| Correlations among Tumor Microvessel Density, p53 Protein Expression, and Cervical Lymph Node Metastasis in Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck. |
| Cheol Beom Lee, Sang Chul Lim, Jae Shik Cho, Jun Baik, Jae Hong Lee |
| Department of Otolaryngology and Head and Neck Surgery, Chonnam University Medical School, Kwangju, Korea. limsc@hanimail.com |
| 두경부 편평세포암종에서 미세혈관밀도, p53 단백발현, 경부림프절 전이의 상관성 |
| 이철범 · 임상철 · 조재식 · 백 준 · 이재홍 |
| 전남대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
미세혈관수ㆍp53 단백ㆍ두경부 편평세포암종. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Angiogenesis is a crucial step in tumor growth and progression, and regulated by the net balance between positive and negative angiogenic factors.
Recent studies suggested that angiogenesis is controlled by p53 regulation. immunohistochemical study was carried out using monoclonal antibodies against p53 protein and CD34. In this study, immunohistochemical study was carried out using monoclonal antibodies against p53 protein and CD34 in order to determine the relationship between p53 protein expression and angiogenesis in squamous cell carcinoma in the head and neck.
MATERIALS AND METHODS:
Tumor tissues from 35 cases of paraffin block specimens of head and neck cancers were used from the archives of Department of Pathology in Chonnam University hospital to study the relationship between p53 protein expression and angiogenesis.
RESULTS:
p53 protein expression was present in 20 (57.1%) of 35 cases and the median micro-vessel count (MVD) was 49.0 (9-126) in x200 microscopic field. MVD was 45.5 (20-126) in cases with p53 protein expression and 50.0 (9-108) in cases without p53 protein expression. There was no statistical significance between MVD and p53 protein expression. An inverse relationship was seen between MVD and primary tumor size. P53 protein expression was not associated with nodal metastasis and primary tumor size.
CONCLUSION:
There were no significant relations between MVD and p53 protein expression, nor among MVD, p53 and nodal metastasis in head and neck squamous cell carcinoma. |
| Keywords:
Microvessel densityㆍp53 proteinㆍSquamous cell carcinoma of the head and neck |
서론
p53 단백은 1970년대말 SV40 DNA 바이러스의 T항원에 결합되는 인단백질로 처음 분리되었다.1) p53 단백의 유전자는 염색체 17p13.1에 위치하며, DNA에 결합하여 DNA의 수리 및 합성, 세포분화 그리고 고사(apoptosis)에 관여한다고 알려져 있다.2)3) p53 단백의 유전자 전사에 대한 영향은 p53 유전자의 돌연변이 혹은 p53 단백과 세포성 단백 또는 바이러스성 단백과의 결합에 의하여 변할 수 있다. 변이된 p53 단백은 wild type p53 단백에 비하여 DNA에 대한 친화력이 감소되어서 정상적인 기능을 소실하여 세포증식을 유발시키고 화학적으로 안정하여 핵 내에서 축적하게 된다.4) 이러한 돌연변이된 p53은 두경부암을 포함한 거의 모든 종류의 암에서 발견되고 있다.4)
한편, 발생초기의 아주 작은 크기의 종양은 무혈관상태이나 종양의 부피가 1∼2mm 3 되면 종양세포나 침윤된 대식세포 혹은 비만세포에서 여러 혈관 형성인자를 생산하여 종양내 미세혈관을 증식시킨다. 이렇게 증식된 미세혈관은 종양의 증식과 전이에 영향을 준다고 알려져 있다.5) 최근에 Dameron등6)은 사람의 섬유아세포에 있어서 p53 정상형 대립유전자는 혈관형성을 억제하는 것으로 알려진 thrombospondin-1(TSP-1) promotor를 자극하여 정상인에서는 TSP-1 형성이 활발하게 일어나서 신생혈관 형성이 조절된다고 하였다. 반면, 암조직의 경우 p53 유전자의 돌연변이가 일어나면 TSP-1 형성이 억제되어 신생혈관 형성이 증가한다고 보고하면서 암조직내의 혈관형성이 p53 단백의 변화여부와 관련이 있다는 가설을 제기하였다.
본 연구는 두경부 편평세포암종에 있어서 종양내 미세혈관형성과 p53 단백발현의 상관성을 알아보고자 종양내 미세혈관밀도를 정량적으로 측정하고 이들을 p53 단백발현유무와 비교하였다. 아울러 이들과 기존의 예후인자중에서 경부림프절 전이유무, 원발종양의 크기와의 관계를 알아보고자 하였다.
