교신저자：이상학, 136-705 서울 성북구 안암동 5가 126-1  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   반전성 유두종은 비강 또는 부비동점막 기질내로의 상피성장을 특징으로 하는 비강내 양성종양이다.¹⁾ 반전성 유두종은 비강내 전체 종양의 약 0.5%에서 7%를 차지하는 비교적 드문 질환으로 비강 외측벽이나 중비도에서 흔하게 발생하며 주변 부비동이나 안구 또는 두개내 등 주변구조물을 침범하기도 한다.¹⁾²⁾³⁾ 본질적으로는 양성종양이나 주변구조물로의 침범, 잦은 재발과 암종으로의 전환 등 악성종양의 특징을 가지며, 악성전환율은 약 5%에서 13% 정도로 보고되고 있다.²⁾ 현재까지 알레르기나 만성염증, 발암물질에의 노출 등 다양한 원인인자가 보고되고 있으나 확실히 밝혀진 바는 없으며, 최근 유두종바이러스(human papilloma virus)와의 연관성이 보고된 이후 유두종바이러스 6B, 11, 16, 18 등 바이러스성 원인에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.³⁾⁴⁾
   프로테오믹스(proteomics)는 이차원적 전기영동(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)과 질량분석기(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)를 이용하여 조직이나 체액내에 존재하는 모든 단백질을 분리하고 분석하는 방법으로서, 단백질의 성질을 발현양상 및 유전자전이후변형(post-translational modification), 단백질과 단백질간의 상호작용(protein-protein interaction)에 초점을 맞추어 연구하여 세포내 변형과정 및 질병의 병태생리와 연계시켜 총괄적으로 이해할 수 있는 분야를 말한다.^5)6)7)8)9) 또한 정상조직과 질병조직사이의 단백질발현양상을 비교함으로써 특정질환의 병태생리와 질병표지자를 알아볼 수 있으며, 약물치료의 새로운 대상을 연구할 수 있는 유용한 수단이다.^{5)6)7)10)11)12)13)14)15)16)} 현재까지 프로테오믹스를 이용하여 혈장 및 뇌척수액, 간, 심장, 전립선, 뇌, 뇌하수체 등 동물 및 인간의 정상조직과 체액 등의 단백질조성 및 지도(protein reference map)가 발표되었으며, 나아가 간암, 위암, 전립선암 등 암종에서의 단백질발현양상과 정상조직과의 차이점을 파악함으로써 암종의 발현인자 및 종양표지자의 발견을 위한 여러 자료가 연구보고되고 있다.^{5)6)7)12)13)15)}
   저자들은 프로테오믹스를 이용하여 반전성 유두종의 단백질조성을 정상 하비갑개점막과 비교분석함으로써 반전성 유두종의 발생원인과 병태생리에 관여하는 단백질들을 알아보고자 하였으며, 이를 위해 우선적으로 반전성 유두종에서만 발현되는 단백질반점(protein spot)에 대하여 조사하였다.

재료 및 방법

조직채취 및 처리
   융비술(augmentation rhinoplasty)을 시행받은 환자 10명으로부터 정상 하비갑개조직을 채취하였으며, 반전성 유두종으로 비내시경수술을 시행받은 환자 10명으로부터 유두종조직을 채취하였다. 정상 하비갑개점막의 채취시 술 전 항히스타민제를 복용하였거나 전신적 또는 국소적 스테로이드를 사용한 환자, 비후성변화나 알레르기를 동반한 환자, 점막의 비용종양변화나 점막염증 소견을 보이는 환자는 제외하였다. 채취한 조직은 곧바로 액화질소에 동결처리하였으며 사용시까지 -70℃에 보관하였다.

단백질분리
   5 M urea, 2 M thiourea, 2% CHAPS, 2% sulfobetaine 3-10, 40 mM Tris, 0.2%(w/v) Bio-Lyte 3-10, 2 mM TBP로 구성된 조직용해완충액(sample lysis buffer) 1 ml당 50 mg의 조직농도로 조직분쇄기(tissue homogenizer) 및 초음파분쇄기(sonicator)를 사용하여 조직을 용해하였다. 분쇄된 조직은 DNA와 RNA, 기타 부유물들을 제거하기 위해 약 100,000 g에서 1시간 동안 원심분리를 시행하였으며 원심분리 후 상층액을 분리하였다. 전기흡광도측정기(SIRO S, SEAC, Radium Co., Italy)를 사용하여 상층액의 단백질농도를 정량하였으며 이차원적 전기영동시까지 -70℃에 보관하였다.

