교신저자：정유석, 135-710 서울 강남구 일원동 50 성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과학교실
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서     론

   두경부 편평세포암종의 치료에 있어서 방사선 치료는 매우 중요한 치료방법으로서 널리 사용되고 있다. 방사선 치료에 대한 개개 종양의 치료결과는 비슷한 임상양상의 종양에서도 다양한 경과를 보이는 경우가 빈번히 있다. 대부분의 조기암 환자의 경우 방사선 조사 후 완전히 치료되나 일부 환자의 경우 방사선 치료에 반응을 잘 안하여 치료에 실패하기도 한다. 반면 이미 상당히 진행한 종양이 방사선 치료만을 단독으로 시행했을 때에도 완치되는 결과를 보기도 한다.
   현재까지는 방사선치료에 대한 저항성(radioresistance)을 규정하는 요인은 매우 복합적이며, 잘 이해되어 있지 않은 실정이다. 이와 관련이 있다고 생각되고 있는 임상적인 요인들로 종양과 경부림프절의 병기, 원발병소의 위치, 조직학적 분화도, 주변장기로의 침습정도 등이 알려져 있다.¹⁾ 아울러 생물학적 요인으로 종양내 저산소상태(tumor hypoxia), 종양 고유의 방사선저항성, 그리고 종양유전자 중 raf, H-ras 등이 방사선저항성과 관련이 있다고 한다.²⁾ 한편, 분자생물학의 발전에 힘입어 방사선 저항성과 관련이 있다고 생각되는 표식자들이 규명되었는데, 예를 들면, p53, bcl-2, Bax 등의 인자들이 있다. 그 외에 ki-67, c-erbB-2, glutathione S transferase(GST), heat-shock protein(HSP-27) 등도 관련이 있다고 알려져 있다.³⁾
   두경부 편평세포암의 발생시 변이형(mutant) p53의 발현 및 그 역할에 대해서는 비교적 널리 알려져 있다. 정상형(wild-type) p53은 세포성장의 조절과 악성세포의 발현을 억제하는 역할을 한다. 반면에 변이형 p53의 과발현(overexpression)은 두경부편평세포암종의 60%에서 발견되며, 이 경우 대부분 예후가 나쁜 것으로 알려져 있다.⁴⁾ p53은 방사선에 대한 감수성과 여러 기전에서 관련이 있을 것이라고 인정되고 있다.⁵⁾⁶⁾
   bcl-2 단백질은 apoptosis를 억제하며, 이러한 작용 때문에 종양치료에 저항하는 중요인자라고 생각되고 있다. bcl-2의 과발현이 방사선조사나 화학요법 등에 의한 세포의 사멸을 억제하였다는 보고가 있다. 반대로 cytokine 등을 이용한 bcl-2 발현의 감소가 화학요법에 대한 감수성을 증가시킨다는 보고도 있다.⁷⁾
   한편, bcl-2는 단독으로 작용하기보다는 여러 다른 유사체(homologue)들과 복합적으로 apoptosis에 영향을 준다고 알려져 있다. bcl-2 유사단백 중에서 Bax는 bcl-2의 anti-apoptosis 작용과 길항작용을 하는 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 이는 p53에 의한 세포성장의 조절에도 간접적으로 영향을 미친다고 한다.⁸⁾
   본 연구에서는 두경부 편평세포암종에서 방사선조사 전후, 방사선 민감성 세포주와 방사선 저항성 세포주간의 방사선 조사에 따른 apoptosis 관련인자(p53, bcl-2, Bax)의 분포의 차이를 면역조직화학적 검사(immunohistochemistry), 역전사- 중합효소반응(RT-PCR：Reverse transcription-polymerase chain reaction), Western blot 등의 분자생물학적 방법을 이용하여 측정, 분석하여 이들 표식자의 분포와 종양세포의 방사선 저항성과의 관계를 고찰하고자 하였다.

