서     론

   비강 및 부비동에 발생하는 반전성 유두종은 비종양중 0.5 ~4%로 비교적 드문 양성 상피종양이지만,¹⁾ 임상적으로 국소 침윤, 높은 재발율, 악성 종양 동반, 악성전환 등의 특징을 갖고 있어 광범위한 수술적 절제 및 술후 주기적이고 세밀한 추적 관찰이 필요한 질환이다.²⁾
   반전성 유두종의 원인 인자로는 알레르기, 만성 부비동염, 바이러스, 흡연 및 환경적 유해인자로 알려져 있으나, 다양한 연구에 불구하고 종양의 성장과 악성전환의 기전은 아직 확실히 규명되지 않은 상태이다.³⁾
   세포의 증식능력을 잘 표현하는 핵단백의 일종인 Proliferating Cell Nuclear Antigen(이하 PCNA로 약함)은 분자량 36 KD의 non-histone 핵단백으로 DNA polymerase-delta의 보조단백이다.⁴⁾ 이는 G₁ 후기부터 핵내 나타나기 시작하여 S기에 최고에 도달했다가 G₂기 및 M기에 감소하는 것으로, 세포의 증식을 야기시키는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁵⁾
   최근 PCNA 단클론 항체를 이용하여 파라핀 처리된 조직에서 면역조직화학적으로 검색하는 방법이 소개되어 이를 이용하여 비교적 간편하게 세포의 증식능력을 측정할 수 있게 되었다.⁶⁾ PCNA를 이용한 종양세포의 염색에 있어서 증식세포의 비율은 악성종양의 악성도의 지표로 생각되며 또한 양성종양의 악성화의 지표로 생각할 수 있다. 종양의 증식능의 평가는 치료계획을 세우거나 또는 환자의 예후를 추측하는 인자로서 임상에의 응용이 기대된다.⁵⁾
   저자는 반전성 유두종, 비용, 상악암 및 비후성 비갑개 각각 29, 15, 5, 10예를 대상으로 PCNA의 발현을 면역조직화학적으로 검색비교하고 반전성 유두종에서 병리조직학적소견, 원발부위의 재발, 세포이형성 등을 검토하여 반전성 유두종의 생물학적 특성을 이해하는데 도움을 얻고자 하였다.

재료 및 방법

재  료

   연구 대상은 중앙대학교 이비인후과에서 91년부터 99년까지 반전성 유두종으로 진단되어 수술을 받은 29예와 대조군으로 비용, 상악암 및 비후성 비갑개 각각 15, 5, 10예를 대상으로 하였다.
   대상례의 조직표본 재료는 파라핀 포매조직의 헤마톡실린­에오신 염색표본을 검토하여 종양이 많이 포함되고 보관 상태가 양호한 부위를 선택하였다.

면역조직화학적 염색

   조직이 부착된 슬라이드를 60°C 오븐에서 1시간 처리하고, 자이렌으로 탈파라핀시킨 후 에탄올로 함수시켰다. 내재성 과산화효소를 제거하기 위하여 2.5% 과산화수소로 30분간 처리하고 10 mM citric acid에 처리하여 오븐으로 5분간 가열한 후 0.05 M Tris 완충액(pH 7.6)으로 10분간 2회 세척하였다. 비특이적 항원-항체반응을 억제하기 위하여 정상 염소혈청으로 1시간 반응시켰다. 일차항체는 단클론성 항체 PC 10(DAKO Co., Glostrup, Denmark)을 1：60으로 희석하여 실온에서 하룻밤 반응시켰다. Tris 완충액으로 3회 세척한 다음 anti-mouse biotinylated IgG(DAKO Co., Glostrup, Denmark) 이차항체를 15분간 반응시킨 후 streptavidin horseradish peroxidase(DAKO Co., Glostrup, Denmark)를 15분간 반응시켰다. AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)(DAKO Co., Glostrup, Denmark) 용액으로 발색시켜 Meyer's hematoxylin으로 대조염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 양성반응의 양상은 종양세포의 핵에 국한되어 담갈색으로 염색된 것을 관찰할 수 있었다. 판독은 염색된 모든 조직표본은 저배율(100배 시야)로 관찰하면서 염색이 잘된 부분을 선택하여 고배율(200배 시야)에서 관찰하여, 1000개의 상피세포중 양성으로 염색된 세포의 갯수를 백분율로 나타내었다. 이때 각 슬라이드 표본당 5개의 고배율 시야에서 구한 평균값으로 PCNA index를 산출하였다.

