교신저자：류준선, 780-714 경북 경주시 석장동 1090-1번지  동국대학교 의과대학 경주병원 이비인후과학교실
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서     론

   두경부편평세포암에서 경부전이의 유무나 크기 등의 경부림프절 상태는 환자의 치료방침과 예후를 결정하는데 가장 중요한 인자이다. 예를 들어 원발부위 동측의 한 개의 림프절 전이의 존재는 생존률을 50% 이상 낮춘다고 알려져 있다.¹⁾ 이러한 경부전이를 조기에 발견하기 위한 고식적인 방법으로, 과거부터 이학적 검사를 비롯하여 초음파나, 전산화 단층촬영, 자기공명영상, 또는 조직검사를 통한 병리적 지표 등을 이용하였으나, 수술후 재발 등 예후에 관계되는 잠복전이를 조기에 발견하는 데는 만족할만한 성적을 올리지 못한 것이 사실이고, 가장 정확하다고 알려져 있는 초음파에 의한 세침흡입검사의 예민도도 76%이상은 넘지 못한다고 알려져 있다.²⁾ 최근 분자생물학의 발달로 경부전이나 예후와의 상관관계를 밝히려는 연구가 활발히 진행중이나, 아직까지는 종양의 성장과 전이가능성의 정도를 정확히 반영하여 두경부편평세포암의 경과를 예측할 수 있는 유용한 형태학적, 혹은 세포학적 지표는 발견되고 있지 않는 상태이다.
   종양세포가 다른 장기로 전이하기 위해서는 여러 장벽들을 돌파하고, 여러 cytokine이나 성장인자(growth factor)들과 상호반응을 해야 하는데 그러한 과정이 시작되고 진행하기 위해서는 맥관형성(angiogenesis)이 필수적이다.³⁾ 여러 연구에서 맥관형성으로 종양의 생태를 분석하는 첫 번째 이유는 바로 종양의 성장에는 그 종양에 대한 혈액공급이 가장 중요한 역할을 한다는 사실에 기초를 두고 있다. 정상적으로 혈관신생은 개체형성, 생식, 상처수복 등 제한된 경우에서만 관찰되며, 그것도 제한된 기간동안만 일어나고 자가 조절되는 특징을 가져 성인에서는 거의 정지해 있는 것처럼 보이는데 당뇨병성 망막증, 관절염, 건선 등은 병적인 상태에서 증가된 맥관형성의 좋은 예들이다. 만일 이러한 혈관신생이 없다면 종양은 일정크기 이상 자라지 못하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ 맥관형성을 중요하게 생각하는 두 번째 이유는 종양자체의 성장뿐 아니라 종양의 국소, 원격전이에도 필수적인 요건이 된다는 사실이다. 종양세포가 림프절로 전이하는 기전은 종양세포가 직접 림프관으로 침범할 수도 있지만, 주로 혈행내에 있는 종양세포들이 림프관-정맥 접합부위를 통해서 림프관으로 들어가는 것으로 설명되고 있다. 종양에서의 혈관신생은 종양의 크기를 증가시켜 종양세포-림프관의 접촉을 늘리고 결과적으로 림프관-정맥 접합부위의 숫적 증가를 가져와서 림프계로 들어가는 미세전이의 빈도를 증가시킨다.⁵⁾ 현재까지는 미세혈관과 림프관을 구분하는 표식자는 없으나 염료주사 등을 통하여 관찰한 결과 종양조직 내에는 림프관들이 없다고 보고되고 있다.⁶⁾ 즉, 종양의 전이에도 림프관의 증가보다는 미세혈관의 숫적증가가 가장 중요한 역할을 한다는 것이다.
   이렇게 종양의 성장과 전이에 중요한 맥관형성의 정도를 알아보기 위해 혈관내피세포에 존재하는 물질에 대해 면역조직화학염색을 하는 것이 최근에 여러 부위의 암종에 대하여 연구되고 있고, 모든 내피세포에 반응하는 항체로 factor VIII related Ag, CD-31, CD-34, CD-36 등이 사용되고 있다. 이중 본 연구에 사용된 CD-31은 내피세포접착분자(endothelial cell adhesion molecule) 또는 혈소판-내피세포접착분자(platelet/endothelial cell adhesion molecule) 등으로 불리는 것으로, 이에 대한 JC/70A 항체는 여러 연구에서 가장 예민하고 위음성이 적은 표식자로 알려져 있다.⁷⁾⁸⁾ 흑색종, 유방암, 폐암, 전립선암 등에서는 일찍부터 이런 신생혈관형성에 대한 표식자를 찾기 위한 연구가 진행되었으며, 실제로 미세혈관밀도(microvessel density)와 원격전이, 생존율 등 여러 임상적인 지표들과 상당한 관계가 있음이 밝혀졌고,^3)6)7)8)9) 국내에서도 폐의 편평세포암에서 미세혈관농도가 병기에 따라 증가한다는 보고가 있었다.¹⁰⁾ 반면 두경부암 영역에서는 최근들어 연구가 활발하게 진행중이나, 그 결과가 아직까지는 일정치 않다.
   본 연구에서는 미세혈관밀도 이외에 종양의 성장속도와 연관있는 세포증식을 알기 위한 지표로서 Ki67항원에 대한 면역화학염색과, DNA 유세포계측(flowcytometry)에 의한 DNA index, proliferation index 등을 시행하였으며, 종양억제 유전자인 p53의 변이발현정도에 대한 면역화학염색도 함께 시행되었다. Ki67은 분열중인 세포에서만 검출되는 기능이 알려지지 않은 단백질로 여러 종양에서 의미 있는 예후인자가 될 수 있음이 보고되고 있다.¹¹⁾¹²⁾ 변이형 p53단백질은 긴 반감기를 가지고 있어 종양세포의 핵에 축적되며 이것의 발현율 역시 종양의 발생, 성장과 밀접한 연관이 있다는 보고가 있다.¹³⁾ 
   본 연구의 목적은 첫째로 미세혈관밀도로 대별되는 맥관형성의 정도가 경부림프절 전이를 예측할 수 있는가를 보는 것이고, 둘째는 현재까지 나온 고식적인 지표인 조직학적 분화의 정도와 최근에 등장한 분자생물학적 지표들인 면역조직화학적 여러 표식자들과 DNA 유세포계측의 결과들과 함께 비교하여 그 상대적 유용성을 알아보고자 하는 것이다.