대상 및 방법
대상
실험대상은 1990년 1월부터 1994년 12월까지 전남대학교 병원에서 두경부 편평세포암종으로 진단받고 방사선치료나 항암제치료를 받은 적이 없고 일차적으로 수술을 시행하였던 증례중에서 파라핀 포매괴의 상태가 양호한 35예를 대상으로 하였다(Table 1). 병기는 임상적 병기(TNM, AJCC, 1997)7)를 기준으로 분류하여 T1과 T2를 조기암군으로 T3와 T4를 진행암군으로 분류하였다. 경부림프절 전이 여부는 경부림프절 청소 수술후 채취된 림프절을 병리조직학적으로 확인하여 그 결과에 의해 전이군과 비전이군으로 분류하였다(Table 2).
방법
p53 유전자산물에 대한 면역조직화학적 염색
연구대상 조직의 파라핀 포매괴를 5 μm 두께로 연속 절편을 만들어 probe-on(r) 슬라이드에 부착시킨후 건조시켰다. 염색의 전 과정은 probe-on(r) 슬라이드를 맞대어 생기는 capillary gap action의 원리를 이용한 Microprobe Immuno/DNA 염색기(Fisher Co.)를 이용하였다. 파라핀절편이 부착된 슬라이드는 탈파라핀과 함수과정을 거친후 내재성 peroxidase를 억제할 목적으로 methanol과 periodic acid가 포함된 Autoblocker(Research Genetics)에 2 분간 부치시킨후 1× Automation buffer로 수세시켰다. 수세이후에는 전자레인지(TED PELLA, Inc, USA)를 이용한 과정을 거쳤다. 전자레인지를 이용한 과정은 10 mM, pH 6.0 citrate buffer가 담긴 유리상자에 함수과정을 거친 probeon 슬라이드를 넣고 이를 전자레인지에 넣어 750 w로 조절하여 7분간 가열하였다. 일차항체인 mouse antihuman cellular phosphoprotein p53(Clone：BP53.12, Zymed Laboratories, Inc, USA)를 1：50으로 희석하여 45℃에서 20분간 부치시킨후 완충액으로 씻어내었다. 일차항체의 검출을 위한 이차항체는 biotin이 부착된 anti-mouse IgG를 이용하여 7분간 부치시키고 완충액으로 씻었다. 이후에 streptavidin-horseradish peroxidase(HRP)에 10분간 작용시킨 후, 양성반응의 관찰을 위해 발색제인 3-amino-9-ethyl carbazole(AEC)을 이용하였다. Auto-hematoxylin으로 대조염색을 시행하고 crystal mount(Biomeda)로 봉입한후 현미경으로 검색하였다. p53 단백에대한 염색의 판정은 각 슬라이드에서 염색성이 가장 진한 부위를 선택하여 전체핵에서 염색된 핵의 100 분율이 5% 이상인 경우를 양성으로 하였고, 5% 미만은 정상형 단백의 검출 가능성을 배제하기 위하여 음성으로 판독하였다.7)
미세혈관에 대한 면역조직화학적 염색
전술한 p53 유전자산물에서와 마찬가지 방법으로 슬라이드를 제작하고 Microprobe Immuno/DNA 염색기(Fisher Co.)을 이용하였다.
슬라이드에 부착된 파라핀절편을 탈파라핀과 함수과정을 거친후 내재성 peroxidase를 억제할 목적으로 methanol과 periodic acid가 포함된 Autoblocker(Research Genetics)에 2분간 부착 시킨후 1× Automation buffer로 수세시켰다. 일차항체는 혈관내피세포에 있는 CD34 연관항체에 대해서 선택적으로 반응하는 monoclonal antibody against CD34(Clone QBEND-10, MONOSAN, Nether-lands)를 1：50으로 희석하여 45℃에서 20분간 부치시킨후 완충액으로 수세하였다. 이차항체로 biotin이 부착된 anti-mouse IgG를 사용하였다. AEC로 발색시켰으며 autohematoxylin으로 대조염색을 시행하고 crystal mount(Biomeda)로 봉입하였다.
면역조직화학적 염색의 판정은 CD34 연관항체에 염색되는 미세혈관의 경우, 괴사나 궤양이 있는 부위를 제외하고 저배율(×40)에서 혈관형성이 가장많은 부위 3개를 설정하여 2명이 200배시야에서 미세혈관의 수를 세어 그 평균을 구하였다. 직경이 적혈구 크기 8배이상인 혈관과 두터운 근육층을 가진 혈관은 제외하였으며 단일 내피세포와 내피세포의 집락은 내강의 유무에 관계없이 포함시켰다.