이차원적 전기영동
   일차적 전기영동(isoelectric focusing, IEF)은 Protean IEF cell(Bio-Rad, Hercules, CA)에서 17 cm의 pH 3-10, 4-7 IPG(immobilized pH gradient) strip(Bio-Rad)을 사용하여 시행하였다. 100 μg의 단백질을 9 M urea, 4% CHAPS, 100 mM DTT, 0.2%(w/v) Bio-Lyte, 소량의 bromophenol blue로 구성된 재수화완충액(rehydration buffer) 350 ml에 혼합하였으며 혼합된 용액을 IPG strip과 함께 Protean IEF cell에 부하하였다. 12시간의 능동적 재수화(active rehydration) 후 다음과 같은 상태로 IEF를 시행하였다：1) 250 V, 125 Vh；2) 500 V, 500 Vh；3) 1,000 V, 1,000 Vh；4) 5000 V, 90,000 Vh. IEF 후 IPG strip은 130 mM DTT, 6 M urea, 2% SDS, 1.5 M Tris-HCl pH 8.8, 20% glycerol로 구성된 균형완충액(equilibration buffer)에 15분간 반응시켰으며, DTT만 135 mM iodoacetamide로 대체된 2번째 완충액에 15분간 반응시켰다. 이차적 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)은 Protean XL system(Bio-Rad)을 사용하여 12% acrylamide gel에서 시행하였다. 이차원적 전기영동이 완료된 gel은 silver staining을 통하여 염색한 후 발현되는 단백질반점을 관찰하였다.

이미지분석(Image analysis)
   염색된 gel은 스캔 후 2% acetic acid 용액에 보관하였다. 스캔으로 얻어진 영상은 Photoshop(Adobe) software에 저장하였으며 Melanie Ⅲ program을 사용하여 정상 하비갑개점막 및 반전성 유두종에서의 단백질발현양상을 비교분석하였다. 반전성 유두종에서만 특이적으로 발현되는 단백질반점 24개를 선택하여 분석에 사용하였다.

단백질반점 채취 및 트립신 단백분해(Tryptic in-gel-digestion)
   선택된 단백질반점은 멸균처리된 피펫 tip을 사용하여 gel로부터 분리한 후 1.5 ml Eppendorf tube(Axygen Scientific Co., CA)로 옮겨졌다. 50 μl의 20 mM potassium ferricyanide/100 mM sodium thiosulfate(1：1)를 tube에 넣고 갈색의 염색이 약간 노란빛으로 변할 때까지 탈색시켰다. 증류수로 3회 수세 후 150 μl의 200 mM ammonium bicarbonate를 넣고 20분간 실온에서 반응시켰다. 다시 증류수로 3회 수세한 후 100 μl의 acetonitrile를 넣어 탈수시킨 후 용액을 제거하였으며 진공원심분리기에서 30분간 건조하였다. gel을 완전히 건조시킨 후 30 μl의 50 mM ammonium bicarbonate와 3 μl(0.1 μg/μl)의 trypsin을 첨가하여 37℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 이후 100 μl의 50 mM ammonium bicarbonate를 첨가하여 1시간 동안 37℃의 shaking incubator에서 반응시킨 후 gel 조각을 제외한 상층액을 새 tube로 옮겨담았다. gel이 들어있는 tube에 100 μl의 acetonitrile을 넣고 37℃에서 10분간 반응시킨 후 용액을 새 tube에 첨가하였고 다시 100 μl의 acetonitrile를 gel에 첨가 후 상층액을 새 tube에 첨가하였다. 용액만이 담겨진 새 tube는 진공원심분리기에서 6시간 이상 완전히 건조시켰다.