통계학적 검정

   통계분석은 SPSS 9.0 프로그램을 이용하여, 반전성 유두종, 상악암, 비용, 비후성 비갑개에서 PCNA발현양의 차이는 ANOVA를, 세포이형성과 재발과의 연관성은 Fisher's exact test를, 재발과 PCNA발현과의 연관성 및 세포이형성과 PCNA발현과의 연관성은 t-test를 이용하였다.

결     과

   반전성 유두종 29예의 연령분포는 25~88세로 다양하였으며, 평균 연령은 52.1세이고, 40~50세에 가장 높은 빈도를 보였다. 성별분포는 남자 15예, 여자 4예이었고, 남녀비는 3.75：1로 남자에서 많았다. 29예 모두 1년이상 추적관찰이 가능하였으며, 평균 추적관찰 기간은 2.1년이었다. 반전성 유두종의 재발은 29예 중 5예(17.4%)에서 재발하였으며 세포이형성을 동반한 경우는 9예 중 3예(33.3%)가 재발하였고, 동반하지 않은 경우는 20예 중 2예(10%)에서 재발하였다. 병리조직소견상 29예중 9예에서 세포이형성이 동반된 소견(Fig. 1)을 관찰할 수 있었고, 편평상피암이 동반된 경우나 술후 편평상피암으로 전환된 예는 없었으며, 나머지 20예는 정상적인 반전성 유두종의 병리조직소견이 관찰되었다.

반전성 유두종, 비용, 상악암 및 비후성 비갑개에서의 PCNA 발현

   면역조직화학염색법을 이용한 PCNA 발현율은 반전성 유두종에서 22.5%, 비용에서 8.0%, 상악암에서 45.4%, 비후성 비갑개에서 0.0%로 상악암에서 가장 높게 나타났으며, 다음으로 반전성 유두종에서 높게 나타났고, 비용과 비후성 비갑개에서는 낮은 발현율을 나타내었다(ANOVA test, p<0.01)(Table 1).
   PCNA항체의 면역화학적 염색양상은 반전성 유두종에서는 기저부 및 기저상부에서 관찰되는 반면(Fig. 1), 비용에서는 기저부에 국한되어 관찰되었다(Fig. 2).

세포이형성과 재발과의 연관성

   세포이형성을 동반하지 않은 반전성 유두종에서는 20예 중 2예(10.0%)에서 재발하였고, 세포이형성을 동반한 반전성 유두종에서는 9예 중 3예(33.3%)에서 재발하여, 세포이형성을 동반한 경우가 높은 재발율을 보였다(Fisher's exact test, p<0.05)(Table 2).

재발여부와 PCNA발현과의 연관성

   반전성 유두종 29예 중 5예(17.0%)에서 국소재발이 있었으며, PCNA발현율은 국소재발이 있었던 경우 27.3%였고, 국소재발이 없었던 경우는 21.5%로 국소재발이 있었던 경우가 PCNA발현이 높았으나 통계적 유의성은 없었다(t-test, p>0.05)(Table 3).

세포이형성과 PCNA발현

   반전성 유두종 29예 중 9예(31.0%)에서 세포이형성을 동반하고 있었으며, PCNA발현율은 세포이형성을 동반하고 있는 경우에서 31.4%였고, 세포이형성을 동반하지 않는 경우에서 18.5%로 세포이형성을 동반하고 있는 경우에서 높게 나타났다(t-test, p<0.01)(Table 4).

