교신저자：허경욱, 614-735 부산광역시 부산진구 개금2동 633-165  인제대학교 의과대학 부산백병원 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   후두의 편평세포암은 수술적 방법으로 완치를 기대할 수 있으나 불가피하게 발성장애를 비롯한 많은 술후 합병증을 남기게 되어 현존하는 수술, 방사선 및 항암제 치료법 외에 질병치료 및 생존율을 증가시키는 새로운 치료법의 개발이 시급하게 요구되고 있으며, 이를 위해서는 무엇보다도 조기진단과 치료결과를 예측할 수 있는 요소인 예후인자의 활용으로 암의 초기에 치료방침을 세우는 것이 중요하다고 할 수 있다. 기존의 예후인자로는 병기, 경부 림프절전이의 유무, 병리조직학적 분화도, 주위 조직에 침윤 정도 등 여러 가지 요인이 있으며 다양한 각도로 다른 예후인자를 찾고자 하는 노력이 이루어지고 있다.¹⁾
   암세포와 숙주의 혈관계 사이에서 일어나는 반응들 중 가장 중요한 것은 신생혈관생성으로 이것은 protease의 유출후 국소 소정맥의 세포외 기질의 분해, 모세혈관 내피세포의 증식, 자극으로 향하는 모세혈관 내피세포의 증식, 자극으로 향하는 모세혈관 미세관의 이주로 구성되는 일련의 과정이다. 종양의 지름이 1 mm에서 2 mm에 이르기 전까지는 필요한 산소와 영양을 단순한 수동적 확산을 통해서 얻을 수 있으나 3 mm에서 5 mm이상 성장하려면 새로운 혈관의 생성이 필수적이다.²⁾ 종양내의 혈관형성이 종양세포의 성장과 전이에 영향을 준다고 알려지면서 많은 실험과 임상연구를 통하여 신생혈관생성의 정도가 고형암의 예후인자로 인정되고 있다.¹⁾ 저산소증은 platelet-derived endothelial cell growth factor(PD-ECGF)와 vascular endothelial growth factor(VEGF)의 합성을 자극한다고 알려져 있고 VEGF와 basic fibroblast growth factor(bFGF)는 heparin과 친화력이 있으며 인간의 종양에 있어 신생혈관생성의 가장 중요한 결정인자라 알려져 있다.³⁾
   소화기계, 비뇨기계, 그리고 생식기계 등에서 신생혈관생성인자의 발현을 연구하고 그 발현이 암의 임상적 양상이나 예후와의 관련성에 대해 연구한 바가 많다.⁴⁾ 두경부암의 영역에서 기존의 연구에서는 후두뿐만 아니라 비인강, 설, 구강 등 다수의 기관에서 조사된 연구가 대다수여서 후두만을 대상으로 조사한 바는 매우 드물다. 이에 저자들은 후두의 편평세포암종에서 신생혈관생성인자중 PD-ECGF, bFGF, 그리고 VEGF의 mRNA 발현여부와 발현양을 reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)을 통해 조사하여 기존의 임상병기, 림프절 전이정도, 그리고 종양의 분화도와 연관관계가 있는 지, 세 인자간에 관련성 여부를 연구하고자 하였다.

재료 및 방법

재  료
   1999년 5월부터 2001년 4월까지 이비인후과를 방문하여 조직검사상 후두의 편평세포암종으로 확진받은 환자 17예를 대상으로 하였다. 남자가 16예, 여자가 1예였고 나이는 49~71세로 평균 60세였다. 현수후두경하에 채취된 암조직을 즉시 -70°C에서 냉동 보관하였다. 17예중 2예는 타병원으로 전원하여 임상병기가 조사되지 않았다.