단백질동정(Protein identification) 및 Bioinformatics
   Trypsin으로 처리된 단백질은 여러 개의 펩타이드(peptide) 조각으로 분해되며 이는 MALDI-TOF MS를 사용하여 질량분석 후 등전점(isoelectric point, pI)과 분자량(molecular weight, MWt)에 적합한 단백질을 SWISS-PROT (http://kr.expasy.org)과 National Center for Biotechnology Information(NCBI) protein database(http://www. ncbi.nlm.nih.gov)에서 검색하였다. 개별적인 2회의 실험을 통하여 실험의 재현성을 확인하였다.

결     과

   정상 하비갑개점막 및 반전성 유두종조직을 이차원적 전기영동을 이용하여 단백질을 분리하고 silver staining으로 염색한 결과 양측 모두에서 약 700 여개의 단백질반점들이 관찰되었다. Melanie Ⅲ program으로 비교분석하여 반전성 유두종에서만 발현되는 단백질반점 24개를 MALDI-TOF MS를 사용하여 분석한 결과 Table 1과 같은 단백질들이 동정되었다. Fig. 1과 2는 각각 정상 하비갑개점막과 반전성 유두종의 이차원적 전기영동 단백질발현양상을 보여주는 사진이다. 양측 사진은 전체적으로는 비슷한 발현양상을 보이고 있는데, 4.5 kD 이상의 고분자량 지역에서는 단백질반점들이 밀집되어 나타나는 패턴을 보이며, 그 이하의 부분에서는 여러 개의 단백질반점들이 산재되어 분포하고 있는 경향을 보이고 있다. 동정된 단백질에 대한 신뢰도는 일치하는 펩타이드의 수(number of matched peptides)와 염기서열차지율(sequence coverage rates)에 의해 결정되는데, 일반적으로 5개 이상의 일치하는 펩타이드와 15% 이상의 염기서열차지율을 가진 단백질을 선택하게 된다. 본 연구결과 동정된 단백질은 이에 합당한 조건을 가지고 있었다. 조직을 효소처리하여 분석하면 아직까지 밝혀지지 않거나 명명되지 않은 단백질들도 동정될 수 있는데 이는 hypothetical protein 또는 unmanned protein product라 칭하게 되며 본 연구에서는 이러한 단백질들은 동정되지 않았다.