고     찰

   종양세포의 증식능력을 평가하는 방법으로는 (1) ³H thymidine을 이용한 autoradiography, (2) Bromodeoxyuridine(Brd-U), (3) Ki-67, DNA polymerase α 등의 증식세포 관련항원에 대한 면역 조직화학염색법, (4) Ag-NORs법, (5) flow cytometry에 의한 S기 세포의 분석법 등이 있다. 그러나 (1)과 (2)의 방법은 신선한 조직세포가 필요하며,⁷⁾ (4)의 방법은 핵내의 염색 NORs의 계측의 어려움이 있고,⁸⁾ (5)의 방법은 조직을 분쇄하여 사용하므로 괴사가 있는 조직을 잘못 분석하거나 조직 관찰이 불가능하다는 단점이 있다.⁹⁾ 최근 Murashima와 Takasaki는 파라핀 포매 조직으로 P-CNA를 검출할 수 있는 단일 클론 항체를 개발함으로써 임상에 널리 이용하고 있으며,⁶⁾ 후기 G₁기와 S기를 잘 표현하는 PCNA는 피부와 점막의 기저세포 및 비장, 흉선, 고환 등의 분열증식성이 있는 세포에서 관찰되며 정상조직이 암세포로 이행되는 정도, 즉 증식정도에 따라 PCNA의 표현율이 높아진다고 보고되고 있다.¹⁰⁾
   종양의 증식능과 악성도가 관련이 있다면 PCNA에 의한 증식능의 정량적 평가는 종양의 악성도와 예후를 추측하는 유용한 인자로 생각된다. 악성 림프종에서 암세포의 증식능이 악성도 및 예후와 밀접한 상관관계가 있다고 보고되고 있으며,¹¹⁾ 상피세포에서 유래된 악성종양의 증식성이 악성도를 반영할 수 있지만 그 예후와 관련성에 대하여서는 논란의 여지가 많다.¹²⁾
   비강 및 부비동에 발생하는 반전성 유두종은 Ward가 처음 기술한 이래 20여 개의 다른 이름으로 불리어졌으며, Ringertz 등이 처음으로 조직학적으로 기술하였다.¹³⁾ 반전성 유두종은 비종양중 0.5~4%로 비교적 드물며, 외배엽 상피세포에서 기원하여 기질속으로 반전하는 특성을 가진 양성 상피종양으로, 다양한 연구에 불구하고 종양의 성장과 악성 전환의 기전은 아직 확실히 규명되지 않은 상태이다.¹⁴⁾ 많은 연구에서 종양은 세포증식과 세포고사와의 불균형의 결과이며, 이것이 악성 전환에 관여할 것으로 보고되고 있다.¹⁵⁾
   Guichard 등이 반전성 유두종에서 PCNA를 이용한 상피세포 증식에 관한 연구에서 세포 증식이 반전성 유두종에서 대조군에 비해 현저한 증가를 보였으며, 이를 반전성 유두종의 발생과 연관지어 생각하였으며, PCNA발현이 세포고사와 세포고사 억제 보다 밀접한 관계가 있다고 보고하고 있으며,¹⁶⁾ Baek 등이 Ki-67을 이용한 반전성 유두종의 세포증식의 연구에서도 비슷한 결과를 보고하고 있다.¹⁷⁾
   본 연구의 결과에서는 반전성 유두종에서의 PCNA발현율이 비용이나 비후성 비갑개의 PCNA발현율 보다 높게 나타났으며, PCNA항체의 면역화학적 염색양상은 반전성 유두종에서는 기저부 및 기저상부에서 관찰되는 반면, 비용에서는 기저부에 국한되어 관찰되었다. 이러한 결과는 반전성 유두종에서 비점막 상피세포에서의 세포분열 과정의 변화가 있다는 것을 암시한다. 또한 PCNA항체의 면역화학적 염색양상이 반전성 유두종에서는 첨부가 아닌 기저부 및 기저상부에서 관찰되는 것이 상피세포에서 기원하여 기질속으로 반전하는 특성과도 관련이 있을 것이라고 추측할 수 있다.¹⁶⁾
   본 연구에서 PCNA발현율은 세포이형성을 동반하고 있는 경우에서 세포이형성을 동반하지 않는 경우 보다 높게 나타났다. 이러한 결과는 세포증식능이 잠재적 악성화를 포함하는 세포이형성의 하나의 기전으로 설명될 수 있고, S기 세포의 증가가 세포이형성, 더 나아가 악성화에 기여할 것으로 예상할 수 있다. 이러한 잠재적 악성화의 가설은 이미 기관지 상피나 자궁경부에서는 많은 보고가 있었으나, 본 연구에서 반전성 유두종에서도 같은 기전으로 설명될 수 있고 또한 PCNA발현율이 악성화의 임상적 예후 인자로서 사용될 수 있음을 보여주었다.
   반전성 유두종은 조직학적으로 양성 상피종양이지만 8~29% 정도의 높은 재발율을 보이는 질환이다.¹⁸⁾ 이와같이 높은 재발율을 보이는 이유는 종양 자체가 다중심성(multicentricity) 성향을 갖고 있어 수술적 제거시 병변을 완전히 제거하지 못하는 것이 가장 큰 원인이라고 생각된다.¹⁹⁾ 또한 Synder와 Perzin 등은 병리조직세포의 형태와 재발이 밀접한 연관성이 있어, 세포이형성을 동반한 반전성 유두종이 세포이형성을 동반하지 않은 반전성 유두종 보다 재발율이 높다고 주장한 반면에 병리조직학적 세포이형성과 재발과는 연관성이 없다는 주장도 많다.²⁰⁾
   본 연구에 의하면 세포이형성을 동반하지 않은 반전성 유두종과 세포이형성을 동반한 반전성 유두종에서 재발율은 세포이형성을 동반한 경우가 높게 나타났고, PCNA발현율은 국소재발이 있었던 경우 27.3%였고, 국소재발이 없었던 경우는 21.5%로 통개적 유의한 차이는 없었다.

