서     론

   신생혈관생성(angiogenesis)은 조직의 발달, 재생, 상처치유 등에 있어 핵심적인 과정이며 특히 고형성 종양의 성장, 전이에 있어서 중요한 과정이다.¹⁾ 실제로 종양은 새로운 혈관의 생성 없이는 3 mm³에서 5 mm³이상 성장할 수 없다.²⁾ 이러한 종양에서의 신생혈관생성은 종양조직에서 혈관 생성인자를 분비하여 종양주변의 조직에서 종양으로 혈관생성을 촉진시켜 일어난다. 그러므로 종양의 성장을 위하여 신생혈관생성인자의 분비가 필수적이고 이러한 신생혈관을 통하여 원격전이가 일어날 수 있다. 현재 혈관생성을 촉진시키는 인자로는 vascular endothelial growth factor(이하 VEGF로 약함), platelet-derived endothelial cell growth factor(이하 PD-ECGF로 약함), basic fibroblast growth factor, transforming growth factor-β 등 다양한 인자들이 발견되었으며³⁾ 이중 VEGF, PD-ECGF는 강력한 혈관 생성 유발인자의 하나로 종양의 성장과 전이를 유발시키는 물질로 알려져 있다.^4-6) 생성혈관을 평가하기 위해서는 혈관에 대한 표식자가 필요한데 이에는 혈관 내피세포에 특이적으로 발현되는 platelet-endothelial cell adhesion molecule(PECAM-1/CD-31, 이하 CD-31로 약함)과 factor VIII-related antigen이 있으며 이중 CD-31이 더 민감하여 널리 사용되고 있다.⁷⁾ 이들은 신생혈관생성을 유발시키는 원인과는 관계없이 결과적으로 형성된 미세혈관의 정도(microvessel density)를 정량적으로 파악하는데 유용하다.

   다양한 종양에서 혈관의 생성정도나 유발인자의 발현을 통한 실험이 진행되고 있으나 아직까지 국내에서는 두경부 종양에서 VEGF, PD-ECGF의 발현에 대한 연구가 없었고 두경부 편평세포암종중에서 성문암, 성문상암, 하인두암에서 이러한 인자의 발현과 신생혈관생성, 임상적인 양상, 예후와의 관계에 대한 연구가 없었다.
   이에 저자들은 VEGF, PD-ECGF의 두경부 편평세포암종에서의 발현여부와 신생혈관생성과의 관계를 알아보고, 두경부 편평세포암종에서 VEGF, PD-ECGF와 신생혈관생성 정도가 종양의 성장과 전이 및 예후에 관계가 있는지를 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1993년 1월부터 1999년 5월까지 경희대학교 의과대학 이비인후과학교실에서 진단과 수술을 시행 받은 12예의 성문암, 9예의 성문상암, 5예의 하인두암 환자를 대상으로 하였으며, 조직검사결과는 모두 편평세포암종이었다.
   음성 대조군은 후두결절 환자의 정상 후두 조직 6예를 대상으로 하였다.
   26예 모두가 남자였으며, 연령 분포는 46세에서 75세(평균 58.4세)였다. 종양의 크기와 림프절 전이에 관한 분류는 1997년 AJCC의 TNM 분류법을 이용하였다.