대상 및 방법

대  상
   대상조직으로는 1995년 9월부터 1997년 2월까지 조직검사상 두경부편평세포암으로 진단 받은 26예의 파라핀포매조직을 사용하였다. 먼저 환자 분포를 보면 남자가 22예, 여자가 4예 였으며 연령분포는 39세에서 69세로 평균연령은 58.2세 였다. 이중 22예는 경부곽청술 등을 포함하여, 외과적 절제를 받았던 경우이고, 4예는 원발부위에서 조직검사만 시행하고, 항암치료, 방사선치료를 시행한 환자였다. 이중 조직검사 당시 경부전이가 있었던 경우와 없었던 경우는 각각 12예와 14예였다. 대상이 되었던 환자들 중 이전에 치료를 받고 재발한 경우는 제외하였다. 원발부위별로 보면, 후두가 가장 많아 13예였고, 구강암 5예, 구인두암 5예, 하인두암 2예, 상악동암 1예였다. 이중 2명의 환자는 식도암과 함께 병발한 이중원발병소를 가진 환자였다.
   원발부위의 절제수술 및 경부곽청술을 실시한 경우에는 절제조직 및 전이림프절의 상태를 병리적 병기에 의해 분류하였으며, 수술을 받지 않고 항암치료, 방사선치료를 한 경우에는 이학적 검사 및 단층촬영, 자기공명영상 등의 방사선영상에서 나타난 임상적 병기를 사용하였다.
   이후 각 검사는 파라핀 포매조직에서 조직학적으로 괴사나 섬유화가 없는, 전형적인 종양세포가 관찰되는 부위를 선별하여 시행하였다.

조직학적 분화도
   육안에 의한 종양의 분화정도는 세포간교각(intercellular bridge)의 관찰 정도, 각질진주(keratin pearl)의 형성 유무, 세포의 개별각질화(individualized keratinization)의 유무 등 3가지 주요 소견을 기초로 하고, 모두 관찰될 때에는 고분화암(well-differentiated), 하나도 없을 때에는 저분화암(poorly-differentiated)으로 한 두개만 관찰될 때를 중등도분화암(moderately-differentiated)으로 분류를 하였고, 세포극성(cellular polarity)의 유지, 핵-세포질 비율(nucleus-cytoplasm ratio) 등은 보조적인 소견으로서 참고하였다.

