교신저자：정연훈, 442-791 경기도 수원시 팔달구 원천동 산 5  아주대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   중이진주종은 상피조직의 과증식 및 과각질화를 병리학적 특성으로 하는 질환으로 이소골을 포함한 중이 구조물을 파괴함으로써 난청을 유발하는 중이염의 흔한 원인 중 하나이다. 중이진주종의 발병기전에 대해서는 지금까지 많은 연구가 이루어져 왔지만 아직까지 정확하게 규명되지는 못하고 있다. 그런데 지금까지의 연구들을 보면 epidermal growth factor receptor,¹⁾ platelet derived growth factor receptor,¹⁾ c-jun,²⁾ p53,²⁾ phospholipase C-γ¹⁾³⁾ cytokeratin13/16³⁾ 등 주로 진주종 상피세포의 세포내 신호전달체계(intracellular communication)에 관한 보고가 주를 이루고 있으며, 실제 진주종의 세포간 신호전달(intercellular communication)에 관한 보고는 거의 없는 상태이다.
   세포의 성장과 분화, 그리고 조직 및 기관의 정상적인 기능을 위해서는 종합적인 신호전달체계가 확립되어야 한다. 외부환경의 자극을 감지하는 세포외 신호전달체계(extracellular communication)와 이들 정보를 세포내 핵까지 전달하고 적절한 핵내반응을 유도하는 세포내 신호전달체계, 여러 세포에서 일률적으로 반응하기 위한 세포간 신호전달체계 등이 적절히 기능하여야 세포의 증식(proliferation), 분화(differentiation), 사멸(apoptosis)을 조절할 수 있다. 즉, 진주종 상피세포의 병리학적 특성을 발휘하려면 각 세포내의 변화가 인접세포에 전달됨으로써 통일적인 반응을 보여야 할 것이다. 간극결합(gap junction)은 이러한 세포간 신호전달의 중요한 통로로서 진주종에서의 간극결합에 대한 보고는 이루어진 적이 없다.
   간극결합은 인접세포간의 비특이적, 수동적 확산에 의해 물질의 이동이 이루어지는 곳으로 connexin(Cx) 단백으로 구성되며, 세포의 상호 정보교환을 통하여 각 기관 및 조직의 발생, 분화 및 발육을 조절하는 중요한 곳이다.⁴⁾⁵⁾ Cx은 세포내 내형질세망(endoplasmic reticulum)에서 생성되어 골지체(golgi apparatus)에서 6개가 모여 connexon이라는 반통로(hemichannel)를 만들고 세포막으로 이동하여(trafficking) 인접세포의 반통로와 만나 완전한 통로, 간극결합을 이루게 된다.⁶⁾⁷⁾ Cx은 multigenic family로 현재 약 20종류의 isoform이 보고되고 있으며 이는 종특이적, 조직특이적 분포를 하는 것으로 알려져 있다. 그 중 Cx26은 내이, 간, 피부, 점막 등에 많이 분포하고, Cx43은 뇌, 심장, 생식선, 각막, 피부 등에 분포하는 것으로 알려져 있고, 사람의 피부 상피세포에서는 주로 Cx43, 26, 30, 31, 37, 45 등이 분포하는 것으로 되어 있다.⁸⁾ 본 연구에서는 그 중 흔하게 피부에 분포하는 Cx26과 Cx43에 초점을 맞추었다.
   이러한 세포간 신호전달을 위한 Cx의 발현이 어떠한 이유로 이상발현을 하게 되면 여러가지 조직 및 기관의 기능을 초래하게 된다.⁸⁾ 대표적인 예가 Cx26의 변이로써 내이의 K⁺이온의 세포간 전달이 제대로 이루어지지 않음으로 선천성 난청을 일으키는 원인이 되며,⁹⁾¹⁰⁾ 상피세포종양에서는 상피내 Cx의 발현 저하가 뚜렷하여 Cx 유전자가 암억제유전자(tumor suppressor gene)로 평가되고 있다.¹¹⁾ 한편 Cx은 상피세포의 분화와 증식에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있어 피부의 상처치유, 건선, 유두종 등 피부 양성질환에서도 그 발현양상이 변하는 것으로 알려져 있다.^12)13)14) 따라서 저자들은 진주종이 상피세포의 분화와 증식의 장애를 보이는 질환이므로, 세포간 신호전달의 변화, 즉 Cx의 발현에 변화를 보일 것으로 기대하였다. 본 연구는 이러한 가설하에 사람의 중이진주종에서의 Cx43, Cx26의 발현 양상을 정상 피부의 발현과 비교 분석하는데 그 목적이 있다.