통계학적 분석
각군의 변수를 Mann-Whitney test, Chisquare test로 분석하고 p 값이 0.05 이하인 것을 의의 있는 것으로 하였다.
결과
p53 단백의 발현은 종양세포의 핵이 적갈색으로 염색되는 양상으로 나타났고(Fig. 1) 미세혈관은 혈관내피세포에 적색으로 염색되었다(Fig. 2).
p53 염색은 20예(57.0%)에서 양성이었고 15예(43.0%)에서 음성이었다. 경부림프절전이 유무에 따라서 보면 비전이군에서 50.0%, 전이군에서 60.9%로 전이군에서 높은 발현율을 보였으나 통계적 유의성은 없었다(p＝0.797). 원발병소의 병기별 발현율은 조기암군에서 50.0%, 진행암군에서 64.7%로 진행암군에서 높은 발현율을 보였으나 통계적 유의성은 없었다(p＝0.591). 비전이군과 전이군에서 원발병소의 병기별 발현율은 조기암군에서 각각 44.4%, 55.6%로 전이군에서 높은 발현을 보였으나 통계적 유의성은 없었으며 진행암군은 66.7%, 64.3%로 전이군에서 낮은 발현율을 나타냈으나 통계적 유의성은 없었다(Table 3).
CD34염색에서 측정한 중앙미세혈관수는 200배시야에서 49.0(9∼126)이었다. 비전이군에서 57.0(21∼126), 전이군에서 40.0(9∼126)로 비전이군에서 미세혈관수가 많았으나 통계적 유의성은 없었다. 원발병소의 병기별로 보면 조기암군에서는 56.5(26∼126), 진행암군에서는 35.0(9∼126)으로 원발병소가 작을때가 미세혈관수가 높았고 통계적으로 유의하였다(p＝0.033). 비전이군과 전이군에서 원발병소의 병기별로 조기암군은 비전이군 72.0(49∼126), 전이군 40.0 (26∼91)로 비전이군에서 높았으며(p＝0.034), 진행암군의 경우는 비전이군 22.0(21∼44), 전이군 40.5(9∼126)로 전이군에서 높았으나 통계적의의는 없었다(Table 4).
p53 단백발현과 미세혈관밀도와의 관계를 보면 중앙미세혈관수는 p53 단백이 발현되지 않은 예에서 50.0(9∼108), p53 단백이 발현된 예에서 45.5(20∼126)로 p53 단백이 발현되지 않은 예에서 높았으나 통계적의의는 없었다(Table 5).
고찰
암조직의 성장과정에서 종양 및 주변부위의 혈관형성은 필수적이나 아직까지 정확한 기전은 밝혀져 있지 않다. 형성된 신생혈관은 기존의 정상혈관과는 달리 혈관벽이 약하여 보다 쉽게 암세포가 침습할 수 있어 림프절 전이의 통로가 될 수 있다. 즉, 신생혈관의 형성은 암세포의 성장과 전이에 중요하다.8)
혈관형성은 신생혈관의 증식을 촉진하는 인자와 이를 억제하는 인자의 평형에 의해 조절된다. 종양의 혈관형성을 자극하는 인자로 알려진 것은 acidic fibroblast growth factor, basic fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, epidermal growth factor, transforming growth factor-α, transforming growth factor-β, platelet derived growth factor 등이다.9) 억제인자로는 trombospondin-1(TSP-1),6) angionstatin10)과 최근에 밝혀진 glioma-derived angiogenesis inhibitory factor11)등이 알려져 있다. 배아발육과정 이후에는 억제인자가 우세하여 창상치유 또는 골절치유 등의 몇몇 병적인 상황을 제외하고는 혈관형성이 억제되어 있다. 그러나, 종양에서는 억제인자의 분비는 감소하는 반면에 촉진인자의 분비는 증가하여 혈관형성이 활발하게 일어나서 종양의 국소 성장과 전이가 일어나게 된다.