방  법

Total RNA 추출
   Qiagen사의 total RNeasy kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 각 조직의 total RNA를 추출하였다. 1% mercaptoethanol이 첨가된 lysis buffer 1 ml을 조직에 첨가한 후 조직파쇄기(Biospec product, WI, USA)로 조직을 완전히 파쇄하였다. 파쇄된 조직액을 QIAshredder 칼럼(Qiagen, Germany)에 옮긴 후 10,000 g에서 2분간 원심 분리시켜 상청액을 회수한 다음 70% 에탄올을 동일 부피로 첨가하여 RNeasy 칼럼에 loading하여 resin에 RNA를 결합시켰다. Wash buffer로 3회 세척한 후 3차 증류수로 RNA를 용출하였다. 실험에 사용하기 전까지 3 M sodium acetate와 100% 에탄올을 첨가하여 -70°C에 보관하였다. RNA의 추출정도를 확인하기 위하여 0.8% aga-rose gel에 전기영동을 하여 4.7 kb와 1.8 kb의 ribosomal RNA band를 확인하였다.

Oligonucleotide primer 및 probe의 합성
   각각의 cytokine에 특이적인 primer 염기서열은 Table 1에 표시하였다. Genomic DNA와 cDNA간의 증폭을 구분하기 위해 적어도 하나 이상의 intron이 포함되는 exon 부위를 primer로 설정하였다. Southern hybridization에 사용할 probe들은 선정된 primer들 사이에 존재하는 intron을 제외한 exon 부위에서 특이도가 50~60% 이상되는 부위로 설정하였다. 설정된 primer와 probe의 합성은 바이오니아(Korea)에 의뢰하여 합성하였다. 각 primer 쌍을 사용하여 나타나는 RT-PCR product의 크기는 Table 1에 표시하였다(Table 1).

First strand cDNA의 합성
   약 2 μg의 total RNA에 oligo(dT)_15-18 2 μg을 넣고 70°C에서 10분간 전 처리한 후 1 mM dNTP(Takara, Japan), 200 unit Moloney murine leukemia virus(MMLV) 역전사효소(promega, WI, USA)와 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl₂, 10 mM DTT)을 최종 25 μl가 되게 넣고 42°C에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 역전사효소의 활성을 제거하기 위해 95°C에서 5분간 열변성시켰다.

중합효소 연쇄반응
   중합효소 연쇄반응은 Premix PCR kit(바이오니아, Korea)를 이용하였다. DNA polymerase 2.5 unit, 1 mM dNTP가 있는 반응액에 합성된 cDNA 2 μl와 primer 쌍 20 pmol을 첨가하여 최종 반응액의 부피가 20 μl가 되게 조절하여 반응시켰다. 반응은 Gene Amp2400(Perkin-Elmer corp., USA)를 사용하였으며, 반응조건은 Table 1의 각 신생혈관생성인자의 annealing Tm 값에 따라 실시하였다. Denaturation은 96°C에서 30초 동안, annealing은 30초 동안, elongation은 70°C에서 1분간 실시하였고, cycle은 35회로 하였다. 반응이 끝난 후 4°C에 보관하면서 표적서열의 증폭여부를 1.2% agarose 젤 전기영동으로 확인하였다. RT-PCR을 통하여 증폭된 각 신생혈관생성인자의 특이 band의 intensity는 NIH image analysis(Scion Inc, USA)를 이용하여 측정하고 각 band의 intensity를 β-actin PCR band에 대한 비를 구하여 비교 분석하였다.

임상병기 및 종양의 분화도
   환자들의 의무기록을 후향적으로 조사하여 1997년 AJCC에 의한 TNM 병기를 조사하였다. 종양의 분화도는 두 명의 병리전문의가 조직 슬라이드를 검토하였다.

통계적 분석
   통계학적 검증은 SAS(release 6.12) 통계 패키지를 이용하였다. 임상병기, 림프절 전이정도, 그리고 종양의 분화도와의 관계는 Fisher's exact test와 Willcoxon rank sum test를 사용하였으며, 세 인자간의 관계는 spearman 상관계수를 이용하였다. 통계적 유의성은 p값이 0.05미만인 경우로 하였다.

결     과

   β-actin에 대한 RT-PCR product의 예상 크기는 544 bp이며 PD-ECGF는 561 bp, bFGF는 391 bp, 그리고 VEGF는 538 bp와 406 bp이며 RT-PCR 결과 예상하였던 PCR product의 크기를 확인 할 수 있었다(Fig. 1). 모든 조직에서 β-actin은 PCR에 양성이었다. 후두의 편평세포암종에서 신생혈관생성인자의 발현양은 Table 2와 같다(Table 2).