면역조직화학검사(Immunohistochemical staining)

미세혈관밀도(Microvessel density)
   우선 10%의 중성 포르말린에 고정된 파라핀포매조직을 4 μm 두께로 박절하고 슬라이드에 부착한 후 56의 보온기에서 30분간 처리한 후 xylene으로 3~5분간 탈파라핀화 시킨다. 그 다음 100%, 95%, 80%, 70%, 50%의 알코올에 각각 1시간씩 처리한 후 다시 증류수로 함수화 과정을 거친다. 그후 proteinase로 digestion시킨 후 0.1 mol/L Tris-buffered saline으로 씻어낸다. 전처치는 탈파라핀화 후, citrate buffer(pH 6.0)로 전자렌지에 5분씩 2회(900W) 처리하였다. 일차항체는 CD-31 mouse monoclonal antihuman antibody(JC/70A, Dako, Denmark)을 1：20으로 희석시켜 실온에서 1시간 동안 반응시키고 이차적으로 biotinylated link antibody를 가하여 20분간 반응하였다. 그후 streptoavidin을 20분동안 반응 시킨 후 Diaminobenzidine substrate(DAB)와 H₂O₂를 가하여 발색시켰다. 판독은 Shpitzer 등의 방법³⁾을 응용하여 사용하였으며, 저배율(40, 100)에서 탐색하여 가장 혈관신생정도가 큰 3곳을 선정하여 2명의 검사자에 의해 200배 배율에서 계수 되었다(Fig. 1). 계수시에는 환자에 대한 임상적 병기에 대한 정보를 전혀 모르는 상태에서 실시하였으며, 대표값은 3번 측정한 값 중 가장 큰 값들의 평균으로 하였다. 대조군으로 염색한 후두점막을 미리 관찰하고 두 검사자는 혈관계수에 대한 기준을 미리 협의하여 일관성 있는 계수를 할 수 있게 하였다. 즉, 주변의 미세혈관이나 종양세포, 결체조직들로부터 구분되는 내피세포의 군(cluster)도 내강이 없더라도 하나의 미세혈관으로 계수 되었고 계수에서 제외되는 혈관은 정상으로 간주되는 두꺼운 근육층과 큰 내강을 가진 것들이었다. 측정 부위에 따라 혈관의 분포는 많은 차이가 있었고, 가장 혈관이 많이 관찰되는 부위는 주로 종양조직과 정상조직의 경계부위였다. 또한 주변에는 염증세포들이 함께 많이 관찰되었다.

Ki67, p53 면역화학염색
   CD-31염색과 같은 방법으로 시행되어졌으며 일차 항원의 희석배율만이 약간 차이가 있었다. 즉, Ki67에 대한 rabbit polyclonal antibody(Dako, Denmark)는 1：100으로 희석되었으며, p53에 대한 mouse monoclonal antibody(Zymed Lab Inc., Sanfrancisco, USA)는 1：80으로 희석되었다. 결과로 사용한 전체적으로 관찰되는 세포수 중 갈색으로 염색되는 세포들의 빈도인 Ki67 labelling index(%)는 image analyzer(IBAS, Zeiss)를 이용하여 측정하였고 Ki67 labelling index가 0~25%를 (＋), 25~50%를 (＋＋), 50% 이상을 (＋＋＋)로 판정하였다. p53 염색정도는 image analyzer를 이용하지 않고 한 사람의 관찰자에 의해 육안으로 관찰한 염색된 세포의 빈도를 %로 나타내었으며, 염색된 세포가 40%이상 관찰될 때 양성으로 판정하였다.