대상 및 방법

대  상
   중이진주종으로 본원에서 진단받고, 수술을 시행받은 10명의 환자에서 추출된 중이진주종 조직을 사용하였으며, 대조군으로 심부 외이도상피 및 후이개상피를 대상으로 하였다.

방  법
   실험은 크게 3단계로 이루어졌다. 첫째, 중이진주종 환자에서 진주종 조직, 심부 외이도상피, 그리고 후이개상피를 수술시 채취하여 면역조직화학적 염색(immunohistochemistry)을 통하여 Cx26, Cx43의 발현을 분석하였다. 둘째, 역전사중합효소반응(Reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용한 Cx26, Cx43의 mRNA 발현을 비교하였다. 셋째, Western blot을 이용하여 Cx26, Cx43 단백의 발현을 비교하였다. 하지만 심부외이도상피의 양이 현실적으로 충분히 구하기 힘든 관계로 역전사중합효소반응과 Western blot은 진주종조직과 후이개상피에서만 비교하였다.

조직추출 
   채취한 조직의 일부는 수술시에서 얻어지는 즉시 4% paraformadehyde 용액에 고정한 후 실험실에서 파라핀(paraffin)에 포매하였고, 남은 일부를 -70℃ 냉동고에 보관하였다. 전자는 면역조직화학염색을 시행하여 Cx의 발현을 분석하고, 후자는 RT-PCR 및 Western blot 통하여 Cx의 발현양상을 비교하였다. 

면역조직화학염색
   파라핀에 포매된 조직절편을 6 um 두께로 잘라, xylen으로 3회 7분간 탈파라핀화 시킨 후 100%, 90%, 80%, 70% 에탄올로 함수과정을 거친 후 항원복구과정을 위해 citric acid buffer용액에서 전자레인지에서 10분간 가열하였다. 내재성 과산화효소를 제거하기 위해 3% H₂O₂용액에 10분간 넣어둔 후 20분간 normal horse serum으로 blocking 한 후 1차 항체인 rabbit polyclonal anti-connexin 26 antibody (Zymed, CA, U.S.A.)와 mouse monoclonal anti-connexin 43 antibody(Zymed, CA, U.S.A.)을 1：100으로 희석한 후 상온에서 1시간 반응시키고, 2차 항체를 30분간 반응시킨다. Vectastatin Universal Elite ABC kit 시약(Vector Labaratories, Burlington, Ontario, Canada)으로 30분간 염색한 후 DAB(Vector Labaratories)로 5분간 발색하였다. 대조염색은 Mayer's hematoxylin(Vector Hematoxylin QS, Vector Labaratories)을 사용하였다. 조직을 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올로 2분, xylen으로 3회 3분간 탈수과정을 거친 후 Canadian balsam으로 고정하였다.
   면역조직화학염색의 판정은 염색이 된 조직 상피를 기저층(basal layer)과 기저상층(suprabasal layer)으로 나누어 200배 현미경하에서 관찰하였다. 전혀 염색이 되지 않은 경우 음성(-), 약하게 일부분에서만 염색이 된 경우를 약양성(focal, ±), 강하게 염색된 경우를 강양성(strong positive, ++), 약양성과 강양성의 중간을 양성(positive, +)으로 판정하였다. 양성 대조군으로는 Cx43의 경우 쥐의 뇌조직을, Cx26의 경우에서는 사람의 심장조직을 사용하였으며, 음성 대조군으로는 Cx43, Cx26 1차 항체를 생략하고 phosphate buffered saline(PBS)를 대신 사용하였다.