신생혈관생성인자의 발현여부 및 발현양과 임상병기간의 관계
   PD-ECGF는 병기 I과 II 5예 모두 발현되지 않았고 병기 III과 IV 10예중 8예가 발현되어 병기 I과 II보다 병기 III과 IV에서 유의하게 발현이 증가되었다(p＝0.006). 또 PD-ECGF의 값은 병기 III에서 1.10±0.60이며 병기 IV에서는 1.02±0.88로, PD-ECGF의 발현양과 병기간에는 연관성이 없었다(p＝0.0823).
   bFGF는 병기 I과 II 5예중 1예에서 발현되었고 병기 III과 IV 10예중 9예에서 발현되어 병기 I과 II보다 병기 III과 IV에서 유의하게 발현이 증가되었다(p＝0.017). 또 bFGF의 값은 병기 I에서 0.23±0.40이었고 병기 II에서는 발현되지 않았으며, 병기 III에서는 0.77±0.41이었으며 병기 IV에서 값은 0.91±0.13으로, bFGF의 발현양과 병기간에는 연관성이 없었다(p＝0.0899).
   VEGF는 병기 I과 II 5예 모두 발현되지 않았고 병기 III과 IV 10예중 5예에서 발현되어 병기 I과 II와 병기 III과 IV간에는 유의한 차이가 없었다(p＝0.084). 또 VEGF의 값은 병기 III에서 값은 0.26±0.26이고 병기 IV에서 0.17±0.30으로 VEGF의 발현양도 병기와는 관련이 없었다(p＝0.3108)(Table 3 and 4).
   PD-ECGF, bFGF, 그리고 VEGF 세가지 인자가 모두 발현되지 않았던 경우는 병기 I과 II에서 5예중 4예였고 병기 III과 IV에서는 10예 모두 세 인자 중 하나 이상 발현되어, 세 인자중 하나 이상의 발현은 병기 III과 IV와 유의한 관계가 있었다(p＝0.0037). 또, VEGF가 발현된 5예 모두에서 동시에 PD-ECGF가 발현되어 두 인자간에는 유의한 상관관계가 있었으며(p＝0.0043), 나머지 인자들간에는 상관관계가 없었다.

신생혈관생성인자의 발현양과 림프절전이 정도와의 관계
   전체 대상중 N0는 6예, N1은 6예, 그리고 N2는 3예였다. PD-ECGF의 값은 N0에서 0.15±0.36이었고 N1의 경우 1.14±0.64였으며, N2의 경우 1.02±0.88로 림프절 전이 정도와 PD-ECGF의 발현양은 관련이 없었다(p＝0.0613). bFGF의 값은 N0에서 0.21±0.33이었고 N1의 경우 0.80±0.44였으며, N2의 경우 0.91±0.13으로 림프절 전이가 진행될수록 bFGF의 발현양이 유의하게 증가했다(p＝0.0305). VEGF는 N0에서 발현되지 않았고, N1의 경우 0.31±0.25 였고, N2의 경우 0.17±0.30으로 VEGF의 발현양은 림프절 전이정도와 관련이 없었다(p＝0.0822)(Table 5).

신생혈관생성인자의 발현양과 조직학적 분화도와의 관계
   전체 대상중 세포의 분화도가 좋은 경우는 11예, 중등도의 분화도를 보인 경우가 5예, 그리고 분화도가 나빴던 경우가 1예였다. 분화도가 나빴던 1예는 신생혈관생성인자가 모두 발현되지 않아 통계처리에서 제외하였다.
   PD-ECGF의 값은 세포의 분화도가 좋았던 경우 0.77±0.77이었고 중등도의 분화도를 보인 경우 0.46±0.68로 PD-ECGF의 값은 세포의 분화도와 관련이 없었다(p＝0.5158). bFGF의 값은 세포의 분화도가 좋았던 경우 0.54±0.46이었고 중등도의 분화도를 보인 경우 0.58±0.56으로, bFGF의 값도 세포의 분화도와는 무관했다(p＝0.8192). VEGF의 값은 세포의 분화도가 좋았던 경우 0.12±0.20이었고 중등도의 분화도를 보인 경우 0.22±0.30으로 VEGF의 값도 세포의 분화도와는 연관이 없었다(p＝0.4215)(Table 6).