재료 및 방법

두경부편평세포암종 세포주의 배양
   서울중앙병원에서 확립한 AMC-HN 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 피츠버그대학에서 확립한 PCI-1, 2 등의 세포주를 37°C, 100% humidity, 95% air/5% CO2가 공급되는 배양기에서 배양하였다. AMC-HN 1에서 8까지의 세포주들은 MEM media(GIBCO BRL^TM, Paisley, UK)에서, PCI-1, PCI-2는 DMEM media(GIBCO BRL^TM, Paisley, UK)에서 생장시켰다. 이들 배지에는 10% fetal bovine serum, 2 mmol/L L-glutamine, 50 U/ml penicillin, 50 μg/ml streptomycin 등이 첨가되어 있었다.

방사선조사
   지수함수적으로 생장하는 10종류의 세포주 및 정상섬유세포(normal fibroblast) 등 11종류의 세포주에 대하여 IBL 437C irradiator(CIS Biointernational^TM, Paris, France)를 이용하여(Fig. 1A), 2 Gy를 40초 동안 조사하였다. 특수제작된 방사선 조사 용기를 이용하여(Fig. 1B), 배양세포가 들어있는 배지의 모든 부분에서 방사선 조사량이 일정하게 유지되도록 하였다.

분석 대상 세포주의 결정
   방사선조사 후 1일부터 7일까지 세포배양을 하면서, 이들의 survival degree를 MTT(3-4, 5-dimethiazol-2yl-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 이용하여 조사하였다.

MTT(3-4,5-dimethiazol-2yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay
   각 well마다 배지를 걷어낸 후 5 mg/ml의 MTT를 50 μg씩 분주하여 4시간 동안 배양한 후, MTT배지를 걷어내고 PBS(Phosphate buffered saline, pH 7.5)로 1회 세척한 후에 50 μl의 DMSO(dimethylsulfoxide)에 MTT결정체를 녹였다. 약 5분 정도 지나 완전히 녹으면, ELISA 판독기(540 nm filter)에서 값들을 읽었다. 각 샘플당 3개의 값들을 평균하여 대표값을 정하였다.

Apoptosis 관련인자의 분석
   방사선 조사 전, 세포주의 특성을 분석하기 위하여 변이형 p53에 대한 면역조직화학적 검사와 변이형 p53에 대한 역전사- 중합효소반응을 시행하였다. 방사선 조사 전과 후에 세포주의 종류에 따라 MEM과 DMEM media에 각각의 세포들을 1×10⁶ cell/ml씩 60 mm² 세포배양접시(Corning^TM, New York, USA)에 분주하여 배양하였고, 이들을 대상으로 하여 1, 3, 5, 7일째에 각각의 인자의 분포변화를 보기 위하여 Western blot을 시행하였다.

p53에 대한 면역조직화학적 검사
   하루 동안 키운 2×10⁴개의 세포를 대상으로 ABC(avidinbiotin-peroxidase complex)법으로 p53에 대한 면역조직화학적 염색을 시행하였다. -20°C에 미리 냉각시킨 methanol을 세포에 첨가해 2시간 이상 고정시킨 후 PBS에 5분 담궜다. 10 mM citrate buffer(pH 6.0)에 담근 후 microwave oven에 넣고 5분동안 2번 가열 후 물로 3번 수세하였다. 0.3% 과산화수소 용액을 20분 처리하여 세포내의 내인성 과산화 효소의 활성화를 저지시킨 다음 완충용액으로 수세하였다. 비특이적인 배경 염색을 방지하기 위하여 정상 산양 혈청을 실온에서 10분간 가한 후 정상형과 변이형 p53유전자 단백질이 모두 결합하는 일차항체(mouse Anti p53 Zymed, 18-0129, 1：40희석)를 도포하여 실온에 2시간 방치하여 완충용액으로 10분 수세하였다. DAKO LSAB kit에 포함되어 있는 이차 항체(strepavidin-HRP conjugate)를 실온에서 10분간 처리한 후 완충용액으로 수세하였다. Streptavidin buffer를 10분간 처리한 후 다시 완충용액으로 수세, DAB chromogen으로 염색하고 hematoxylin으로 대조염색한 후 봉입제로 덮개유리를 유리 슬라이드에 부착시켰다.