역전사중합효소반응 
   수술 후 얻어진 조직을 1 ml의 TRIzol^®(GIBCOBRL, Grand Island, NY, U.S.A.)에 넣어 균질화 시킨 후, 총 RNA를 추출하였다. 중이진주종 조직과 후이개피부 조직에서 추출된 총 RNA 2 μg을 10x Buffer RT 2.0 μℓ, dNTP Mix(5 mM each dNTP) 2.0 μℓ, Oligo-dT primer(10 μM) 2.0 μℓ, RNase inhibitor(10 units/μℓ) 1.0 μℓ, Omniscript Reverse Transcriptase 2 Unit, RNase-free water가 섞인 반응혼합물 20 μℓ에 넣고 37℃에서 60분, 94℃에서 5분간 역전사하여 cDNA를 합성하였다. PCR은 Minicycler^TM(MJ research, Waltham, MA, U.S.A.)를 사용하였고 합성된 cDNA를 Taq DNA polymerase 1 Unit(Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IA, U.S.A.)와 각각의 primer로 증폭시켰다. 각각의 primer는 다음과 같다.
   Cx 26；Up 5'-TCT-TTT-CCA-GAG-CAA-ACC-GC-3’
   Down 5'-CTG-GGC-AAT-GAG-TTA-AAC-TGG-3’
   Cx 43；Up 5'-TAC-CAT-GCG-ACC-AGT-GGT-GCG-CT-3’
   Down 5'-GAA-TTC-TGG-TTA-TCA-TCG-GGG-AA-3’
   PCR과정은 초기 변성을 96℃에서 3분간 실시한 후, 변성은 96℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초간을 총 30 cycle을 실시하고 신전(extension)은 72℃에서 5분간 시행하였다. 발현된 mRNA 생성물의 크기는 Cx26은 725 bp, Cx43은 294 bp로 조직간의 발현 정도를 비교하였다.

Western blot
   냉동보관된 조직을 150 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% DOC(deoxycholic acid), 0.1% sodium dodesyl sulfate(SDS), 50 mM Tris-Cl(pH 7.5)이 섞인 RIPA buffer 1.0 ml에 넣고, 0℃ 상태에서 소독된 가위로 조직을 가늘게 자른 뒤, 4℃에서 흔들면서 2시간 동안 보관했다. 14,000 rpm으로 15분간 원심분리시키고 상층액만을 취하여 분리된 단백질은 Bio-Rad protein assay(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 양을 측정하였다. 단백질 분리를 위해 sodium dodesyl sulfate(SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE)를 사용하였으며 polyvinylidine difluoride(PVDF) membrane(Amersham, Arlington Heights, IL. USA)에 옮겨 4℃에서 하루동안 polyclonal rabbit anti-Cx26 antibody(Zymed Laboratories Inc., CA, U.S.A.), monoclonal mouse anti-Cx43 antibody(Zymed Laboratories Inc., CA, U.S.A.)를 반응시켰다. 다음 날 membrane을 0.2% Tween-20이 포함된 PBS 용액으로 세척한 후 peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit antibody(Santa Cruz biotechnology, Inc. CA, USA)와 anti-mouse IgG, horseradish peroxidase linked whole antibody(Amersham, UK)로 각각 반응 시켰다. 1시간 동안 반응시킨 후 enhanced chemiluminescence detection system(ECL, Amersham, UK)을 이용하여 X-ray film으로 확인하였다.

결     과

Cx43의 발현양상(Fig. 1, Table 1)
   Cx43에 대한 면역조직화학염색에서 정상 후이개상피에서는 유극층과 과립층을 포함한 기저상층에서 양성 발현을 보였지만 기저층에서는 거의 발현이 되지 않았고, 심부 외이도상피에서는 주로 과립층에서만 양성 발현을 보이면서 기저층은 거의 염색되지 않았다. 중이 진주종상피에서도 Cx43 발현 양상은 유사하여 기저상층에서 주로 염색이 되고 기저층에서는 거의 발현이 되지 않았는데, 정상 조직보다는 그 발현정도가 현저히 증가하여 유극층과 과립층에서 강양성 반응을 보였다.

Cx 26의 발현양상(Fig. 2, Table 2)
   Cx26에 대한 면역조직화학염색에서 정상 후이개상피에서는 모낭 주변의 기저층에서 약하게 염색이 되었고 기저상층에서도 염색이 되지 않았다. 심부 외이도상피에서는 기저층에서 일부 약양성을 보이면서 기저상층에서도 후이개상피와 달리 약양성을 보이는 경우가 절반이었다. 중이진주종 상피에서는 정상 후이개상피, 심부 외이도상피와 달리 기저층의 발현도 증가하였고 특히 유극층, 과립층을 포함한 기저상층의 발현이 현저히 증가하였다.