고     찰

   고형암이 많은 신생혈관을 보이게 되면 체내 혈액순환에 노출되기 쉽고 새로이 만들어진 혈관은 정상혈관이 가진 방어기능을 가지고 있지 않다. 예를 들면 산소나 호르몬의 변화에 대한 방어작용을 담당하는 혈관주위세포가 없어 대사상의 변화에 능동적으로 대처하지 못하며, 정상적인 혈관보다 혈관벽이 약해 종양의 침습으로 림프절 전이의 통로가 되기도 한다.⁵⁾
   PD-ECGF는 Thymidine phosphorylase와 동일한 물질로 thymidine, deoxyuridine 그리고 그들의 유사물질을 가역적으로 각각의 염기와 2-deoxyribose-1-phosphate로 인산화를 촉매하며 혈소판에서 처음 분리되었다.⁶⁾ 이 단백질은 내피세포의 분열촉진에는 VEGF나 bFGF보다는 약하게 작용하지만 내피세포의 이주를 증진시키며 저산소증에 의해 그 분비가 자극받게 되며 암세포가 저산소증에 의한 세포고사에 저항하는 데에 작용을 할 것으로 생각되고 있다.⁷⁾ Fukuiwa 등⁶⁾은 PD-ECGF가 구강, 구인두, 후두, 하인두 등의 두경부암과 관련이 없는 것으로 보고하였으나 Choi 등⁸⁾은 두경부 편평세포암종에서 PD-ECGF가 신생혈관의 성장과 연관이 있으며, 종양의 성장에도 관여한다고 하였다. 본 연구에서는 후두의 편평세포암종만을 대상으로 하여, PD-ECGF가 초기암보다 진행된 암에서 발현이 증가되어 암의 진행정도를 파악할 수 있는 척도로 사용할 수 있을 것으로 생각된다.
   bFGF는 또 하나의 혈관형성 촉진인자로 크기는 18~24 kD이며 146개의 아미노산으로 구성된 수용성의 단백질로서 중배엽성 조직과 신경 외배엽에서 기인된 세포의 분화를 촉진시키는 요소로, 조직개형에 필수적인 collagenase와 plasminogen activator의 생산을 증가시키고 in vivo에서는 혈관형성의 강력한 유도물질이며, in vitro에서 암조직으로부터 분비된 bFGF는 단백분해효소를 증가시키고 혈관내피세포를 측분비의 방법으로 자극하여 암의 진행을 자극한다.⁹⁾ 또, 이것은 heparin에 결합되어 있고 VEGF와는 달리 비특이적으로 분열을 촉진시켜 많은 외배엽 및 중배엽기원의 세포들에 작용하며, 암세포와 내피세포 자체에서 생산 및 유포되어 자가분비의 형태를 띠고 신생혈관생성에 있어 VEGF와 협동적으로 작용한다.¹⁰⁾ 진행된 두경부암에 있어서는 bFGF가 혈청 내에서 증가되어 있을 때 생존기간이 더 짧으며 bFGF에 대한 단클론항체가 종양의 생성을 억제함이 보고되었다.¹¹⁾ Burian 등¹²⁾은 후두 편평세포암을 대상으로 암세포, 암주위의 기질 및 혈관내피세포에서 면역조직화학적으로 조사하여 bFGF의 발현이 임상병기, 조직학적 분화도, 생존률, 그리고 미세혈관밀도와는 무관하다고 하였으나 본 연구에서는 암세포만을 대상으로 하여 bFGF의 mRNA가 진행된 후두의 편평세포암종에서 의미있게 증가되어 있음을 확인했으며, 림프절전이와 관련이 있어 새로운 예후인자로써 활용이 가능할 것으로 사료된다.
   VEGF는 처음에는 vascular permeability factor라고 했으며 Ferrara 등¹³⁾에 의해 처음 분자적으로 정의되었다. VEGF는 VEGF206, VEGF189, VEGF165, VEGF121, VEGF145 등 여러 다양한 크기의 유사체들이 발견되었으며 이들 중 VEGF165이 성숙된 형태로 그 크기는 45 kD이다.