p53에 대한 역전사- 중합효소반응(Reverse transcription-Polymerase chain reaction；RT-PCR)
   각 세포들에 TRIzol reagent(GIBCO BRL^TM, Paisley, UK)를 정해진 용량(1 ml/10 cm of dish)만큼 가하고 균질화시켰다. 5분 동안 숙성시키고 1 ml TRIzol 당 0.2 ml chloroform이 섞인 용액을 가한 후 15초 동안 세차게 흔들어서 서로 다른 상(phase)을 분리시켰다. 2~3분 동안 숙성시키고 2~8°C의 환경에서 12000 g로 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 상 중, 상층액(aqueous phase)을 RNA 추출물로 생각하고, 시험관에 넣은 후 1 ml의 TRIzol과 0.5 ml의 isopropyl alcohol을 가하여 10분 동안 12,000 g로 원심분리하였다. 상층부는 제거하고 세척액(1 mL TRIzol/1 mL 75% Ethyl alcohol)에 세척하고 5분 동안 7500 g로 원심분리하였다. RNA pellet을 RNA 자체가 건조되지 않도록 주의하면서 5~10분 동안 건조시켰다. 이를 55~60°C에서 10분간 숙성시킨 후 2 μg의 total RNA를 18 μg의 DEPC water(Diethyl pyrocarbonate, Santa Cruz Bio Technology, Inc, USA)에 용해시키고 이를 80°C에서 3분간 숙성시켰다. 이를 얼음을 이용하여 냉각시키고, 이 중 0.5 μg의 RNA를 80°C에서 10분간 열처리 한 후 oligonucleotide primers, reaction buffer, dNTP(deoxynucleotide triphosphate) mixture, DTT(dL-Dithiothretiol, GIBCO BRL^TM, Paisley, UK) 그리고 reverse transcriptase를 넣고 37°C에서 90분간 반응시킨 후 다시 10분 동안 80°C에서 열처리한 후 빨리 얼음에서 식힘으로 끝냈다. PCR은 1~2 μg의 cDNA를 주형으로 하여 50 pm의 primer들과 1 mM의 MgCl2, 100 μM의 dNTP와 Taq DNA polymerase 1 U를 첨가해 94°C에서 5분, 94°C에서 40초, 67°C에서 40초, 72°C에서 40초를 25번 반복하고 72°C에서 5분 동안 반응시켰다. Primer로는 exon 4와 exon 6 부근의 염기를 사용하였으며, 그 배열은 아래와 같고 product size는 394bp였다.

   Upstream：5'-CACCCATCTACAGTCCCCCTTGC-3'
   Downtream：3'-GGCCACTGACAACCACCCTTAACC-3'

   역전사- 중합효소반응이 끝나면 agarose gel에서의 전기영동을 통해 그 증폭된 결과를 분석하였다.