방  법

면역조직화학적 검사(immunohistochemistry method)
   각각의 조직을 10% 포르말린 용액에 고정시킨 후 파라핀 포매시키고 4 μm의 두께로 연속절편을 작성하여 hematoxylineosin으로 염색하여 병변조직이 현저한 곳을 선정하였다. VEGF, PD-ECGF와 CD-31의 검출은 면역조직화학적 검사방법을 사용하였다. Xylene으로 5분간 탈 파라핀화하고 100%, 90%, 80% 알콜로 처리한 후 증류수로 함수시켰다. 3% 과산화수소수로 15분간 처리하여 내인성 과산화효소를 억제시킨 후 pH 7.6의 Tris 완충액으로 5분간 2회 헹군 후 비특이적 염색을 없애기 위해 blocking 시약(phosphate buffered saline, 이하 PBS로 약함；carrier protein；15 mM sodium azide)으로 처리하고 microwave를 121°C로 15분간 가열한 후 Tris 완충액으로 5분간 2회 수세하였다.
   VEGF의 일차항체는 1：200으로 희석한 rabbit polyclonal anti-human VEGF(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA)를, PD-ECGF의 일차항체는 1：200으로 희석한 mouse monoclonal anti-human PD-ECGF(Neomarker, Union City, CA, USA)를, CD-31의 일차항체는 1：80으로 희석한 mouse monoclonal anti-human CD-31(Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA)을 사용하였다. 일차항체와 검체는 실온에서 VEGF는 24시간, PD-ECGF와 CD-31은 2시간동안 반응시켰다.
   이후에 Tris 완충액으로 5분간 2회 수세 후 이차항체(Biotin으로 결합된 antimouse Ig와 antirabbit Ig)로 10분간 반응시켰으며 streptoavidin 시약으로 10분간 반응시킨 후 diaminobenzidine으로 7분간 반응시키고 Harris hematoxylin 염색으로 대조염색하였다. 양성 대조군으로 VEGF에 대해서는 정상 aortic smooth muscle cell을,⁸⁾ PD-ECGF에 대해서는 kuffer cell이 풍부한 정상 간 조직을 사용하였다.⁹⁾ 음성 대조군은 각각의 일차항체 대신 PBS 로 대치시키고 나머지 과정은 동일한 방법이었다.

VEGF, PD-ECGF의 평가
   면역염색된 조직은 임상양상을 알지 못하는 두명의 병리전문의가 저배율(×40, ×100)로 관찰하면서 염색이 잘 되어 있는 부분을 선정하여 400배의 확대시야에서 관찰하고 음성 대조군에서의 염색강도를 음성, 세포핵과 구별되어 세포질에 뚜렷이 염색되는 경우를 양성으로 판정하였으며 한 시야에서 500개의 세포중 양성세포의 비율을 백분율로 표시하였다. VEGF, PD-ECGF의 발현도에 따른 임상병리적 소견과의 비교를 위하여 각각 평균을 기준으로 고발현군과 저발현군으로 나누었다.⁵⁾

미세혈관 생성정도의 평가
   CD-31의 면역화학염색후 두명의 병리전문의가 저배율(×40, ×100) 광학현미경하에서 슬라이드 내에 종양조직내의 염색된 미세혈관(세정맥과 모세혈관)이 가장 많은 부위를 선택후 200배로 바꾸어 한 시야의 모세혈관의 수를 세어 평균값으로 표시하였다.³⁾ 미세혈관의 혈관내피세포의 세포질에만 갈색으로 염색된 혈관만을 양성으로 하였다. CD-31의 발현도에 따른 임상병리적 소견과의 비교를 위하여 각각 평균을 기준으로 고발현군과 저발현군으로 나누었다.⁵⁾

결과 분석 및 통계학적 검증
   두경부 편평세포암종과 정상 후두조직간에 VEGF, PD-ECGF의 발현도와 신생혈관의 생성정도를 비교하였으며(Student's t-test), 각각 발현도와 신생혈관생성의 연관성을 알아보기 위하여 신생혈관의 생성정도를 비교하였다(linear regression analysis, Spearman's test). 또한 VEGF, PD-ECGF의 발현도와 신생혈관생성정도가 임상병리적 소견과 관련이 있는지 알아보기 위하여 각각에서 저발현군(평균이하)과 고발현군(평균이상)을 비교하였다(Fisher's Exact test). 모든 p값은 양측 검정하였다.

결     과

정상조직과 두경부 편평세포암종 사이의 VEGF, PD-ECGF의 발현율과 미세혈관 생성의 비교

   두경부 편평세포암종에서 VEGF, PD-ECGF의 발현율은 대조군인 정상 후두조직보다 높았다(p<0.05, Table 1, Figs. 1 and 2). 미세혈관의 수를 알 수 있는 CD-31의 발현도 정상 후두조직보다 높았다(p<0.05, Table 1, Fig. 3).