역전사효소중합반응 검사에 의한 mRNA의 발현양상(Fig. 3)
   중이 진주종과 후이개상피 조직을 이용하여 Cx43과 Cx26의 mRNA의 발현 여부를 5회 실험한 결과 Cx43은 5회 모두에서 중이진주종에서의 mRNA 발현이 후이개상피보다 강하게 나왔으며, Cx26은 1회는 두 조직 모두 발현이 되지 않았고, 4회에서 중이진주종에서의 mRNA 발현이 후이개상피보다 강하게 나왔다.

Western blot에 의한 Cx 단백의 발현양상(Fig. 4)
   중이 진주종과 후이개상피 조직을 이용하여 Cx43과 Cx26 단백의 발현양상을 5회의 실험을 통하여 살펴본 결과 Cx43은 5회 모두에서 Cx43 단백 발현이 정상 후이개상피보다 중이진주종에서 많이 나타났고, Cx26은 3회에서 중이진주종에서 더 발현이 되었으며, 2회에서는 두 조직 모두 발현이 되지 않았다.

고     찰

   간극결합은 인접세포간의 직접적인 정보교환의 통로로서 일반적으로 비특이적, 수동적 확산에 의해 물질의 이동이 이루어지는 곳이다. 이 통로를 통하여 물질의 크기에 따라 비교적 선택적으로 물질 이동이 이루어지는데, cAMP, inositol 1, 4, 5-triphosphate(IP3)와 같은 1000 Da 이하의 작은 물질이나 Na⁺, K⁺, Ca²⁺ 등의 비유기 이온을 통과시키고, 반면에 단백질이나 핵산의 이동은 못하게 한다.⁴⁾ 이러한 작은 정보 물질, 즉 second messengers의 이동에 의해 세포는 상호 정보교환을 하게 되고, 이를 통해 각 기관과 조직의 발생, 분화 및 발육을 조절하고, 그 정상 기능을 발휘하게 된다.⁴⁾
   사람 및 동물의 상피세포는 세포간극결합을 통하여 이온이나 작은 물질을 서로 공유하고 정보를 교환함으로써 외부환경에 체계적으로 반응한다.¹⁵⁾ 일반적으로 상피세포의 발현되는 Cx은 동물마다 다른데 사람에서는 주로 Cx 43, 26, 30, 31, 37, 45가 발현되고 그 중에서도 Cx43, Cx26이 주로 연구되고 있다. Cx43은 모낭간상피(interfolllicular epidermis)와 상피부속기(epidermal adnxae)에 흔히 분포하지만, Cx26은 상피부속기에 국한되어 주로 발현된다고 한다.¹⁶⁾ 이러한 사실은 본 실험에서 사용한 정상 후이개상피에서도 거의 유사하게 나타났다. 하지만 심부외이도 상피에서는 Cx26의 경우 상피부속기가 없는데도 기저층 상피에서 일부 염색이 되어서 위치에 따라 그 분포양상이 약간 다른 것으로 사료된다.
   상피세포에서의 간극결합의 작용기전에 대한 연구는 추가적으로 필요하지만, 상피세포의 성장과 분화의 조절을 위해서 간극결합과 관련된 신호체계가 있는 것으로 알려져 있다.^12)13)14) 따라서 상피세포의 Cx43과 Cx26의 발현분포의 차이는 상피세포가 피부의 각 기능과 형태가 서로 다른 부위로의 분화를 위한 특수한 분화 프로그램과 관련이 있을 것으로 사료된다. 실제 connexin은 피부상처를 치유하고 유두종, 건선과 같은 피부질환을 예방하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 즉, 상피 기저층에서 국소적으로 분포하는 Cx26이 건선, 사마귀, 상처난 상피(tape-stripped epidermis)에서는 전층에서 과발현되었다고 한다.^11)12)17) 또한 본 연구에서도 Cx26의 발현이 정상 후이개상피에서는 기저층에만 드물게 존재하다가 중이 진주종에서는 기저층 뿐만 아니라 기저상층까지도 비교적 강하게 나타나는 것을 볼 때, Cx26이 상피세포의 증식과 관련이 있을 것으로 사료된다.
