교신저자：정유삼, 138-736 서울 송파구 풍납2동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
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서     론

   Rhinovirus(RV) 감염은 바이러스성 상기도 감염의 가장 흔한 원인으로 천식의 증상을 악화시키는 중요한 요소이다.¹⁾ 바이러스성 상기도 감염의 초기와 알레르기 비염에서 나타나는 소양감, 재채기, 수양성 비루 및 비폐색 등의 비부비동 증상은 서로 유사하다. 그러나 알레르기가 RV 감염을 조장하는지, 혹은 RV에 의한 상기도 감염의 증상을 악화시키는지는 아직 밝혀지지 않았다.
   기도상피세포에서 RV의 주요 수용체는 intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)으로²⁾ RV 감염과 알레르기는 기도상피세포에서 ICAM-1의 발현을 증가시킨다.³⁾ 아토피가 있는 경우 정상 대조군에 비해 비강 상피세포의 ICAM-1 발현이 증가하는 것으로 알려져 있으며⁴⁾ 이는 아토피성 환자에서 RV 감염이 증가할 수 있음을 시사한다.
   RV 감염은 점액의 과분비를 유발하고 IL-1β, IL-6, IL-8, IL-9, IL-11, tumor necrosis factor(TNF)-α 등의 다양한 cytokine의 분비를 촉진하며⁵⁾ 천식 환자군과 정상 대조군 모두에서 비강세척액 내의 IL-6, IL-8의 농도를 증가시킨다.⁶⁾ 이러한 cytokine들은 각각, 혹은 상호작용에 의해 RV 감염 후 비폐색, 인두통 등의 여러 증상을 유발하는 것으로 생각된다. 특히 IL-8은 바이러스성 상기도염의 증상발현 뿐 아니라 바이러스 유발성 천식의 병태생리에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.⁷⁾⁸⁾
   히스타민은 가장 중요한 면역매개물질 중 하나로 알레르기비염과 천식의 증상을 유발시킨다.⁹⁾ 또한 히스타민은 기관상피세포에서 ICAM-1 발현을 증가시키고¹⁰⁾ 내피세포로부터 IL-6, IL-8의 분비를 유도한다.¹¹⁾¹²⁾ 그러나 히스타민이 기도상피세포에서 RV감염에 미치는 영향에 대해서는 알려지지 않았다. 저자들은 A549 세포에서 ICAM-1의 발현, IL-6와 IL-8의 분비 및 바이러스 역가 측정을 통해 히스타민이 기도상피세포에서 RV감염에 미치는 영향에 대해 연구하고자 하였다.

재료 및 방법

바이러스와 히스타민
   RV-16(ATCC, Manassas, VA)은 PBS로 희석하여 -70℃ 냉동고에 실험 시까지 보관하였다. 히스타민(Sigma, St. Louis, MO)은 10^-3, 10^-4, 10^-5 M의 농도로 사용하였다.

세포의 배양
   A549 세포(alveolar epithelial type II respiratory cells, ATCC, Rockville, MD)는 10% fetal bovine serum(FBS；Hyclone Laboratory, Logan, UT)이 포함된 10% DMEM/F-12K을 기존 배양액으로 하여 배양하였다. 바이러스 역가의 측정에 사용된 MRC-5 세포(human fetal lung fibroblast, ATCC, Rockville, MD)는 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 0.25 μg/mL fungizone을 포함하는 minimum essential media(MEM)(Gibco, Grand Island, NY)를 기본 배양액으로 하여 10% FBS을 첨가하여 95%의 공기, 5% 이산화탄소, 37℃의 항온, 항습조건에서 배양하였다.