두경부 편평세포암종에서 VEGF, PD-ECGF의 발현율과 미세혈관의 생성 정도간의 관계

   두경부 편평세포암종에서 VEGF의 발현율과 미세혈관의 수간에 통계적 연관성이 있었고(p<0.05, Fig. 4A) VEGF의 저발현군(평균이하)에서 미세혈관의 수는 30.43±9.24 이고 고발현군(평균이상)에서의 미세혈관의 수는 37.46±7.32로 저발현군과 고발현군 사이에도 차이가 있었다(p< 0.05, Fig. 5A). PD-ECGF의 발현율과 미세혈관의 수간에 통계적 연관성이 있었으나(p<0.05, Fig. 4B) PD-ECGF의 저발현군에서 미세혈관의 수는 31±9.67이고 고발현군에서의 미세혈관의 수는 34.88±8.26으로 차이는 없었다(p>0.05, Fig. 5B). VEGF와 PD-ECGF의 발현율 사이는 연관성이 없었고(p>0.05, Fig. 4C) VEGF의 저발현군에서 PD-ECGF는 48.21±19.14이고 고발현군에서는 62 ±28.01로 차이가 없었다(p>0.05, Fig. 5C).

두경부 편평세포암종에서 VEGF, PD-ECGF의 발현율 및 미세혈관의 생성정도와 임상양상 및 병리소견과의 연관성

   VEGF의 발현은 환자의 나이, 원발병소의 위치, 재발율, 병기(stage)에 따라 차이가 있었으며(p<0.05) T stage, N stage, 조직병리학적 분화도와는 차이가 없었다(p>0.05, Table 2). PD-ECGF의 발현은 환자의 나이, 원발병소의 위치, T stage, 병기에 따라 차이가 있었으며(p<0.05) N stage, 조직병리학적 분화도, 재발율에는 차이가 없었다(p>0.05, Table 3). CD-31의 발현은 환자의 나이, N stage, 병기에 따라 차이가 있었고(p<0.05) 원발병소의 위치, T stage, 조직병리학적 분화도, 재발율과는 차이가 없었다(p>0.05, Table 4).