p53, bcl-2, 및 Bax의 Western blot을 이용한 분석
   세포주들을 급속냉각시키고 세포들에 200 μl의 RIPA buffer(150 mM NaCl, 1% deoxycholic acid, 1% Triton X-100, 10 mM TRIS [pH 7.4], 1 mM PMSF)를 가하였다. 12,000 rpm으로 10분동안 원심분리를 시행한 후 상층액에서 정량화하여 전기영동을 위한 단백질 성분을 모으고, 여기에 sample buffer(40 mM Tris(pH 6.8), 2% SDS, 5% 2-ME, 10% glycerol, 0.01% BPB)를 첨가하여 5분 동안 가열하고 각 lane에 50 μg의 검체를 정량하여 넣었다. 그리고 40 V에서 200분 동안 SDS-polyacrylamide gel 전기영동(SDS-PAGE)을 시행하였다.
   전기영동 후 stacking gel의 제거 후, Towbin transfer buffer(25 mM Tris(pH 8.2~8.4), 192 mM glycerin, 20% MeOH, 0.1% SDS) 내에서 5~15분 동안 안정화시키고, transfer sandwich(membrane-gel-blotter paper-sponge순서로 겹침)를 형성하여 단백질을 membrane으로 50 V에서 2시간 동안 전이(transfer)시켰다. 이렇게 해서 gel은 Coomassie blue염색을 하고, membrane은 PBS에서 세척한 후 blocking reagent(PBS, 0.1% Tween-20, 0.25~3% BSA)에서 차단시켰다. w/PBST를 이용하여 세척한 후 일차항체(변이형 p53：mouse Anti p53 Zymed, 18-0129, bcl-2：Santa Cruz Bio Technology, Inc, Cat# SC-509, Bax：Santa Cruz Bio Technology, Inc, Cat# SC-526)를 400배로 희석하여 가하고, 1시간 동안 숙성시켰다. w/PBST로 다시 세척하고 이차항체(p53, bcl-2：mouse monoclonal IgG1 Ab, Bax：rabbit affinity-purified polyclonal antibody)를 100배로 희석하여 가하고 다시 1시간 동안 숙성시켰다. 세척한 후 1,500배로 희석한 streptavidin-HRP conjugate를 가하고 45~60분 동안 숙성시켰다. ECL kit(Amersham Co^TM, USA) 내에 있는 chemiluminescence reagent를 1분 동안 숙성시켜 가능한 한 빨리 membrane을 필름에 놓고 15초 동안 감광시켰다.

결     과

세포성장곡선
   총 11종류의 세포주에 대해 방사선 조사를 시행하였고, 정상섬유세포가 사멸하지 않는 최대 방사선조사량은 2 Gy였다. 이 용량을 최종 방사선 조사량으로 결정하였다.
   MTT assay를 시행하여 세포성장곡선을 조사하였다. AMC-HN 1은 대표적으로 방사선 저항성의 양상을 보였고, PCI-1은 대표적으로 방사선 조사에 민감하게 반응하는 양상을 보였다. 한편, AMC-HN 8은 방사선 저항성과 방사선 민감성의 중간양상으로 반응하는 결과를 보였고(Fig. 2), 따라서 방사선에 대한 반응이 차이를 보이는 대표적인 예로서 이 세가지 세포주에 대하여 이후의 분석을 진행하였다.

p53에 대한 면역조직화학적 검사
   AMC-HN 1, AMC-HN 8, PCI-1에 대하여, p53 단백의 종양세포내 분포를 면역조직화학적 검사를 이용하여 분석하였다. 각 세포주의 면역조직화학적 검사소견은 Fig. 3과 같다. 그 결과 p53의 세포내 분포는 AMC-HN 1은 음성이었고, PCI-1은 강한 양성 반응, AMC-HN 8은 약한 양성 반응을 보였다.

p53 mRNA의 분석(역전사- 중합효소반응)
   세 종류의 세포주 모두에서 mRNA 수준의 p53의 발현이 관찰되었다. p53 cDNA band 활성도와 그 조직에서 같은 조건으로 측정한 GAPDH cDNA band 활성도의 비가 각각의 세포주마다 다르나 모두 명백히 p53 cDNA의 활성이 관찰되었다. Fig. 4의 각 band는 서로 다른 조건에서 실험되었기 때문에 정량적으로 분석할 수 없으며, 정성적으로 모두 p53 mRNA가 발현하였다고 해석할 수 있었다.