고     찰

   프로테옴(proteome)이란 단어는 어원적으로 단백질체라고 풀이될 수 있으나 실제적으로는 게놈(gemone)의 상대어로서 프로테오믹스는 이러한 protein과 genomics의 합성어라 할 수 있다.^10)11)12) 이 단어는 1995년 이탈리아 Siena에서 개최된 이차원적 전기영동학회(2-dimensional electrophoresis meeting)에서 Marc Wilkins에 의해 처음 사용된 이후 보편화되었다. 게놈, 즉 유전체는 각 종(species)마다 동일하며 정적인 성질을 띄는 반면, 단백질은 어떠한 개체에 주어진 환경에 따라 능동적으로 발현되며 해당 유전자 없이도 특정 단백질이 발현되거나 유전자의 존재에도 불구하고 단백질이 발현되지 않을 수 있다. 더욱이 유전자전이후변형이나 단백질간의 상호작용에 의해 전혀 새로운 단백질의 형성도 가능하기 때문에 유전체에 대한 연구에서 단백질체로의 연구로 관심이 전환된 이유가 여기에 있다고 할 수 있다.¹³⁾ 프로테오믹스는 크게 이차원적 전기영동과 질량분석기를 통한 단백질동정으로 구성되며, 이 중 이차원적 전기영동은 조직이나 체액내의 단백질을 분리하고 그 발현정도를 알 수 있는 방법으로서 프로테오믹스의 근간을 이루는 기술이다.^{5)6)7)8)9)10)} 또한 염색기술의 발달과 MALDI-TOF MS 외에 좀더 정확한 단백질의 동정이 가능한 기계들의 발전에 의존하여 프로테오믹스는 최근 급성장하고 있다.¹⁷⁾¹⁸⁾ 
   저자들은 프로테오믹스를 이용하여 정상비점막과 반전성 유두종에서 발현되는 단백질을 알아보고 이러한 단백질을 비교검토함으로써 가능한 종양표지자의 발견과 함께 반전성 유두종 발생에 관여하는 병태생리학적 기전을 이해하고자 하였다. MALDI-TOF MS를 이용하여 반전성 유두종에서만 특이적으로 발현되는 단백질반점들을 분석하여 동정된 단백질들은 Table 1과 같다. 동정된 단백질들에 대하여 살펴보면 caltractin, calneuron, Ca2+ binding protein 등 칼슘조절에 관여하는 단백질들과 T-cell receptor beta chain, MHC class I antigen, immunoglobulin lambda light chain, immunoglobulin heavy chain variable region 등 면역조절에 관여하는 단백질, ras-related protein RAP-2b, RAP-2b member of ras oncogene family, ras-related protein RAP-1b, ras-related protein Rab-33B 등 ras family에 속하는 종양유전자(oncogene) 등이 발현되었고, 이외에도 interleukin-1 alpha precursor, interleukin-6 precursor와 같이 면역과 염증성 단백질의 유도물질로서 대표적인 cytokine인 interleukin의 전구단백질, sodium channel beta-3 subunit precursor, chloride intracellular channel protein 2 등 이온전달에 관여하는 단백질들도 발현되었다. 기타 단백질에는 apolipoprotein C-Ⅱ precursor, G protein signaling regulator 19, proteasome activator complex subunit 1, alcohol sulfotransferase, dual specificity mitogen-activated protein kinase 3 등 확실한 기능을 알 수 없는 단백질과 효소들이 동정되었다. 
   현재까지 알려진 이러한 단백질들의 기능만으로 반전성 유두종 발생에 관여하는 역할과 병태생리학적인 기전에 대한 결론을 내리기는 어렵다. 하지만 동정된 단백질들의 인체내 기능에 관한 추가적인 연구를 통하여 반전성 유두종 발생기전을 연구하는데 있어 하나의 유용한 자료로 사용될 수 있으리라 생각된다. 또한 반전성 유두종에서만 특이적으로 발현되는 단백질반점이 24개에 국한된 것이 아니기 때문에 향후 나머지 단백질반점들에 대한 분석도 필요하다. 본 연구에서는 반전성 유두종에서만 발현되는 단백질반점에 대해서만 우선적으로 분석을 시행하였으나 추후에는 반전성 유두종에서 소실되는 단백질반점과 과발현(up-regulation) 또는 저발현(down-regulation)되는 단백질반점들에 대해서도 분석을 시행해야만 비로소 반전성 유두종의 발생기전을 규명하는데 완벽한 자료로 이용될 수 있으리라 판단된다. 
   프로테오믹스의 단점 중 하나는 매우 산성이거나 염기성인 단백질, 또는 매우 높은 분자량을 가지거나 낮은 분자량을 가진 단백질에 대해서는 분석이 어렵다는 점이며, 조직을 구성하는 주요단백질인 막단백질(membrane protein)의 수용성(solubilization)이 낮기 때문에 이러한 단백질에 대한 분석이 어렵다는 점을 들 수 있다.^18)19)20) 이번 연구에서는 이러한 막단백질까지 용해가 가능하다고 알려진 reagent 3 조직용해완충액을 사용하였으나 모든 단백질의 완전한 용해와 분리가 이루어졌는가에 대해서는 불확실하다.
   동정된 단백질의 확인을 위해서는 면역조직염색(immunohistochemistry)이나 western blot과 같은 추가적인 연구가 필요하며, 좀더 정확한 분석기계인 이온스프레이 질량분석기나 liquid chromatography 질량분석기 등을 사용할 수도 있다. 저자들은 분석되지 않은 나머지 단백질반점들에 대한 동정이 완료되는 대로 면역조직염색 등 단백질동정확인을 위한 실험을 시행할 예정이다.

결     론

   본 연구에서는 프로테오믹스를 이용하여 정상 하비갑개비점막과 반전성 유두종의 단백질발현양상을 비교분석하여 반전성 유두종에서만 특이적으로 발현되는 24개의 단백질을 동정하였다. 향후 추가적인 연구를 통해 반전성 유두종 발생에 관여하는 병태생리와 기전을 연구하고 이해하는데 기초적인 자료로 활용될 수 있으리라 사료된다.