DNA 유세포계측(DNA flowcytometry)
   Single cell suspension을 만들기 위해 먼저 파라핀 블록으로부터 50 μm 두께의 절편을 두세개 얻는다. 그후 xylene에 30분 정도, dry oven에서 두 번 처리하여 파라핀을 제거한 후 무수 및 95% ethyl alcohol에 각각 30분씩 두차례 처리한 후 80%, 70%, 50% ethyl alcohol의 순서대로 30분씩 처리하여, 조직을 함수 시킨다. 다음으로 PBS(phosphate buffered saline)에서 homogenizer를 이용하여 mincing하는 과정을 거친다. polypeptide bond를 끊기 위해 미리 37 수조에 넣어 따뜻하게 해둔 0.5% pepsin(pH 1.5)을 2.5 cc 첨가하여 항온기에서 수시로 흔들어주며 30분간 유지한다. 다음으로 2000 rpm으로 10분간 침전시킨 후, pepsin을 버리고 PBS로 10분씩 두번 더 원침-수세한다. 이 용액을 53 μm의 pore size를 가진 Nylon mesh로 걸러 hemocytometer로 세포수를 검사하여 1×10 6 개/ml가 되는지를 확인한 후, trypsin 250 μl(solution A)로 세포질을 제거하고, RNase＋trypsin inhibitor 200 μl(solution B)를 첨가하여 15분간 냉장(4) 암실방치를 한후 마지막으로 propidium iodide 200 μl/ml(solution C)를 첨가한다. 다음으로 알루미늄 호일로 싸서 12시간 이상 방치시킨 염색된 세포를 유세포 측정기(Becton dickinson, USA)로 측정한다.
   DNA 유세포계측으로 구한 지표로는 DNA를 정량화 하여 나타낸 DNA index와 세포분열의 정도를 보는 proliferation fraction(%, G1, S, G2, M/G0, G1, S, G2, M), S-phase fraction(%, S/G0, G1, S, G2) 세가지 였다. 이때 정상 G0/G1 peak의 대조군은 기계적인 참고치인 DNA QC particle을 사용하였다. DNA index가 0.95에서 1.05사이의 값일 때는 이배수성(diploidy)으로 그 이외의 값은 비배수성(aneuploidy)군으로 분류하였다.

통계학적 분석
   단변수분석은 변수의 성질에 따라 χ² 검정, 또는 t-test를 사용하였으며 다변수 분석은 logistic regression을 사용하여 통계학적인 유의성을 검정하였다. 분석에 사용된 software는 standard SPSS(Version 7.5, Statistical Package for Social Sciences, Chicago, Ill.)였다.

결     과

조직학적 분화도와의 상관관계
   경부전이가 있었던 군과 없었던 군에 대해서 각각의 지표가 통계학적 차이가 있는지를 알아보았다. 조직학적 분화도는 경부전이가 있는 군에서 분화도가 떨어지는 경향은 있었으나 통계학적인 의미는 없었다(Table 1).

CD-31, Ki67, p53, DNA 유세포계측과의 상관관계
   CD-31에 대한 염색정도, 즉 미세혈관밀도는 t-test로 경부전이가 있는 군과 없는 군을 비교하였으며, 통계학적으로 의미 있는 상관관계는 보이지 않았다(Table 2). CD-31을 제외한 나머지 검사에서는 1명의 환자에 대한 결과가 누락되어 총 25명의 환자에 대해서만 분석을 실시하였다. Ki67과 p53 염색의 정도, DNA index에 의한 ploidy 에 대해서는 χ² 검정을 시행하였으며 어느 지표도 경부전이 상태와 유의한 상관관계를 보이지 않았다(Table 3, 4 and 5).
   Proliferation index, S-phase fraction에 대해서는 t-test로 경부전이가 있는 군과 없는 군에서의 평균을 비교하였으나, 유의한 통계적 의미를 나타내는 지표는 없었다(Table 6).
   각각의 지표들을 logistic regression을 사용하여 다변수 분석을 하였을 때 경부전이 상태와 의미 있는 관계를 보인 지표는 없었다(Table 7).

후두암 환자에서의 각 지표들의 상관관계
   대상환자들 중 가장 빈도가 높았던 후두암 13예에 대해서만 비모수적 통계 분석을 해보았을 때, 여러 지표들 중 미세혈관밀도만이 경부전이상태와 통계적으로 의미있는 상관관계가 있었다(Table 8, Fig. 2).