p53, bcl-2, Bax의 방사선조사 후 시간에 따른 변화
   Western blot에서 각 종양유전자의 방사선조사 후 변화를 보았는데, 그 중 p53은 2 Gy의 방사선조사 후에도 AMC-HN 1, AMC-HN 8, PCI-1 모두에서 방사선조사를 시행하지 않은 경우와 비교하여 변화양상이 차이가 없었다(Fig. 5). bcl-2도 모든 세포주에서, 방사선 조사 후 분포양상이 대조군과 차이가 없는 소견을 보였다(Fig. 6). 이에 반하여 Bax는 방사선 저항성 세포주인 AMC-HN 1에서는 대조군과 방사선 조사군에서 별 차이를 보이지 않으나, 방사선 민감성 세포주인 PCI-1에서는 방사선이 조사되었을 때 3일째와 7일째에 새로운 band가 나타나는 결과를 확인할 수 있었다(Fig. 7).

고     찰

   두경부편평세포암종은 다른 종류의 암종에 비하여 일반적으로 빈번한 재발로 인하여, 치료에 곤란을 겪는 경우가 많다. 이러한 특징은 근치적 목적으로 수술을 시행하는 경우에 미세 잔존암이 빈번히 남는 비율과 수술 후 방사선 치료에 저항하는 비율이 높은 데서 연유한다. 현재까지는 방사선치료를 포함하는 대부분의 항암 치료가 apoptosis(pro-grammed cell death)와 세포괴사(necrosis)를 유발하는 기전으로 종양세포에 작용한다고 생각되고 있다. 만약 이러한 정상적인 생물학적 기전이 억제되거나, 변이로 인해 제대로 작용하지 못하는 경우, 방사선 치료의 실패 가능성이 증가한다.
   Apoptosis가 발생하는 기전은 크게 두가지로 분류된다. 즉 p53 의존성 경로(p53 dependent pathway)와 p53 비의존성 경로(p53 independent pathway)가 관여하는 것으로 알려져 있다. p53 비의존성 경로와 관계있는 인자는 여러가지가 알려져 있다. 예를 들면 ki-67, c-erbB-2, glutathione S transferase(GST), heat-shock protein(HSP-27) 등이 있으나, 최근에 그 중요성이 규명되어 널리 연구되고 있는 인자가 bcl-2와 그 이성체인 Bax이다.
   본 연구에서는 두경부 편평세포암종에서 방사선치료에 대한 반응 정도와 apoptosis에 주로 관여하는 중요한 인자인 p53, bcl-2, Bax 등의 분포간의 관계를 규명하고자 하였다. 우선 방사선저항성 여부를 규정하는데 있어서 방사선조사량을 정상섬유세포가 사멸하지 않는 최대 방사선조사량인 2 Gy(¹³⁷Cs)로 결정하였다. 다른 보고에서는 기준 조사량을 10 Gy, 8 Gy 등 다양한 방법으로 조사하였으나 본원에서 보유한 세포주에서 전형적 생존 양상의 관찰이 가능한 최대용량이었던 2 Gy를 기준 방사선 조사량으로 정하였다. 그 결과 처음에 실험을 시작하였던 10개의 세포주 중 세포성장곡선 조사에서 대표적으로 방사선저항 양상을 보인 AMC-HN 1과 방사선 민감 양상을 보인 PCI-1, 그리고 중간 반응을 보인 AMC-HN 8 등의 3가지 세포주를 추려낼 수 있었고 이들에 대해 방사선조사 전과 후 p53, bcl-2, Bax 등의 표식자들의 발현 양상을 분석하였다.
   면역억제된 쥐에서 인위적으로 발생시킨 종양에 대하여 방사선조사를 시행했을 때, 정상형 p53이 발현된 종양은 방사선조사 후에 대개 사멸하였고, 많은 수의 세포가 apoptosis 상태에 있는 것이 발견되었으나, 변이형 p53이 발현된 세포는 방사선조사 후에도 성장을 계속 하였고 apoptosis 상태의 세포들이 거의 발견되지 않았다고 한다.⁹⁾ 이러한 결과는 종양세포에서의 apoptosis의 장애는 정상 p53의 기능이 변이 등에 의하여 비활성화되기 때문에 초래되며, p53에서 발생하는 이러한 현상이 방사선저항성의 기전을 설명할 수 있는 중요한 단서일 것이라고 생각되고 있다. 따라서 변이형 p53의 발현여부는 방사선저항성 여부를 예측하는 데 있어서 중요한 단서일 것이라고 인정되고 있다. 