고     찰

   종양의 발달, 증식, 전이에 신생혈관 형성과정은 필수적이다.¹⁾ 또한 종양의 신생혈관은 정상혈관보다 혈관벽이 약하여 보다 쉽게 암세포가 침습할 수 있어 림프절 전이의 통로가 될 수 있으므로 신생혈관의 형성은 암세포의 성장과 전이에 중요하다.¹⁰⁾ Folkman 등¹¹⁾이 종양의 성장과 혈관의 수가 밀접하게 연관된다는 것을 처음으로 밝히고 혈관형성에 관여하는 tumor angiogenesis factor(TAF)를 악성종양에서 추출한 이후 fibroblast growth factor(FGF), angio-genin, TGF-α, TGF-β, tumor necrotic factor α(TNF-α), VEGF, PD-ECGF, granulocyte colony-stimulating factor, placental growth factor, interleukin-8, hepatocyte growth factor, proliferin 등의 혈관 생성인자가 밝혀졌다.³⁾ 이러한 혈관 생성인자 중에서 VEGF는 혈관내피세포에 선택적으로 작용하는 성장인자로 121, 165, 189, 206 아미노산을 가진 4개의 이형체로 이루어져 있으며 이중 VEGF121, VEGF165만이 확산성을 가지며 세포외로 분비되어 기능을 하는 것으로 알려져 있다.¹²⁾ 이는 저산소 상태에서 분비가 촉진되며 악성신경교종에서 혈관내피세포의 증식을 유발함이 밝혀진 후¹³⁾ 여러 조직에서 VEGF의 발현이 보고되었고⁶⁾ 실험적으로 암세포 배양시 혈관내피세포의 증식에 중요한 역할을 함이 밝혀졌다.⁴⁾ 이후 식도암, 소세포폐암, 유방암, 갑상선암,⁴⁾ 자궁경부암, 두경부암⁵⁾에서 신생혈관과 연관성이 있다고 보고되었다.
   PD-ECGF는 혈소판에서 처음 분리되어졌으며¹⁴⁾ 최근에 핵산의 대사과정에 관여하는 dThdPase와 동일함이 밝혀졌다.¹⁵⁾ 이는 in vitro에서 내피세포의 화학주성에 관여하며 in vivo에서는 신생혈관형성에 관여한다.¹⁶⁾ 또한 식도암, 갑상선암, 두경부암¹⁷⁾에서 신생혈관형성과 연관성이 있다고 보고되었다.
   본 실험에서도 두경부 편평세포암종에서 VEGF의 발현율과 미세혈관의 수가 정상조직보다 높았고, VEGF의 발현율과 미세혈관의 생성정도간에 연관성이 있었으며, VEGF의 저발현군과 고발현군 사이의 미세혈관의 생성정도도 차이를 보여 신생혈관 형성에 VEGF가 관여함을 알 수 있었다. PD-ECGF도 두경부 편평세포암종에서 발현율이 높고, 미세혈관의 생성정도와도 연관성이 있었으나, 저발현군과 고발현군 사이에서는 차이를 보이지 않아 VEGF가 신생혈관 형성에 더 직접적 관계가 있음을 알 수 있었다. 그리고 VEGF와 PD-ECGF의 발현율 사이에는 일정한 상관관계가 없어 서로간의 억제 또는 상승작용은 없는 것을 알 수 있었다.
   최근 미세혈관의 생성정도 및 신생혈관형성인자와 종양의 임상소견과의 연관성에 관하여 연구가 이루어지고 있는데 미세혈관의 생성정도는 림프절 전이,¹⁷⁾ 임상적 병기, 생존율, 방사선치료의 효과¹⁸⁾와 관련성이 있다고 보고되었다. VEGF는 림프절 전이, 조직학적 분화도, 재발율,¹⁹⁾ 생존율과의 연관성이, PD-ECGF는 TNM 병기, 종양의 위치⁵⁾ 등과 연관이 보고되었다.
   본 실험에서 임상소견과의 비교에서는 환자의 연령이 낮을수록, 성문암보다는 하인두암에서, 원발종양의 크기가 크고 임상적 병기가 높을수록 VEGF, PD-ECGF의 발현율이 높아 이들이 임상적인 소견과 관련이 있음을 알았다. 특히 VEGF의 발현율은 재발율과도 관련이 있어 VEGF가 임상적인 예후 판정에 더 중요함을 알았다. 미세혈관의 생성정도는 림프절 전이와 연관을 나타내어 림프절 전이의 가능성을 나타내는데는 VEGF, PD-ECGF의 발현보다는 미세혈관의 생성정도가 더 중요함을 알았다.
   최근에는 이러한 신생혈관생성인자를 저해하는 약제를 항암제로의 사용 가능성에 대한 연구가 진행 중에 있으며 몇 가지 약제에 대해서는 실제로 종양의 성장을 저해하는 것으로 밝혀져 새로운 항암제 개발에 대한 기대가 모아지고 있다.²⁰⁾

결     론

   두경부 편평세포암종 26예와 6예의 정상 후두조직에서 VEGF, PD-ECGF, CD-31항체를 이용한 면역조직화학적 검사를 시행하여 두경부 편평세포암종에서 VEGF, PD-ECGF가 신생혈관의 성장과 연관성을 가지며 종양의 성장에 관여함을 알 수 있었다. 그리고 향후 예후추정인자로서 VEGF, PD-ECGF의 발현율과 신생혈관의 생성정도에 대한 연구가 더 많이 필요하겠다.

1. Folkman J. What is the evidence that tumors ard angiogenesis-dependent? J Natl Cancer Inst 1990;82:4-6.

2. Zatterstorm UK, Brun E, Willen R, Kjellen E, Wennerberg J. Tumor angiogenesis and prognosis in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck 1995;17:312-8.