A549 세포에 대한 히스타민 처치와 RV-16 감염
   실험군은 A549 세포에 배양액만 처리된 군(대조군), 대조군에 RV-16의 감염을 시킨 군(RV 군), 대조군에 히스타민을 처치한 군(His 군), 감염군에 히스타민을 처치한 군(RV+His 군)의 4개의 군으로 설정하였다. 각 실험군에서 A549 세포를 6 well plates에 한 well당 5×10⁵의 수가 되도록 분주하고 10% DMEM/F-12K 배양액 2 mL를 넣고 배양하였다. 대조군은 A549 세포를 10% DMEM/F-12K에서 24시간 동안 배양하였다. RV 감염군은 RV-16을 1 MOI(multiplicity of infection)로 감염시켜 24시간 동안 배양하였다. 히스타민 처리군은 A549세포를 10^-3, 10^-4, 10^-5 M 농도의 히스타민으로 24시간 동안 처리하였다. 히스타민 처리 및 RV 감염군에서는 A549 세포에 RV-16을 1 MOI로 감염시킴과 동시에 각각 10^-3, 10^-4, 10^-5 M 농도의 히스타민으로 24시간 동안 처리하였다. 각 실험군의 세포상층액은 원심분리 후 cytokine 측정 및 바이러스 역가 측정을 위해 -70℃에서 보관하였다. A549 세포는 PBS로 세척한 후 0.25% trypsin-EDTA를 이용하여 채취하여 유세포분석을 이용한 ICAM-1 측정에 사용하였다.

IL-6, IL-8의 측정
   IL-6와 IL-8의 양은 ELISA kits(Biosource；Nivelles, Belgium)를 이용하여 분석하였다. 배양액을 100 μL씩 일차항체가 깔려있는 ELISA plate에 넣고 각각의 well에 항 IL-6, 항 IL-8 conjugate를 50 μL씩 혼합한 후 horizontal shaker에서 700±100 rpm으로 흔들어 주었다. 그 후 세척 용액으로 3회 세척한 후 발색용액(tetrametylbenzidine in DMF)을 각 well 당 200 μL 넣고, 빛이 없는 상태에서 700±100 rpm으로 30분간 반응시켰다. 그 후 stop 용액(1.8N H₂SO₄)을 50 μL 넣고 자외선 분광 광도계(Molecular Devices, Menlo Park, CA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다 ELISA kits의 민감도 한계는 10 pg/mL이었고 각 실험에서 얻은 표준곡선을 통해 농도를 계산하였다.

ICAM-1에 대한 유세포분석
   세포를 PBS 1 mL로 세척한 후 0.25% trypsin-EDTA 100 μL을 넣고 37℃에서 5분간 방치하였다. 10% DMEM/F-12K 배양액 1 mL를 넣고 1800 rpm에서 원심 분리하였다. 그 후 PBS 3 mL를 넣고 세척한 후 원심분리하고, 침전된 각 실험군 세포에 항 ICAM-1항체(mouse monoclonal anti human CD 54-FITC, Serotec, UK)를 4 μL씩 넣었다. 음성대조군 세포에는 항체(mouse IgG1-FITC, Serotec, UK)를 4 μL씩 넣었다. 항원-항체반응은 빛이 들어가지 않도록 조심하며 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 두 번 씻고, 1% paraformaldehyde/PBS 200 μL씩 세포에 섞어서 고정시켰다. 시료를 FACScan 분석기(Becton Dickinson, Ontario, Canada)를 이용하여 유세포분석을 측정하였다.

바이러스 역가의 측정
   MRC-5 세포를 96 well microplates(Falcon Labware, Oxnard, CA)에 한 well 당 3×10⁵의 수로 10% MEM 배양액 100 μL에 넣고 배양하였다. 다음날 상층액을 버리고 5% MEM 125 μL를 각각의 well에 넣었다. 그 위에 A549 세포에 RV-16을 감염시킨 감염군에서 얻은 상층액을 5% MEM으로 10배씩 희석(10^-1배 농도에서 10^-7배 농도까지)하여 25 μL씩 넣었으며 각 농도 당 4개의 well에 분주하였다. CPE(cytopathic effect)가 나타나는 시점까지 5일부터 2주까지 광학현미경(Olympus BX 40, Japan) 100배 시야에서 세포를 관찰하였다. 바이러스 역가는 각 희석배수의 4개 중 2개 이상의 well에서 CPE가 나타나는 가장 높게 희석된 농도(50% tissue culture infectious dose[TCID₅₀])로 정하였으며 이 희석농도의 역 로가리즘으로 표시하였다.

통계처리
   모든 실험결과는 Mann-Whitney U test를 이용하여 유의성을 검증하였다. 통계프로그램은 SPSS 10.0을 사용하였고 p 값이 0.05 미만인 경우를 유의한 것으로 정하였다.