Strivastava등12)이 사람의 종양에서 신생혈관의 정도가 전이가능성을 예측할 수 있다는 정량적 근거를 피부의 악성흑색종에서 처음 보고하였다. 이후에 blood group isoantigen(ABH), factor Ⅷ-related antigen, CD31, CD34 등의 혈관내피세포에서 선택적으로 발현되는 항원들을 이용하여 각 종양들의 전이능을 알아보고자 하는 연구가 진행되었다. Gasparini등13)은 CD31을 이용하여 두경부 편평세포암종에서 종양내 미세혈관수와 염색강도를 측정하였는데 림프절 전이가 있는 경우가 없는 경우보다 통계학적으로 유의하게 높음을 보고하였다. 반면에, Bossi등14)은 미세혈관밀도와 림프절전이는 전혀 상관이 없다고 하였다. 저자의 결과에서는 미세혈관수의 중앙값은 비전이군에서 높은 경향을 보였으나 통계적의의는 없었다. 원발병기(T stage)에 따른 중앙미세혈관수는 조기암군에서 진행암군보다 오히려 유의하게 높았다(p＝0.033). 이는 Hur 등7)의 연구에서처럼 병기가 올라갈수록 유의하게 미세혈관수가 높다고 하는 의견과 상반되는 것이다. 이는 Ulf등15)이 설명한대로 본 연구의 대상증례들이 각기다른 원발소, 원발종양크기, 림프절전이 정도를 가졌기 때문이라고 생각되며 동일한 원발소를 가진 종양을 대상으로 더 많은 연구가 필요하리라 생각된다.
인체의 p53 유전자는 세포주기, 전사 그리고 세포분화등의 조절을 통하여 정상적인 세포증식(cell proliferation)을 조절하는 기능을 갖고 있다.16) 또한 p53은 두가지 다른 기능으로 세포성장의 조절에 관여하는데 첫째, 비정상적인 세포증식을 억제하며, 둘째, 정상세포가 성장신호(growth simulation)에 반응하게하는 기능이 있다.17) Danova등18)은 유방암에서 시행한 연구에서 p53 단백의 표현은 관내암종(intraductal cancer)에서는 15%에서 표현을 보였으나 국소 림프절전이(regional lymph node metastasis)가 있었던 예에서는 50%에서 p53 단백의 표현을 보였다고 보고하였다. 두경부영역의 암종에서는 이와같은 변이가 일어나는 경우는 40∼60%로 모든 암종에서 일어나는 것이 아님이 알려져 있으며,16) 최근 15년간 변이가 있는 예와 그렇지 않은 예사이에 어떠한 차이점이 있는지를 알아내려는 노력이 진행되어 왔다. Gasparini등13)은 면역조직화학적 방법으로 두경부암종 70예를 분석한 결과 전이가 있는 예에서 p53 단백표현율이 의미있게 증가하였다고 보고하였다. 저자의 결과에서도 통계학적 유의성은 없었으나 p53 단백표현율은 전이군에서 60.9% 비전이군의 50%보다 높은 것을 볼 수 있었고, 원발 병소의 병기에 따른 p53 단백표현도 통계적 유의성은 없었지만 조기암군보다는 진행암군에서 약간 높게 나타났다. 또한 수술당시 진행된 병변일수록 p53 표현율이 의미있게 높은 것으로 미루어 보아 p53이 표현될 때 예후는 나쁠 것으로 추정할 수 있었다. 그러나 이와 관련된 여러 연구는 이러한 연관성에 대해서 매우 부정적인 결과를 제시하고 있는데, Hur 등7)은 p53 단백의 발현이 전이군과 비전이군사이에 유의한 차이를 보이지 않는다고 하였다. 또, Ahomadegbe등19)을 비롯한 여러 연구에서 p53 변이가 일어나면서 암이 전이 된다고 볼 수없다는데에 의견을 일치하였으며, p53 변이는 암진행과정의 초기에 결정된다고 볼 때 p53 단백발현을 단독으로 림프절 전이의 예후인자로 이용하기에는 한계가 있을 것으로 생각된다.
최근에 암조직내 혈관형성이 p53 유전자의 돌연변이 여부와 관련이 있다는 가설이 제기되고 있다. 즉, p53 유전자의 돌연변이가 일어나면 사람의 섬유세포에 있는 신생혈관의 억제인자인 TSP-1의 생성이 억제되어 신생혈관 형성이 증가되는 것으로 알려져 있다.6) 반면에 Hedge등20)은 미세혈관수와 p53의 발현이 역상관 관계를 보인다고 하였다. 본 연구에서는 p53 염색에 음성인 경우에 p53 염색에 양성인 경우에 비해 오히려 미세혈관수가 높았으나 통계적 의미는 없었다. 이는 Hedge등이 설명한대로 TSP-1이 p53에 의해서 조절되지 않거나 다른인자들에 미세혈관형성이 조절된다는 것을 의미하는 것으로 추측하였다.
결론
두경부 편평세포암종에서 p53 단백발현과 미세혈관과의 관계, 경부전이와 p53 단백발현 및 미세혈관과의 관계를 찾기위하여 두경부 편평세포암종 35예를 대상으로 하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
1) p53 단백발현과 미세혈관수는 서로 특이한 상관관계를 보이지 않았다.