   한편 Cx43은 정상 상피에서 주로 유극층, 과립층에 존재하는데 과증식된 상피 조직, 즉, 건선에서는 Cx26과 함께 Cx43도 과발현 되었고,¹⁷⁾ 피부에 retinoic acid를 국소 처방한 경우에는 실제 상피세포의 증식이 이루어지면서 피부가 두꺼워지는데, Cx43의 발현이 유극층, 과립층에서 넓게 과발현 되었다고 한다.¹⁸⁾ 본 연구에서도 Cx43은 중이진주종에서 정상상피보다 넓게 기저상층에서 과발현되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 곧 Cx43이 상피세포의 증식 또는 분화와 관련 있음을 의미한다. 그런데 Gibson 등¹⁹⁾의 정상상피세포를 이용한 배양 실험에서 Cx43이 세포의 분화보다는 증식과 관련이 있었다고 한다. 중이진주종의 발생기전과 관련된 Cx43과 Cx26의 구체적인 역할에서는 추가적인 연구가 필요하다.
   편평상피세포암, 기저상피세포암 등 피부종양에서는 Cx의 발현이 현저히 감소된 것으로 알려져 있으며, 특히 Cx26, Cx43의 발현 감소는 뚜렷한 것으로 알려져 있다.¹¹⁾ 실제 Lee 등²⁰⁾의 HeLa 세포주에서 Cx26 변이를 이용한 실험에서 Cx26이 암억제유전자로 작용함을 증명한 바 있다. 중이진주종이 종양처럼 과증식하는 질환이지만, 일반적으로 그 조직 성향은 완전 다른데, Cx의 발현 양상에서도 본 연구에서처럼 종양과는 다르게 진주종에서 Cx26, Cx43의 발현은 증가하였다.
   본 실험에서는 정상 후이개상피 및 심부 외이도상피와 비교해서 중이진주종에서의 Cx26, Cx43의 발현을 전사(transcription) 수준에서의 mRNA, 전역(translation) 수준에서의 단백의 양과 위치를 확인하였다. 면역조직화학염색에서 중이진주종의 Cx43의 발현은 정상 후이개상피세포와 유사한 형태로 기저상층에서 관찰되었으나, 유극층과 과립층에서 특히 발현이 증가되었다. 그러나 Cx26에서는 후이개상피와 심부 외이도상피에 비하여 중이진주종에서 기저층과 기저상층 모두에서 훨씬 강한 발현을 보였다. 하지만 일부 중이진주종 조직에서는 Cx26의 발현이 후이개상피와 같이 국소적으로 기저층에만 염색이 되거나 전혀 발현이 안된 경우들이 있었다. 이는 중이진주종에서 Cx26의 발현 양상이 Cx43에 비해 다양하다는 것을 의미하는 것으로 이런 변화는 중이진주종의 위치, 병기 및 염증상태의 요인에 영향을 받았을 것으로 생각된다. 역전사효소중합반응 검사에서도 Cx26과 Cx43 mRNA는 후이개상피에 비해서 중이진주종에서 강하게 발현되었다. 정량적으로 단순 평가하기는 어렵지만 5회 시행한 실험에서 모두 동일한 소견으로 관찰되었다. 이는 Western blot에서의 결과와 일치하는 소견으로 중이진주종에서의 Cx26, Cx43 단백의 발현이 후이개상피보다 많았다. 그런데 Cx43은 mRNA이나 단백의 발현 비교에서 모두 잘 나온 반면, Cx26은 mRNA는 5예 중 1예에서, 단백은 5예 중 2예에서 중이진주종과 후이개상피에서 모두 발현이 되지 않았다. 이는 Cx26은 Cx43과는 달리 Cx26의 분포가 후이개상피에 모낭부위에 소량 국한 되는 이유에 기인하며, 앞서 언급한대로 진주종에서의 분포가 비교적 다양하여 잘 발현되지 않았기 때문인 것으로 사료된다. 이렇듯 중이진주종에서는 Cx43, Cx26 모두 과발현되지만, Cx26이 보다 중이진주종 상태에 의존하는 경향이 있는 것으로 생각된다.

결     론

   사람 중이진주종 상피에서 세포간 신호전달을 위한 간극결합단백 Cx43과 Cx26의 발현이 정상 심부외이도상피 및 후이개상피세포와 비교하여 증가되어 있었다. 따라서 Cx발현 변화에 의한 세포간 신호전달과정의 이상이 사람 중이진주종의 병리기전과 연관이 있을 것으로 사료된다.

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