결     과

ICAM-1의 발현
   ICAM-1의 형광강도 분석에서 His군과 대조군 간에는 유의한 차이가 없었으나 RV군에서는 형광강도가 약 15% 증가하여 유의한 차이를 보였다(p<0.05). RV+His군에서의 평균형광강도는 대조군과 His군에 비해 각각 유의하게 증가하였으나(p<0.05), RV군과는 의미 있는 차이가 없었다(Table 1). 이 결과는 RV 감염에 히스타민 처치는 A549 세포에서 ICAM-1 발현 증가에 서로 상승효과를 나타내지는 않았음을 의미한다.

IL-6, IL-8의 농도
   IL-6 농도는 RV 군, His군 및 RV+His군 모두에서 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05). 그러나 RV+His 군의 IL-6 분비는 RV군이나 His군과 비교했을 때 유의한 차이가 없었다.
IL-8 농도는 RV군, His군 및 RV+His군 모두에서 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(p<0.05). 또한 IL-6의 분비와는 달리 RV+His군의 IL-8 농도는 RV군이나 His 군과 비교했을 때 유의하게 증가하였다(p<0.05)(Table 1). 이 결과는 RV 감염과 히스타민 처치는 A549 세포에서 IL-8 분비에 서로 상승효과를 일으킴을 의미한다.

바이러스 역가
   MRC-5 세포배양을 이용한 바이러스 역가 검사에서 RV+ His군의 역가가 RV군에 비해 유의하게 높았으며(p<0.05)(Fig. 1), 히스타민 처치는 그 농도에 비례하여(dose-dependent manner) A549 세포에서의 RV의 역가를 높였다(Fig. 1).