한편 다른 연구에서 p53의 변이를 야기시킨 transgenic mice에서 발생시킨 종양세포는 방사선조사에 잘 반응하지 않는다는 사실도 보고되어 있다.⁶⁾ 이러한 특징은 변이형 p53이 발현된 암세포에서는 p53이 세포주기에 대한 checkpoint 기능을 제대로 수행하지 못하기 때문에 발생할 것이라고 추측된다. 그 근거로 이러한 세포들에서는 DNA 손상에도 불구하고 S기로 접어드는 것이 관찰되고, 동시에 p53의 변이의 빈도는 증가하며 유전자 수준에서의 불안정은 증가하는 현상들이 제시되었다. 정상형 p53은 유전자의 안정성과 관련이 있고, DNA 손상에 대응하여 세포주기의 G1기에서의 고정을 가능하게 하기 때문에 p53 기능의 변이는 성장을 억제하는 세포 자체의 기능에 중요한 손상을 줄 것이라고 생각된다. 그 결과로 인하여 야기되는 방사선치료 후 종양의 급속한 재증식은 방사선치료의 중요한 실패요인이라고 알려져 있다.
   본 연구에서는, 방사선 조사 전 면역조직화학적 검사에서 방사선저항성 세포주인 AMC-HN 1은 p53 음성 반응을 보였고, 방사선민감성 세포주인 PCI-1은 p53에 강한 양성 반응을, 방사선에 중간 정도의 반응을 보였던 AMC-HN 8은 약한 양성 반응을 보였다. 이러한 결과는 가설에서 기대하였던 방사선저항성 세포주에서 p53이 발현되고 이러한 양상이 방사선치료에 대한 저항성 및 anti-apoptosis 양상과 관련있으리라는 가설과 차이를 나타내고 있다. 그러나 면역조직화학적 검사는 세포수준에서 발현되는 단백질의 양상을 정성적으로 분석하는 기법으로 민감도가 비교적 낮은 검사법이며 이러한 결과가 유전자 수준에서의 p53의 발현양상을 정확히 반영하는 결과는 아닐 것이라고 사료되었다. 실제로 Taylor 등¹⁰⁾은 두경부암에서 방사선조사 후 면역조직화학적 검사와 p53 변이를 sequencing을 이용하여 p53의 변화를 규명하였는데, 대부분의 예에서 면역조직화학적 검사가 p53 유전자의 정확한 상태를 반영하지 못하여 정확성이 있는 검사법은 아니라고 기술하였다. 이러한 근거에서 저자들은 역전사- 중합효소반응을 시행하여 mRNA수준에서 p53의 발현양상 및 변이의 위치를 면역조직화학적 검사 결과를 정확히 검증하고자 하였다. 그 결과 세가지 세포주 모두에서 p53 mRNA의 활성이 증명되었다. 이는 일반적으로 알려진 변이형 p53과 방사선저항성 및 apoptosis와의 관계와는 다른 결과이다. 그러나 p53이 발현된 경우 종양세포의 성장양상은 매우 다양하고, p53이 apoptosis에 영향을 미치는 경로도 복합적일 것으로 생각되고 있다. 이러한 다양성이 방사선저항성 여부와 관계없이 mRNA 수준에서 p53이 모두 발현되는 결과와 관련이 있을 것이라고 사료된다. 다른 연구에서는 apoptosis 관련 인자, 즉 bcl-2, Bax 등의 발현이 p53에 의하여 복합적으로 영향받지만, 과발현된 p53 단백질의 존재 자체는 apoptosis의 민감도, 즉 방사선민감성을 예측할 수 있는 인자는 아니었다는 주장도 있다.¹¹⁾ 즉 apoptosis에는 p53 의존성 경로와 마찬가지로 p53 비의존성 경로도 복합적으로 관여한다는 점이 고려될 수 있겠다.
   또 다른 표식자인 bcl-2 유전자의 발현은 정상형 p53의 작용과는 대조적으로 방사선조사에 의하여 발생하는 apoptosis를 억제하는 것으로 알려져 있다. 몇몇 암종에서는 bcl-2가 많이 발현될수록 방사선치료에 대한 반응이 불량하였다는 보고가 있다. 그러나 이와 대조적으로 폐암이나 골수이형성증, 소아백혈병 등에서 bcl-2 발현이 오히려 적게 관찰될수록 치료에 대한 반응과 예후가 불량하다는 주장도 있었다. 이와 같은 결과의 불일치에 대한 가능한 설명은 bcl-2발현이 적게 되는 경우의 종양은 변이형 p53과 관련이 있고, 이러한 관련성이 복합적으로 방사선치료에 잘 반응하지 않는 결과를 초래할 것이라고 생각되고 있다.