고     찰

   비용은 부종성 점막의 종양으로 상측벽의 중·상비도 근처 점막, 특히 사골동 점막에서 호발하며 수술적 치료를 필요로 하나 술 후 재발이 빈번하다. 비용의 생성 원인들로는 알레르기, 염증, 코의 자율신경계의 이상, 점액다당류 대사의 이상, 혈관운동 불균형, 효소 이상, 아스피린 민감성, 아라키돈산 대사산물의 불균형, 기계적 폐쇄, 히스타민의 역할, 종양발생유전자 등이 있으나 하나의 원인이 모든 비용의 형성을 정확히 설명할 수 없다.⁸⁾
   맥관형성은 종양과 같은 병리적인 상태나 발생과정에서 일어나는 새로운 미세혈관의 발달과 성장을 의미한다. 혈관의 증식은 조직의 정상적인 성장과 발육에 필요하며 정상적인 맥관형성은 상처와 골절의 치유같은 신체의 복구과정의 일부분으로 일어난다. 그러나 조절되지 않는 맥관형성 즉, 혈관신생에 의존하는 고형성 종양의 성장, 당뇨병성 망막증의 망막에서 실명을 유발하는 혈관신생 등은 병적이다.⁹⁾
   bFGF는 혈관형성과 창상치유를 촉진시키며 세포의 접착, 신경의 분화 등에도 영향을 미치며 섬유아세포, 상피세포, 혈관내피세포, 골아세포, 근육세포 등의 유사분열을 유발시킨다.¹⁰⁾ bFGF는 저장된 성장인자로⁹⁾ 세포외 기질과 기저막에서 heparan sulfate proteoglycans와 결합되어 있고⁴⁾ heparin의 분비 또는 heparanase와 proteinase의 분해로 세포외 기질과 기저막으로부터 배출된다.⁹⁾ 이러한 bFGF는 강력한 혈관생성 유발인자일 뿐 아니라 종양의 성장과 전이를 유발시키는 강력한 인자로 알려져 있다.¹¹⁾
   Powers 등¹²⁾은 10개의 낭성섬유증을 가진 비용, 4개의 낭성섬유증이 없는 비용, 환자의 중비갑개 점막과 정상 기관지 조직에서 northern blot와 면역조직화학염색을 시행한 결과 northern blot상 모든 비용에서 bFGF mRNA가 검출되었고 면역조직화학 염색상 비용이 중비갑개 점막과 기관지 조직보다 강하게 염색되었다고 하였으며, 모든 비용에서 bFGF가 혈관과 상피세포층의 기저막을 따라 강하게 염색되고 기저 상피세포와 약간의 침윤성 단핵세포에서도 염색되며 proliferating cell nuclear antigen 이 기저상피세포, 내피세포, 국소적 상피 이형성이 있는 곳에 bFGF와 함께 위치하고 있어 bFGF가 상피세포의 증식에 기여하고 따라서 비용점막의 성장에 기여한다고 하였다. 또한 비용에서 bFGF 양성 단핵세포의 의미있는 숫자가 트립신분해효소 양성으로 bFGF가 비용조직에서 내피와 상피증식에 기여 할 것이고 비만세포가 이 성장인자의 한 생성원이라고 하였으며 정상 혈관에서 bFGF은 생물학적으로 유용하지 않고 세포외 기질에 은거하고 있으나 비용과 같은 염증상태에서는 염증세포로부터 기질분해효소가 배출되어 세포의 보관으로부터 bFGF의 배출이 증가될 수 있다고 하였다.
   본 연구에서는 비용조직이 하비갑개의 점막보다 bFGF mRNA가 적게 발현되었으나 통계적 유의성은 없었고 면역조직화학 염색상 비용과 하비갑개의 점막 모두의 염증세포, 상피세포, 내피세포에서는 염색되었으나 기저막에서는 염색되지 않았으며 비용조직이 하비갑개점막보다 높게 발현되었으나 통계적 유의성은 없었다. 이것으로 보아 bFGF는 비용과 하비갑개 점막 모두에서 발현되며 비용의 성장에는 큰 영향을 미치지 않는다고 생각된다. 기존의 연구결과와 다른 결과는 조직의 스테로이드 사용유무, 동반질환의 유무, 비교 조직의 선택 등에 있다고 생각된다.
   Vascular endothelial growth factor(VEGF)는 FGF보다는 약하나 heparin과 결합하는 성장요소로 혈관내피세포에 특이적으로 작용하여 혈관투과성을 증가시키고, 맥관형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며,⁹⁾ histamine보다 50,000배 강력한 혈관 투과성을 가지며 현재 밝혀진 혈관투과성 증가요소 중 가장 강력하다.¹²⁾ VEGF는 분비되는 단백질이며¹³⁾ 다양한 세포에서 저산소 상태에 분비가 촉진되며 저산소증에 의한 tyrosine kinases의 Src family의 활성이 VEGF mRNA유도에 결정적일 것이라 생각된다.