결     론

   반전성 유두종에서 PCNA의 발현과 그에 따른 상피세포의 증식은 반전성 유두종 생성의 하나의 기전으로 제시될 수 있으며, 높은 PCNA발현율은 세포이형성과 그에 따른 악성화를 예측할 수 있는 예후추측의 한 인자로서 임상진료에 이용될 수 있을 것으로 생각된다.

1. Lawson W, Ho BT, Shaari CM, Biller HF. Inverted papilloma: A report of 112 cases. Laryngoscope 1995;105:282-8.

2. Buchwald C, Franzmann MB, Jacobsen GK, Lindeberg H. The presence of human papillomavirus in sinonasal papillomas: demonstrated by polymerase chain reaction with consensus primers. Human Pathol 1995;24:1354-6.

3. Respler DS, John A, Pater A. Isolation and characterization of papillo-mavirus from nasal inverting papillomas. Ann Otol Rhinol Laryngol 1987;96:170-3.

4. Cellis JE, Bravo R, Larsent PM. Review cyclin: A nuclear protein whose level correlate directly with the proliferative state of normal as well as transformed cells. Leuk Res 1994;8:143-57.

5. Bravo R, Frank R, Blundell PA, McDonald-Bravo H. Cyclin/PCNA is the auxillary protein of DNA polymerase. J Pathol 1987;326:515-7.

6. Murashima A, Takasaki Y. Immunohistochemical location of PCNA in squamous cell carcinoma from paraffin embeded tissue. J Clin Immunol 1989;9:218-37.

7. Nagashima T, De Armond JJ, Murovic J. Immunhistochemical demonstration of S phase cells by antibromodeoxyuridine monoclonal antibody in human brain tumor tissues. Acta Neuropathol (Berl) 1985;27:155-9.

8. Crocker J, Nar P. Nuclear organizer regions in lymphoma. J Pathol 1987;151:111-8.

9. Barlogieb B, Raber MN, Schumann J. Flow cytometry in clinical cancer research. Cancer Res 1983;43:3982-8.

10. Park HO, Do NY, Kim YG. The study of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression in human laryngeal carcinomas. Korean J Otolaryngol 1995;38:89-95.

11. Kamel OW, Lebrun DP, Eric Davis, Berry GJ, Warnke RA. Growth fraction estimation of malignant lymphomas in formalin-fixed paraffin-embedded tissue using Anti-PCNA/cyclin 19A2. Am J Pathol 1981;138:1471-7.

12. Zoller M, Goodman ML, Commings CW. Guidlines for prognosis in head and neck cancer with nodal metastasis. Laryngoscope 1978;88:135-41.

13. Ringertz N. Pathology of malignant tumor arising in the nasal and paranasal cavities and maxilla. Acta Otolaryngol Suppl 1938;27:31-42.

14. Hyams VJ. Papillomas of the nasal cavity and paranasal sinuses: a clinicopathologic study of 315 cases. Ann Otol Laryngol 1971;80:192-206.

15. Bursch W, Oberhammer F, Schulte-Hermann R. Cell death by apoptosis and its protective role against disease. Trends Biol Sci 1992;13:245-51.

16. Guichard C, Gilain L, Samad IAA, Piron G, Lydia B, Escudier E, et al. Epithelial cell proliferation, apoptosis and apoptosis inhibition in inverted papilloma. Laryngoscope 1998;108:716-20.

17. Baek BJ, Oh CH, Kim LJ. Epithelial cell proliferation, apoptosis, and apoptosis inhibition in inverted papillomas. Korean J Otolaryngol 1999;42:1244-50.

18. Lawson W, Le Benger J, Som P. Inverted papilloma: An analysis of 87 cases. Laryngoscope 1989;99:1117-24.

19. Bielamowicz S, Calcaterra TC, Watson D. Inverting papilloma in head and neck: the UCLA update. Otolaryngol Head Neck Surg 1993;109:71-6.

20. Christensen WN, Smith RRL. Schneiderian papillomas: A clinicopathologic study of 67 cases. Hum Pathol 1986;4:293-300.