3. Michelel R, Susan LJ, Prudence AES, Stephen F, Kenneth S, Russell L. Expression of the angiogenic factor. Vascular endothelial cell growth factor, acidic and basic fibroblast growth factor, tumor growth factor β-1, platelet-derived endothelial cell growth factor, placenta growth factor, and pleiotrophin in human primary breast cancer and its relation to angiogenesis. Cancer Res 1997;57:963-9.

4. Viglietto G, Maglione D, Rambaldi M, Cerutti J, Romano A, Trapasso F. Upregulation of vascular endothelial growth factor and downregulation of placenta growth factor associated with malignancy in human thyroid tumors and cell lines. Oncogene 1995;11:1569-79.

5. Tatsuya F, Yuji T, Suminori A, Tsutomu M, Yutaka H, Kazutaka M. Expression of thymidine phosphorylase and vascular endothelial cell growth factor in human head and neck squamous cell carcinoma and their different characteristics. Cancer 1999;85:960-9.

6. Horak E, Leek R, Klenk N, Lejeune S, Smith K, Stuart N. Angiogenesis, assessed by platelet/endothelial cell adhesion molecule antibodies, as an indicator of node metastasis and survival in breast cancer. Lancet 1992;340:1120-4.

7. Murray JD, Carlson GW, McLaughlin K, Pennington M, Lynn M, De-Rose PB, et al. Tumor angiogenesis as a prognostic factor in laryngeal cancer. Am J Surg 1997;174:523-6.

8. Ferrara N, Winer J, Burton T. Aortic smooth muscle cells express and secrete vascular endothelial growth factor. Growth Factors 1991;5:141-8.

9. Stephen BF, Amir M, Mark W, Helen T, Roy B, Kevin CG. Platelet-derived endothelial cell growth factor/Thymidine phophorylase expression in normal tissue: An immunohistochemical study. J Pathol 1995;176:183-90.

10. Folkman J, Watson K, Ingber D, Hanahan D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 1989;339:58-61.

11. Folkman J. Growth and metastasis of tumor in organ cultures. Cancer 1963;16:453-67.

12. Houck KA, Ferrara N, Winer J, Cachianes G, Li B, Leung DW. The vascular endothelial growth factor family: Identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA. Mol Endocrinol 1991;3:1806-14.

13. Plate KH, Breier G, Weich HA. Vascular endothelial growth factor is a potential tumor angiogenesis factor in human glioma in vivo. Nature 1992;359:845-8.

14. Ishikawa K, Miyazono U, Hellman H, Drexler C, Wernstedt K, Hagiwara K. Identification of the angiogenic activity and cloning and expression of platelet-derived endothelial cell growth factor. Nature 1989;338:557-62.

15. Sumizawa T, Furukawa T, Haraguchi M, Yoshimura A, Takeyasu A, Ishizawa M. Thymidine phosphorylase activity associated with platelet-derived endothelial cell growth factor. J Biochem 1993;114:9-14.

16. Haraguchi M, Miyadera K, Uemura K, Sumizawa T, Furukawa T, Yamada K, et al. Angogenic activity of enzymes. Nature 1994;368:198

17. Fujieda S, Sunaga H, Tsuzuki H, Tanaka N, Saito H. Expression of platelet-derived endothelial cell growth factor in oral and oropharyngeal carcinoma. Clin Cancer Res 1998;4:1583-90.

18. Ulf KZ, Eva B, Roger W, Elisabeth K, Johan W. Tumor angiogenesis and prognosis in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck 1995;17:312-8.

19. Roselle J, Eisma BS, Jeffrey DS, Donald LK. Vascular endothelial growth factor expression in head and neck squamous cell carcinoma. Am J Surg 1997;174:513-7.

20. Takano S, Gately S, Neville ME, Herblin WF, Gross JL, Engelhard H. Suramin: An anticancer and angiosuppressive agent, inhibits endothelial cell binding of basic fibroblast growth factor, migration, proliferation, and induction of urokinase-type plasminogen activator. Cancer Res 1994;54:2654-60.