고     찰

   RV 감염은 알레르기 비염환자에서 비만세포의 히스타민 분비를 촉진시킬 뿐만 아니라 하기도의 히스타민에 대한 반응성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.⁹⁾¹³⁾ 또한 알레르기 비염환자에서는 RV 감염 후 히스타민의 유출이 48시간까지 지속되어 RV 감염에 의해 증상을 악화시킨다.¹⁴⁾ 천식환자에서 RV 감염 후 증상이 심하게 발현되는 것은 히스타민에 대한 기도의 과민성을 대변할 수 있으며, 이는 IL-8과 같은 chemokine들에 의해 매개되는 것으로 알려져 있다.¹⁵⁾ 히스타민은 알레르기 반응에서 가장 중요한 화학적 매개체로 cytokine의 분비와 염증세포의 유착 과정에 중요한 역할을 담당한다.¹⁶⁾ 히스타민은 기관지 상피세포에서 ICAM-1의 발현을 증가시키고 내피세포에서 IL-6, IL-8의 생성을 촉진한다.^10)11)12) 그런데 ICAM-1은 기도상피세포에서 RV의 주된 수용체이고 IL-6와 IL-8은 RV 감염의 병태생리에 중요한 역할을 담당하므로¹⁷⁾ 히스타민은 RV 감염을 촉진시키고 RV 감염으로 인해 IL-6, IL-8의 분비는 더 증가될 것이라고 추정할 수 있다. 그러므로 저자들은 A549 세포에서 RV 감염에 의한 ICAM-1의 발현, cytokine 분비 및 바이러스 역가의 변화를 통해 히스타민이 RV 감염에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. 실험에 이용된 히스타민의 농도(10^-3, 10^-4, 10^-5 M)는 실제 생리학적 조건에 비해 높지만 히스타민의 최대 효과를 유도하기 위해 고농도의 히스타민을 사용하였다.¹¹⁾¹²⁾
   혈관내피세포, 상피세포, 및 섬유아세포에서 생성되는 ICAM-1은 세포 표면에 위치하는 당단백으로 염증반응에 의한 백혈구의 이주에 중요한 역할을 하고, 기도상피세포에서 RV의 수용체로서 작용하며 RV 감염에 의해 그 발현이 증가한다.¹⁷⁾ 본 실험에서 RV 감염과 히스타민 처치는 ICAM-1 발현에 서로 상승작용을 나타내지는 않았다. RV 감염에 의해 ICAM-1의 발현은 증가했지만 히스타민 단독 처치 때는 의미 있는 증가가 일어나지 않은 것은 RV+His군에서 나타난 ICAM-1의 증가가 RV 감염에 의한 것임을 시사한다. 이러한 실험결과는 기존의 연구에서 히스타민이 ICAM-1의 발현을 증가시킨다는 보고¹⁰⁾와 상이하며 이전의 연구에서는 천식이 없는 환자의 기관상피세포를 솔질(brushing)로 얻어 히스타민으로 자극한 후 면역조직화학염색으로 ICAM-1의 발현이 증가한다고 보고하였으나 이는 본 연구와 세포주나 분석방법(유세포분석)의 차이에 기인할 것으로 생각된다.
   한편, RV 감염에 의한 IL-6의 분비는 히스타민 처치에 의해 의미 있는 변화를 보이지 않았으나 RV 감염에 의한 IL-8의 분비는 히스타민 처치에 의해 더욱 증가되는 것으로 나타났다. IL-6는 다영양성(pleotrophic) cytokine으로 림프구의 활성화와 성장 및 증식에 관여하고 발열을 유도하여 바이러스성 상기도염의 증상 발현에 일조한다.¹⁷⁾ IL-8은 다양한 자극에 반응하여 여러 종류의 세포에서 생성된다. IL-8은 RV 감염에서 호중구에 대한 강력한 화학주성인자로 작용하여 호중구의 세포독성과립의 분비를 초래한다.¹⁷⁾¹⁸⁾ RV 감염은 IL-6와 IL-8의 생성을 자극하며 RV 감염에 의한 증상의 중증도는 IL-6와 IL-8의 분비량에 비례하는 것으로 알려져 있다.¹⁹⁾ 본 실험에서 히스타민이 IL-8 분비를 강화시키는 것으로 나타났으며 이는 히스타민이 RV 감염에 의한 증상을 악화시킬 수 있음을 시사한다. 히스타민은 기관지 상피세포에서 H1 수용체와 결합하여 leukotriene B4(LTB4)의 생성, NF-κB의 활성화 및 IL-8의 발현 증가를 유도한다.²⁰⁾ NF-κB의 활성화는 RV 감염의 병태생리에서 핵심이 되는 단계로 이는 ICAM-1과 IL-1β, IL-6, IL-8 등 여러 cytokine의 생성을 담당하는 유전자의 발현을 증가시킨다.¹⁸⁾ 따라서 히스타민과 RV 감염은 모두 NF-κB를 증가시키므로 이를 통해 히스타민이 RV 감염에 의한 IL-8 분비 증가를 강화시킨다고 추정할 수 있으나 ICAM-1 발현과 IL-6 분비에서 의미 있는 변화가 없는 것은 설명이 되지 않는다. 히스타민과 RV 감염이 NF-κB를 증가시키나 주로 IL-8 분비 증가가 나타날 가능성이 있고 IL-8 분비 증가가 다른 신호전달체계를 이용할 가능성도 있다. 그러나 본 실험만으로는 신호전달체계의 조절까지 밝혀내기에 제한점이 있다.
   저자들은 히스타민이 그 농도에 비례하여 바이러스 역가를 상승시키는 것을 알 수 있었다. 기도상피세포에서 RV 감염의 형성은 대부분 ICAM-1과의 결합에 의해 이루어지는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서 히스타민 처치가 RV 감염에 의한 ICAM-1 발현 증가에 의미 있는 변화를 나타내지는 않았음에도 불구하고 바이러스 역가가 증가한 사실은 히스타민은 ICAM-1의 발현 증가와는 다른 기전을 통해 RV 감염을 증가시킬 수 있음을 시사한다.
   본 연구는 실험실적인 조건에서 히스타민과 RV 감염이 IL-8 분비와 바이러스 역가에서 서로 상승효과를 나타낸다는 최초의 보고이다. 이는 히스타민이 RV 감염에 의한 증상을 보다 악화시키고 RV 감염을 증가시킬 가능성이 있음을 시사한다.

결     론

   히스타민은 실험적 조건에서 기도상피세포에서 RV 감염 후 IL-8의 분비 증가를 심화시키고 그 농도에 비례하여 바이러스 역가를 증가시킨다.

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