⁹⁾ 마찬가지로 다른 bcl-2와 관련된 유전자들인 Bax나 bcl-xL 등이 역시 bcl-2 자체의 작용에 영향을 미친다고 한다. bcl-2는 세포의 사멸를 억제하는 특이한 역할을 가지고 있다. 이 인자는 피부, 림프절, 위장관이나 말초신경 등의 조직들에서 성장인자나 호르몬 등의 작용에 의하여 세포들이 과증식에 돌입하였을 때 빈번히 발현되는 것으로 알려져 있다. 마찬가지로 이러한 조직들에 생긴 종양에서 bcl-2가 많이 발현되는 것이 관찰된다. bcl-2의 생체내 역할은 비교적 많이 알려져 있으나 이것이 실제 생체내에서의 정확한 기전에 대해서는 아직 규명되지 않은 부분이 많이 남아있는 실정이다. 또한 bcl-2가 동일이성체화(homodimerize)되거나, 21kDa 단백질인 Bax와 상이이성체화(heterodimerize)하는 현상이 알려져 있다.¹²⁾
   Bax는 bcl-2와 대조적으로 세포의 사멸을 오히려 촉진하는 것으로 알려져 있다. Bax의 아미노산 구조는 bcl-2와 매우 유사하기 때문에 작용시 bcl-2와 복합체를 형성하여 작용할 것이라고 추측되고 있다. 이러한 Bax/bcl-2의 복합체의 양상에 의하여 세포의 생존 및 사멸 여부가 결정되는데, 만약 Bax의 기전이 우세한 경우는 세포가 사멸되고, 역으로 bcl-2의 기전이 우세한 경우는 세포가 계속 생존할 것으로 생각되고 있다. 그리고 Bax/bcl-2는 각각 서로 결합하고 그 양상에 따라 상이한 작용을 하는 동시에 p53과 직접 반응하는 기전도 있을 것이라는 주장도 있다. 이러한 기전이 존재할 것이라고 생각할 수 있는 예로서, 온도에 대한 반응에 의하여 인공적으로 세포내에 p53이 발현되는 경우, 이 세포에서는 bcl-2는 감소하고 동시에 Bax는 증가하는 실험결과 등이 제시되고 있다.¹³⁾ 즉 정상형 p53은 Bax의 발현을 증가시킴으로써 apoptosis를 촉진하고 이 기전이 방사선 조사에 대한 반응과 관련있을 것으로 주장되고 있다. 변이형 p53이 발현되어 있는 세포는 이러한 작용이 제대로 실행되지 않을 것이라 생각되고 있다. 이와 같이 Bax는 apoptosis의 또다른 조절인자이고 p53, bcl-2와 마찬가지로 세포사멸 및 방사선 저항성 여부를 결정하는데 중요한 역할을 할 것이라고 보고 있으나, Bax 자체의 세포내 존재 여부가 종양의 예후인자가 될 수 있을 것인지에 대해서는 아직 알려진 바가 그리 많지 않다. 본 연구에서 시행한 Western blot을 이용한 분석에서 p53은 방사선민감성 세포주와 방사선저항성 세포주에서 발현양상의 차이를 보이지 않았고 bcl-2 역시 별다른 발현양상의 차이를 보이지 않는 것을 확인할 수 있었다. p53이나 bcl-2가 방사선에 대한 다른 반응성을 보이는 세포주에 대하여, 검출되는 결과는 차이가 있다고 보고되는 연구결과가 많았으나, 본 연구에서 사용한 AMC-HN 1, AMC-HN 8, 그리고 PCI-1 세가지 세포주에서는 별다른 분포상의 차이가 없었다. 그러나 Bax는 방사선 조사 전후에 방사선 민감성 세포주와 방사선 저항성 세포주 간에 발현양상이 달라지는 결과를 관찰할 수 있었다. 방사선 민감성 세포주인 PCI-1에서 방사선 조사를 한 세포들에서 조사하지 않은 세포보다 Bax가 두드러지게 발현하는 결과를 관찰할 수 있었다. Bax는 방사선조사 및 화학요법에 반응, 발현하여 apoptosis를 촉진하는 인자로 알려져 있고, 본 연구의 결과도 이러한 과거 연구의 결과와 합치된다. 주로 방사선조사 후 3일째와 7일째에 발현되는 양상을 보였는데, 발현시점이 3일째, 7일째에만 나타나고, 5일 째에는 양성 반응을 보이지 않는 이유로는 세포 주기나 세포배양 기법, 실험상의 오차 등의 원인과 관련있을 것으로 생각된다. 상기 결과는 apoptosis에서의 Bax의 역할 및 발현양상을 이해하는데 단서가 될 것으로 사료된다. 향후 방사선 조사시 Bax의 발현과 세포사멸의 연관관계에 대한 정확한 이해, 그리고 이것의 임상적 의미에 대한 규명이 필요할 것이다.