⁵⁾ VEGF가 혈관의 기질을 만드는 기전¹⁴⁾은 첫째로 VEGF가 특이적인 두 개의 tyrosine kinase receptor protein인 VEGFR-1, VEGFR-2에 결합함으로써 내피세포에 직접적으로 강력한 분열촉진인자로 작용하며, 둘째로 VEGF가 혈관투과의 매개체로 작용해 미세혈관의 투과성이 증가되어 혈장단백이 혈관밖의 기질로 유출되어 세포외 기질에 혈관신생의 전단계가 일어난다. VEGF는 폐, 갑상선, 유방, 식도, 위, 대장, 신장, 방광, 난소, 그리고 자궁경부 등의 상피암과 혈관육종, 배세포암, 일부 중추신경계암에서 발견되었고¹³⁾ 두경부 편평상피세포암¹⁵⁾에서 증가되어 있음이 보고되었다. 87명의 비인강 편평상피세포암 환자에서 전이가 없는 환자보다 전이가 있는 환자에서 VEGF의 혈청내 양이 의미있게 증가했다는 보고가 있었으며¹⁶⁾ 후두편평상피세포암의 면역조직화학 염색에 의한 연구에서는 미세혈관의 발현이 증가된 지역에 VEGF의 발현 역시 증가되어 있어 VEGF의 발현은 미세혈관의 숫자와 관련이 있으며 증가된 미세혈관의 숫자는 후두암의 나쁜 예후와도 관련이 있는 것으로 보고된 바 있다.¹²⁾ Choi 등⁸⁾은 후두결절조직보다 두경부 편평상세포암종에서 VEGF의 발현이 증가되어 있고 미세혈관의 숫자와 관련이 있었으며 임상병기와는 무관하다고 보고하여 본 연구의 결과와 일치하였다.
피부의 악성흑색종에서 Srivastava 등¹⁷⁾이 신생혈관의 정도가 전이가능성을 예측할 수 있다고 보고한 이후 혈관내피세포에 발현되는 항원을 이용하여 종양에서 신생혈관의 생성정도와 종양의 병기나 전이여부와 관련성을 알아보고자 하는 많은 연구가 진행되었다. 두경부암에서 Hur 등¹⁸⁾은 성문상부암종에서 신생혈관의 수가 경부 림프절 전이, 그리고 원발병소의 병기와 의미있게 증가되어 있다고 보고하였으나 Lee 등¹⁹⁾은 두경부암종내 미세혈관의 평균수는 경부전이군과 비전이군에서 특이한 상관관계를 보이지 않는다고 하였다. 본 연구의 결과에서 병기 III과 IV가 세가지 신생혈관생성인자중 하나 이상의 인자가 발현되는 것과 관련이 있음을 알 수 있었다. 보고자들간의 차이는 두경부 편평세포암종 중에서도 원발병소의 위치에 따라 그 세포생물학적 특징 및 림프절전이등의 임상적인 특성이 달라 미세혈관의 발현에 차이가 있을 것으로 생각된다.²⁰⁾ 그 예로 bFGF는 종양의 직경 3~4 mm 이하의 작은 종양에서 많이 발현되고 VEGF는 직경 10 mm 이상의 종양에서 많이 분포하며, 같은 종양내에서도 bFGF는 세포의 분화가 가장 일어난 종양의 외곽에, VEGF는 종양의 중심부에 높게 발현된다.²¹⁾ 본 연구에서 조사된 세가지 신생혈관생성인자들 중 PD-ECGF와 VEGF간에 연관성이 있는 것으로 밝혀져 후두의 편평세포암에서 인자들간의 연관성에 대해 분자적, 임상적인 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.

결     론

   후두의 편평세포암종에서 PD-ECGF와 bFGF는 기존의 임상적 병기와 유의한 연관관계가 있었으며, 특히 bFGF는 림프절 전이정도와도 연관성이 있었다. 또, 인자가 하나이상 발현된 경우 병기 III과 IV와 관련이 있어, 후두의 편평세포암종에서 신생혈관생성인자를 예후인자로 사용할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다. 향후 정상 후두조직과 더 많은 암조직을 이용한 연구가 필요하며, 수술시 채취된 조직으로 이들 인자의 농도를 측정하고 암의 재발에 대한 장기간의 추적관찰이 필요할 것으로 사료된다.

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