고     찰

   종양의 성장과 전이에 중요한 역할을 하는 맥관형성의 과정은 매우 복잡하며 내피세포와 세포외 간질(extracellular matrix)의 상호작용에 의해 일어난다. 먼저 모혈관의 기저막이 collagenase나 metalloproteases, plasminogen activators, vascular permeability factors 등에 의해 분해되고 이를 통해 내피세포들이 혈관 밖으로 빠져나가(endothelial migration) 원시혈관(premature vessel)을 형성하며, 이 내피세포들이 길어지면서, canalize 하여 신생혈관의 내강을 형성하고 기저막성분이 혈관 주위에 침착하면서 지지세포(pericytes)가 만들어져 성숙된 모세혈관 망(capillary network)이 완성되게 된다. 종양의 경우에는 이러한 맥관형성이 더 활발하게 일어나는데 그 기전으로는 종양에서 분비된 혈관신생 인자(angiogenic factors)에 의한 직접적인 효과와, 종양에 의해 유도되어 숙주에서 일어나는 혈관신생의 두가지 기전으로 설명할 수 있다. 이 과정에 관여하는 물질로는 angiogenin, 산성 및 염기성 섬유아세포 성장인자(acidic and basic fibroblast growth factor), 변형성장인자(transforming growth factor)a 및 β 등의 폴리펩티드계 성장인자와 cytokine 등이 알려져 있다. 이러한 맥관형성의 정도를 보는 미세혈관에 대한 면역염색 방법으로는 여러 가지가 있지만, 본 연구에 사용된 CD-31에 대한 JC/70 Antibody가 현재까지 나온 표지자 중 가장 예민하고 위음성이 적은 염색방법으로 알려져 있다.⁷⁾⁸⁾ 하지만 정상혈관의 내피세포와 종양에 의해 유도된 맥관형성(tumor induced neovascularization)과의 구분, 다시 말해서 염색된 내피세포가 정지상태인지 또는 분열, 증식중인 내피세포인지의 구분은 불가능하다. CD-31은 섬유아세포나 종양세포의 일부, 형질세포 등에 어느 정도 교차반응을 하기 때문에, 특히 염증을 동반한 종양에서는 factor VIII에 비해 정확한 미세혈관 계수를 어렵게 한다는 점도 지적되어 있다.⁴⁾ 임상적으로 두경부편평세포암 이외에 다른 장기의 암종에서 맥관형성과 전이에 관한 연구는 비교적 일찍부터 시행되었고, 유방암과 대장암 등에서는 이미 관련성이 증명되었다. 전립선암의 경우 Wakui 등은 BCDR(blood capillary density ratio)로 표시된 맥관형성이 골전이가 있는 경우에 증가되어 있음을 보고하였고,⁹⁾ Weidner 등은 전이가 된 경우에서는 평균 미세혈관밀도가 전이가 없는 경우보다 의미있게 높았음을 보였다.⁵⁾ Bosari 등⁶⁾과 Horak 등⁸⁾은 유방암에서 혈관신생의 정도가 유세포계측(flowcytometry), p53에 의한 분석과 비교했을 때 원격전이에 대한 더 우수한 예측인자가 된다고 보고하였으며 재발 등 환자의 예후에도 관련이 있음을 보였다. 폐암의 경우 Kim 등¹⁰⁾은 미세혈관밀도가 원격전이의 독립적인 예측인자가 될 수 있음을 보고한 바 있다. 반면 두경부종양에 대한 혈관신생과 원격전이에 관한 연구는 비교적 최근에 들어서야 활발히 이루어지고 있지만, 결과는 아직 일정치 않다. Gasparini 등⁷⁾은 항암치료나 방사선치료를 받은 두경부 편평세포암환자 70명을 대상으로 CD-31으로 맥관형성에 대한 연구를 하여 미세혈관이 200배 배율에서 25개 이상 관찰되는 경우에 국소 또는 원격전이의 가능성이 현저하게 올라간다고 하였으며, Williams 등¹⁴⁾은 구강저, 설암 환자에서 종양의 맥관형성이 향후 림프절전이의 예측인자가 될 수 있다고 하였다. 또한 Shpitzer 등³⁾은 T1병기의 설암환자만을 대상으로 추적관찰 도중 경부림프절 전이가 있었던 10명과, 없었던 10명의 수술조직 사이에 미세혈관밀도가 유의한 차이가 있었음을 보고하였다. Albo 등의 보고¹⁵⁾에서도 원발종양의 조직학적 분화도와 임상경과와는 관계가 없었고 미세혈관밀도만이 영향을 주는 인자였다. 반면 Leedy 등¹⁶⁾은 역시 설암에서 전이가 있던 경우와 없었던 경우 사이에 혈관신생에 있어서의 유의한 차이를 보이지 않았다고 하였다.