2) p53단백의 발현은 비전이군과 전이군사이에 유의한 차이를 보이지 않았다.
3) 종양내 미세혈관의 평균수는 전이군과 비전이군 사이에 특이한 상관관계를 보이지 않았다.
이상의 실험결과 두경부 편평세포암종에서 p53 단백발현과 미세혈관수는 서로 관련이 없으며 p53 단백발현, 미세혈관수가 경부전이의 예후인자로 사용되기 위해서는 아직도 많은 연구가 있어야 될것으로 생각된다.
REFERENCES
1) Lane DP, Crawford LV. T antigen is bound to a host protein in SV40 transformed cells. Nature 1979;278:261-3.
2) Lowe SW, Schmitt EM, Smith SW, Osborne BA, Jacks T. p53 is required for radiation-induced apoptosis in mouse thymocytes. Nature 1993;362:847-9.
3) Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC. p53 mutations in human cancers. Science 1991;253:49-53.
4) Weidner N, Semple JP, Welch WR, Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Eng J Med 1991;324:1-8.
5) Dameron KM, Volpert OV, Tainsky MA, Bouck N. Control of angiogenesis in fibroblasts by p53 regulation of thrombospondin-1. Sceince 1994;265:1582-4.
6) Irvin DF, Jay SC, Donald EH. AJCC Cancer Staging Manual: American Joint Committee on Cancer, 5th Ed, Philadelphia: Lippincott-Raven Publishers;1997.
7) Hur KH, Choi JO, Min HK. Angiogenesis, Cellular Proliferation Index and Expression of nm23, p53 according to Lymph Node Metastasis in Supraglottic Cancer. Korean J Otolaryngol 1997;40:869-78.
8) Folkman J, Watson K, Ingber D, Hanahan D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature 1989;339:58-61.
9) Folkman J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other diseases. Nat Med 1995;1:27-31.
10) O'Reily MS, Holmgren L, Shig Y, Chen C, Rosenthal RA, Moses M, et al. Angiostatin-A novel angiogenesis inhibitor that mediates carcinoma. Cell 1994;79:315-28.
11) Van Meir EG, Polverini PJ, Chazin VR, Huang HJS, Troibolet N, Cavenee WK. Release of an inhibitor of angiogenesis upon induction of wild type p53 expression in glioblastoma cells. Nat Genet 1994;8:171-6.
12) Strivastava A, Laidler P, Hughes LE, Woodcock J, Shedden EJ. Neovascularization in human cutaneous melanoma: A quantitative morphologic and Doppler ultrasound study. Eur J Cancer Clin Oncol 1986;22:1205-9.
13) Gasparini G, Weidner N, Maluta S, Pozza F, Boracchi P, Mezzetti M, et al. Intratumoral microvessel density and p53 protein: Correlation with metastasis in head and neck squamous cell carcinoma. Int J Cancer 1993;55:739-44.
14) Bossi P, Viale G, Lee AKC, Alfano R, Coggi G, Bosari S. Angiogenesis in colorectal tumors: Microvessel quantitation in adenoma and carcinoma with clinicopathological correlations. Cancer Res 1995;55:5049-53.
15) Ulf KZ, Eva B, Roger W, Elisabeth K, Johan W. Tumor angiogenesis and prognosis in squamous cell carcinoma of the head and neck. Head & Neck 1995;17:312-18.
16) Benchimol S, Lamb P, Crawford LV, Sheer D, Shows TB, Bruns GA, et al. Transformation associated p53 protein is encoded by a gene on human chromosome 17. Somatic Cell Mol Genet 1985;11:505-9.
17) Thomas G. p53 from basic research to clinical applications. Crit Rev Oncogenesis 1992;3:257-82.
18) Danova M, Giodano M, Mazzini G, Riccardi A. Expression of p53 protein during the cell cycle measured by flow cytometry in human leukemia. Leukemia Res 1990;14:417-22.
19) Ahomadegbe JC, Barrois H, Fogel S, Le Bihan ML, Douc-Rasy S, Duvillard P, et al. High incidence of p53 alteration(mutation, deletion, overexpression) in head and neck primary tumors and metastases, absence of correlation with clinical outcome, frequent protein overexpression in normal epithelium and in early non-invasive lesions. Oncogene 1995;10:1217-27.
20) Hedge PU, Brenski AC, Caldarelli DD, Hutchinson J, Panje WR, Wood NB, et al. Tumor angiogenesis and p53 mutations. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 1998;124:80-5.
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