¹⁴⁾ Ito 등¹⁵⁾은 northern blotting에서 4명의 환자에서 얻은 모든 비용조직에서 VEGF의 mRNA와 KDR이 발현되었고 in situ hybridization 상 VEGF mRNA를 발현하는 세포가 비용의 부종성 기질에 산재 되어있고 비용에서 VEGF mRNA를 발현하는 세포들은 형질세포에 나타나 형질세포가 VEGF을 생산하며 비용에서 부종의 발달에 비만세포보다 중요한 역할을 할 것이라 추측된다고 하였으나 Vento 등¹⁶⁾은 면역조직화학염색상 대조 비점막보다 VEGF 염색이 비용에서 약하였고 이것은 스테로이드를 사용하였기 때문이라 하였으며 대부분의 비용과 대조 비점막에서 비만세포는 탈과립 되어 있고 VEGF에 깨끗한 염색을 보이지 않았으나 2개의 비용의 탈과립 되지 않은 비만세포들에서 VEGF 면역반응이 보여 비만세포로부터 VEGF의 방출이 비용의 병인에 참여 할 것이라 하였다. Coste 등⁷⁾은 면역조직화학염색상 비용과 대조 비점막의 염증세포와 상피세포에서 VEGF가 대부분 발현되었고 정량적으로 비용의 염증세포에서가 비점막의 염증세포보다 VEGF 발현이 높았다고 하였으며 인간 비점막 상피세포를 배양하여 VEGF의 농도를 측정한 결과 VEGF의 농도가 2일부터 4일까지는 증가하였으나 감소하기 시작하여 7일째는 발견할 수 없어 인간 비 상피세포들은 생체외에서 VEGF을 분비 할 수 있으며 Transforming growth factor-β₁이 이 분비를 상향조절하며 VEGF가 증가된 미세혈관 과투과성과 맥관형성의 유도를 통해 비용의 병인에 관여할 것이라 제안하였다. 본 연구에서 모든 비용조직과 하비갑개에서 VEGF mRNA의 발현은 비용조직이 하비갑개보다 적게 발현되었으며 발현이 미미하여 밀도비는 구할 수 없었다. 면역조직화학염색상 모든 비용 조직과 하비갑개의 염증세포, 상피세포, 내피세포에서 강하게 염색되었으며 비용조직이 하비갑개보다 유의하게 발현이 높아 VEGF가 비용의 성장에 기여한다고 생각된다. 기존의 연구 결과와 다른 결과는 조직의 차이와 스테로이드 사용 때문이라고 생각된다.
   Platelet-derived endothelial cell growth factor(PD-ECGF)는 heparin과 결합하지 않고 혈소판으로부터 분리되었으며¹⁷⁾ 생체외에서는 내피세포의 화학주성을 자극하고 생체내에서는 맥관형성에 관여한다.¹⁸⁾ 또한 PD-ECGF는 생리학적 맥관형성이 아니라 병적인 맥관형성에 중요한 것으로 생각되어지며¹⁷⁾ 맥관형성 부위에 축적되는 것으로 알려져 있는 비만세포의 화학역동현상(chemokinesis)과 이주를 증진시킨다. PD-ECGF 발현은 저산소증 뿐만 아니라 산성 조건의 표지이며,¹⁹⁾ 저산소증은 생체내와 생체외에서 PD-ECGF 단백질의 발현을 상향 조절한다.³⁾ Mori 등²⁰⁾은 집먼지 진드기에 의한 알레르기성 비염환자의 하비갑개 점막과 비알레르기성 비염환자의 비갑개를 비교시 알레르기군에서 PD-ECGF 발현의 정도는 고유층의 간질 부위에서 비알레르기성 점막 보아 의미있게 높았으나 상피층과 비분비선에서는 차이가 없었으며 알레르기성 점막에서 혈관분포상태는 비 알레르기성 점막보다 높았고 고유층의 간질부위와 상피층에서 PD-ECGF 발현과 CD34^＋ 혈관의 숫자 사이에는 의미있는 연관성이 있다고 하였다. 또한 전체 비증상 점수는 PD-ECGF 발현과 혈관의 숫자 모두와 의미있게 연관되어 있어 PD-ECGF가 코의 맥관형성에 중요한 역할을 하고 알레르기성 비염의 병리에 참여한다고 하였으며 알레르기성 질환에서 비만세포와 PD-ECGF사이의 상호작용이 혈관구조의 병리학적인 변화에 중요한 요인이라 하였다. 비용에서 PD-ECGF에 관한 연구가 없어 비교할 수는 없으나 본 연구에서는 비용조직이 하비갑개 보다 PD-ECGF mRNA의 발현이 유의하게 증가하였으며 면역조직화학염색상 비용과 하비갑개 조직 모두 염증세포, 상피세포, 내피세포에서 강하게 염색되었으나 기저막에서는 염색되지 않았고 비용조직이 하비갑개 보다 유의하게 발현이 높아 비용의 성장에 PD-ECGF가 관여한다고 생각된다. 이로 보아 비용의 성장에 맥관형성인자가 관여하고 있으며 비용에서 VEGF와 PD-ECGF가 하비갑개보다 발현이 높아 저산소증이 비용의 성장에 중요한 역할을 할 것이라 생각된다.

결     론

   비용의 성장에 맥관형성인자들이 관여하며 bFGF, VEGF, PD-ECGF 중 저산소증에 의해 분비가 촉진되는 VEGF와 PD-ECGF의 발현이 비용에서 높아 저산소증이 비용의 성장에 큰 영향을 미친다고 생각된다. 또한 비용에서 다른 맥관형성인자들의 연구가 필요하며 맥관형성인자 억제제에 관한 연구도 필요하다고 생각된다.

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