   본 연구에서 두경부편평세포암 전체를 놓고 비교를 해 보았을 때는 어떠한 임상적 지표도 통계학적인 의미를 나타내지 않았지만, 후두암 환자 13예만을 따로 분석해 보았을 때 미세혈관밀도만이 유일하게 경부전이와 연관이 있는 인자라는 결과가 나왔다. 이는 두경부편평세포암이라는 이질적인 집단에서 혈관분포의 정도는 같은 종양 내에서도 일정치가 않을 뿐더러 원발부위마다 혈관분포와 연관이 있는 종양 특이적인 성질을 가지고 있기 때문으로 추측된다. 본 연구에서는 또한 경부전이의 다른 중요한 인자인 원발종양의 크기나 두께 등은 고려하지 않았다는 것이 보완점으로 지적될 수 있다. 이러한 인자들을 모두 고려하고 다음으로는 장기간의 추적관찰을 통하여 종양의 재발여부와, 치료반응에 대한 연구가 더 진행되어야 할 것이다. 실제로 Williams 등¹⁴⁾과 Albo 등¹⁵⁾은 두경부 악성종양으로 치료 후 추적 관찰 하는 동안 미세혈관밀도가 컸던 환자일수록 전이와 재발의 빈도가 높았다는 것을 보고한 바 있다. 대체적으로 보면, 맥관형성이 전이와 어느 정도의 연관을 가지고 있지만 연구 대상선정에 따라 미세혈관밀도와 임상경과 사이에는 일정치 않은 결과를 나타내고 있는 셈이다.
   종양생물학에 중요한 세포분열의 정도를 보기 위한 방법으로, 유사분열(mitosis)을 현미경상에서 직접 계수하는 방법이나, ³H-thymidine labelling, 유세포계측 등을 사용되고 있는데, 이런 방법들은 일반적으로 많은 양의 검체와 비싼 장비가 필요하고, 시간적인 낭비도 많다. 최근들어서는 면역조직화학염색법으로 세포분열을 정량화 하는 방법들이 활발히 진행중인데 그 표적이 되는 항원에 따라 DNA polymerasea, topoisomeraseIIα, PCNA(proliferating cell nuclear antigen), Ki67, p105 및 JC1 등이 있는데, 이중 본 실험에 사용된 Ki67은 345k Da이나 395k Da의 분자량을 가지고 있으며 아미노산 서열이 현재까지 알려진 세포주기 관련 단백질들과 상동성을 보이지 않고, 그 기능 또한 알려져 있지 않다. 가장 흔히 사용되고있는 PCNA와 비교할 때 ³H-thymidine labelling index와 더 좋은 상관관계를 보이며 또한 악성 임파종, mammary carcinoma 등의 종양에서는 의미있는 예후인자가 된다고 알려져 있다.¹¹⁾ 
   두경부암 영역에서 증식표지자(Proliferation marker)와 예후에 관한 연구는 많이 이루어지지는 않았으나 Lrz 등¹⁷⁾은 Ki67 labelling index가 PCNA와 함께 편평세포암의 조직분화도와 밀접한 연관이 있다고 보고하였고, Welko-borsky 등¹²⁾은 40명의 후두암환자 에서 수술후 평균 37개월간 추적관찰 하여 재발여부를 관찰한 결과 Ki67 score, PCNA, 조직학적 분화도가 관련이 있는 것으로 보고했다. 하지만 본 연구에서는 경부의 전이상태와 Ki67 labelling index 사이에는 유의한 상관관계를 보이지 않았다.
   p53은 17번 염색체의 단완에 위치하며, 핵의 DNA에 결합하여 전사인자(transcription factor)로 작용하는 nuclear phosphoprotein의 합성과 연관이 있는 기능을 하는 유전자로서, 종양에서는 돌연변이에 의해 p53 단백질의 DNA결합과 전사조절능력이 소실된다고 알려져 있다. 두경부암 영역에서도 p53 과표현과 암의 발생과의 관계는 계속 연구되고 있으며, p53의 과표현이 두경부편평세포암의 전이와 연관이 있다는 보고¹³⁾도 있었으나, 본 연구에서 p53의 발현율은 경부전이와 직접적 관계가 없었으며, 기존의 다른 예후 인자들과 독립적인 요소로 생각하는 추세이다.