1. Han JK, Smith TL, Loehrl T, Toohill RJ, Smith MM. An evolution in the management of sinonasal inverting papilloma. Laryngoscope 2001;111:1395-400.

2. Kaufman MR, Brandwein MS, Lawson W. Sinonasal papillomas: Clinicopathologic review of 40 patients with inverted and oncocytic schneiderian papillomas. Laryngoscope 2002;112:1372-7.

3. Thorp MA, Oyarzabal-Amigo MF, du Plessis JH, Sellars SL. Inverted papilloma: A review of 53 cases. Laryngoscope 2001;111:1401-5.

4. Hwang CS, Yang HS, Hong MK. Detection of human papillomavirus (HPV) in sinonasal inverted papillomas using polymerase chain reaction (PCR). Am J Rhinol 1998;12:363-6.

5. Beranova-Giorgianni S, Giorgianni F, Desiderio DM. Analysis of the proteome in the human pituitary. Proteomics 2002;2:534-42.

6. Langen H, Berndt P, Roder D, Cairns N, Lubec G, Fountoulakis M. Two-dimensional map of human brain proteins. Electrophoresis 1999;20:907-16.

7. Beranova-Giorgianni S, Pabst MJ, Russell TM, Giorgianni F, Goldowitz D, Desiderio DM. Preliminary analysis of the mouse cerebellum proteome. Brain Res Mol Brain Res 2002;98:135-40.

8. Jenkins RE, Pennington SR. Arrays for protein expression profiling: Toward a viable alternative to two-dimensional gel electrophoresis? Proteomics 2001;1:13-29.

9. Zuo X, Speicher DW. Comprehensive analysis of complex proteomes using microscale solution isoelectric focusing prior to narrow pH range two-dimensional electrophoresis. Proteomics 2002;2:58-68.

10. Zuo X, Speicher DW. A method for global analysis of complex proteomes using sample prefractionation by solution isoelectric focusing prior to two-dimensional electrophoresis. Anal Biochem 2000;284:266-78.

11. Tan C, Li J, Wang J, Xiang Q, Zhang X, Dong L, et al. Proteomic analysis of differential protein expression in human nasopharyngeal carcinoma cells induced by NAG7 transfection. Proteomics 2002;2:306-12.

12. Park KS, Kim H, Kim NG, Cho SY, Choi KH, Seong JK, et al. Proteomic analysis and molecular characterization of tissue ferritin light chain in hepatocellular carcinoma. Hepatology 2002;35:1459-66.

13. Ahram M, Best CJ, Flaig MJ, Gillespie JW, Leiva IM, Chuaqui RF, et al. Proteomic analysis of human prostate cancer. Mol Carcinog 2002;33:9-15.

14. Tsuji T, Shimohama S, Kamiya S, Sazuka T, Ohara O. Analysis of brain proteins in Alzheimer's disease using high-resolution two-dimensional gel electrophoresis. J Neurol Sci 1999;166:100-6.

15. Lim SO, Park SJ, Kim W, Park SG, Kim HJ, Kim YI, et al. Proteome analysis of hepatocellular carcinoma. Biochem Biophys Res Commun 2002;291:1031-7.

16. Lauber WM, Carroll JA, Dufield DR, Kiesel JR, Radabaugh MR, Malone JP. Mass spectrometry compatibility of two-dimensional gel protein stains. Electrophoresis 2001;22:906-18.

17. Knepper MA. Proteomics and kidney. J Am Soc Nephrol 2002;13:1398-408.

18. Beranova-Giorgianni S, Desiderio DM. Mass spectrometry of the human pituitary proteome: Identification of selected proteins. Rapid Commun Mass Spectrom 2000;14:161-7.

19. Herbert B. Advances in protein solubilization for two-dimensional electrophoresis. Electrophoresis 1999;20: 660-3.

20. Gevaert K, Demoi H, Martens L, Hoorelbeke B, Puype M, Goethals M, et al. Protein identification based on matrix assisted laser desorption/ionization-post source decay-mass spectrometry. Electrophoresis 2001;22:1645-51.