결     론

   두경부 편평세포암종에서 방사선 조사 전후, 방사선 민감성 세포주와 방사선 저항성 세포주간의 방사선 조사에 따른 apoptosis 관련인자(p53, bcl-2, Bax)의 분포변화의 차이를 분석하기 위한 시도로써, 두경부 편평세포암종 세포주에서 방사선 조사 후의 상이한 반응과 여러 apoptosis 관련인자의 발현양상을 평가하고자 하였다. 대상 세포주 중 AMC-HN 1은 방사선 저항성 세포주로, PCI-1은 방사선민감성 세포주로, AMC-HN 8은 중간 정도의 반응성을 보이는 세포주이었다. p53에 대한 면역조직화학적 검사에서 AMC-HN 1은 음성, PCI-1은 양성이었고 AMC-HN 8은 중간 정도의 반응을 보였다. 그러나 역전사- 중합효소반응을 이용하여 mRNA를 분석하였을 때, 특별한 발현양상의 차이를 보이지 않는 p53 mRNA가 세가지 세포주 모두에서 발견되었다. 2 Gy(¹³⁷Cs)의 방사선 조사 후 Western blot을 이용한 분석에서는 p53과 bcl-2는 세포주간의 분포양상의 차이가 없었으나, Bax는 방사선 저항성 세포주(AMC-HN 1)와 방사선 민감성 세포주(PCI-1) 간의 유의한 차이가 있었다. 향후 두경부 편평세포암종에서 방사선조사 후 세포수준에서의 발현기전과 예후를 예측할 수 있는 인자들에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

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