   본 연구에서 사용된 CD-31, Ki67, p53 등 면역조직화학염색이 공통적으로 가지고 있는 가장 큰 단점은 검사결과의 판독이 주관적이기 때문에 검사자마다, 혹은 부위마다 측정수치에 있어서 차이가 많다는 점이다. 따라서 임상적으로 유용하게 쓰이기 위해서는 우선 정량화와 표준화가 되는 것이 급선무라고 할 수 있겠다.
   유세포계측을 이용한 DNA의 분석은 많은 수의 세포를 정확하고 빠르게 측정할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 두경부 영역에서는 Wolf 등이 후두편평세포암에서 비배수(aneuploidy)로 나타난 경우에서 경부전이의 확률이 유의하게 올라감을 보고¹⁸⁾한 적이 있으나, 역시 후두암에서 환자의 임상경과와 별 관련이 없다는 보고¹⁹⁾도 있어, 실제 이를 통한 종양세포의 분석결과는 논란이 많다. 본 연구에서도 유세포계측으로 구한 지표인 DNA index, prolifera-tion index와 S-phase fraction의 세가지 모두 경부전이상태와 통계학적으로 유의한 상관관계가 없었다. 이렇게 보고들마다 차이가 나는 가장 중요한 이유는 DNA 유세포계측은 측정되는 세포들의 형태적인 이질성을 인식하지 못하기 때문에 예후에 중요한 비배수 세포검체(single aneuploid cell)가 넓은 G0-G1 peak에 묻혀서 나타나지 않았다는 것이다.¹²⁾ 그 외에 결과를 해석하는데 있어서 객관적인 지표가 없다는 점, 검사 기술상의 문제도 중요한 부분을 차지한다고 할 수 있겠다. 또한 알아두어야 할 것은, DNA 이상은 같은 종양 내에서도 서로 다를 수 있고, 같은 조직형의 종양에서도 차이가 나며, 종양의 종류에 따라 각각 다르다는 것이다.
   본 연구의 중요한 목적 중의 하나는 두경부암의 원발부위의 맥관형성 정도가 경부의 잠복전이를 수술 전에 정확하게 예측할 수 있는 임상적 예측인자로서의 가능성을 확인하는 것이었고, 결과적으로 경부림프절 전이와 미세혈관밀도, Ki67, p53, DNA 유세포계측 모두 상관관계가 없었으나 후두암 환자만을 대상으로 했을 때 미세혈관 농도만이 경부전이와 연관이 있는 인자로 나타났다. 만일 향후 더 많은 대상과 부위별로, 충분한 추적관찰을 거친 결과들이 나와 유용한 예측인자로서 자리를 잡는다면, 수술전 간단한 조직검사만을 통해 환자의 예후를 정확히 예측하여, 불필요한 경부곽청술의 경우를 줄여 환자들의 수술 후 문제가 되는 합병증을 줄일 수 있겠고, 실제로 맥관형성의 억제를 시킬 수 있다면 현재까지의 항암치료의 부작용을 줄일 수 있는 새로운 항암치료제의 개발에도 박차를 가하는 계기가 될 수 있을 것이다.

결     론

   두경부에 발생한 26예의 편평세포암을 대상으로 CD-31항원으로 맥관형성의 정도와, Ki67, p53 면역화학염색, DNA 유세포계측을 통해 가장 중요한 임상적 예후인자인 경부림프절 전이와의 상관관계를 분석한 결과, 맥관형성의 정도를 나타내는 미세혈과밀도는 경부전이 상태와 유의한 상관관계를 나타내지 않았지만, 원발부위가 후두인 환자 13명만을 대상으로 분석해 보았을 때는 의미있는 상관관계를 나타내었다. 그 외 Ki67, p53 및 DNA 유세포검사에 의한 지표는 경부전이 상태와 유의한 상관관계가 없었다. 본 연구에서는 미세혈관밀도가 두경부편평세포암에서의 독립적인 예후인자로서 작용할 수 있는 가능성을 보여 주었으며 향후 더 많은 대상을 원발부위별로 따로 분석을 하고, 장기간 추적관찰을 통해 재발여부와 생존율까지 포함된 연구를 통하여 그 유용성이 증명된다면 두경부종양환자의 치료방침을 결정하는 데 큰 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.

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