Role of Human Papillomavirus Infection in Laryngeal Cancer.

Jun, Hyung Kyung; Nam, Soon Yuhl; Kim, Hyuk; Kim, Sang Yoon; Huh, Joo Ryung

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(4); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(4): 512-517.

Role of Human Papillomavirus Infection in Laryngeal Cancer.

Hyung Kyung Jun, Soon Yuhl Nam, Hyuk Kim, Sang Yoon Kim, Joo Ryung Huh

¹Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea. synam@www.amc.seoul.kr
²Department of Diagnostic Pathology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea.

후두암 환자에서 인유두종 바이러스 감염의 역할

전형경¹ · 남순열¹ · 김 혁¹ · 김상윤¹ · 허주령²

울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실1;진단병리학교실2;

주제어: 인유두종 바이러스ㆍ후두암ㆍ중합효소 연쇄반응ㆍ점상블롯.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Cigarette smoking and alcohol consumption are well known risk factors of laryngeal squamous cell carcinoma. Recently, attention has been focused on other risk factors such as human papillomavirus (HPV). The presence of HPV genome in the tumor has been reported to correlate with poor patient outcome. The integration of viral genome into the host DNA is believed to be helped by alcohol and cigarette smoking. This study attempted to evaluate the incidence of HPV in laryngeal cancer with regard to its stage and recurrence.
MATERIALS AND METHODS:
The authors examined the incidence of HPV in 61 cases of laryngeal cancers (34 supraglottic cancers, 26 glottic cancers, 1 subglottic cancer). The histologic type of tumor in all cases was squamous cell carcinoma. There were 8 patients in the stage 1, 26 patients in the stage 2, 14 patients in the stage 3 and stage 4. Recurrence of the disease during follow-up periods occurred in 12 patients (19.6%). Polymerase chain reaction (PCR) was performed using the consensus primers for HPV on the formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissue. For cases with amplified products corresponding to the HPV genome, a dot blot hybridization was performed for typing the different HPV types.
RESULTS:
The HPV genome was identified in 5 cases (8%) of laryngeal squamous cell carcinomas by using PCR. In recurrent laryngeal cancer group, detection rate of HPV DNA was significantly greater than in the non-recurrent group (p<0.05). The dot blot hybridization showed only one case to be the HPV type 31. The other cases (4 cases) could not be typed using the dot blot hybridization.
CONCLUSION:
We can only say that the possible role of HPV in the carcinogenesis of larynx cancer is not yet resolved.

Keywords: Human papillomavirusㆍLaryngeal cancerㆍPCRㆍDot blot hybridization

서론 후두암은 환자의 음성 기능 및 연하 장애를 초래함으로 조기 발견 및 치료가 중요하다. 그러나 후두암의 원인에 대한 연구는 음주와 흡연이 관련이 있다는 역학 조사가 이루어 졌을 뿐 암의 형성에 대한 기전은 아직도 모르고 있는 실정이다. 최근 인유두종 바이러스(human papillomavirus：이하 HPV)가 생식기암(genital carcinoma)과 후두 유두종에서 관련이 있는 것으로 밝혀진 후 후두암에서의 관련성에 대한 연구가 진행되고 있다. 인유두종 바이러스는 특히 후두의 verrucous carcinoma에서 상당히 높은 빈도로 발견되고 있으며 일반적인 후두의 편평세포암종에서의 HPV는 보고자에 따라 0%에서 50% 이상까지 다양하다.1-3) 이와 같이 HPV의 DNA 검출에 많은 차이를 보이는 이유로 생각할 수 있는 것은 분석 방법의 차이, 시발체(primer)의 적절성, 연구 대상 및 지역간의 차이 등을 들 수 있다. HPV는 지금까지 60여 가지가 밝혀 졌는데 후두에서는 유두종이나 verrucous carcinoma와 같은 증식성 질환에서 가장 흔히 발견되고 있다.4)5) 바이러스의 종류 중 HPV 6와 11은 저위험군으로 후두 유두종과 같은 양성 종양에서 흔히 발견되며, HPV 16과 18은 고위험군으로 분류되어 설암, 인두암, 후두암 등의 악성 종양에서 흔히 발견된다는 주장도 있다.6) 이처럼 후두의 악성 종양과 HPV와의 연관성에 대한 가능성이 제기되고 있지만 아직도 HPV의 후두암에서의 역할 및 의의에 대해서는 아직도 명확히 제시되어 있지 않는데 그 가장 큰 문제점이 후두암에서의 HPV의 존재가 타 증식성 질환(유두종이나 verrucous carcinoma)에서 처럼 많은 수에서 나오지 않아 암화기전에 어떤 역할을 한다고 결론을 내리기가 어렵다는데에 있다. 후두암에서 HPV 역할을 밝히기 위해서는 후두암 조직내에서 바이러스 존재를 증명해야 한다. 이러한 바이러스 검출 방법으로 면역조직화학 기법(immunohistochemical technique), in situ hybridization, Southern blot hybridization과 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction：이하 PCR) 등이 있지만 이중 PCR은 바이러스 입자가 소량 들어있는 조직에서도 바이러스의 DNA나 RNA의 검출을 가능하게 만들어 가장 검출률이 높은 예민한 검사로 주목을 받고 있다.7) 저자들은 후두암과 HPV와의 연관성에 대해 알아보고자 후두암 환자의 파라핀 포매조직을 이용하여 L1영역 primer를 통한 PCR기법으로 HPV를 일차적으로 screening 하였고, HPV 감염이 확인되면 점상 블롯(dot blot hybridization)을 이용하여 HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 등 총 12가지의 HPV 종류에 대한 아형 분석(typing)을 실시하였다. 환자의 임상적 양상과 HPV 감염과의 상관성 및 암화에 특이적으로 관여하는 HPV 아형의 존재여부를 알아보고자 본 연구를 시행하였다. 대상 및 방법 조직선정 1995년 1월부터 1997년 6월까지 서울중앙병원 이비인후과에서 조직검사를 통하여 후두암종으로 진단된 61례(성문상부암 34례, 성문암 26례, 성문하부암 1례)를 대상으로 하였으며 이전 후두 유두종의 병력이 있는 환자는 제외하였다. 얻어진 조직은 모두 포르말린으로 고정한 후 파라핀 포매를 시행하였고, hematoxylineosin 염색소견상 모든 환자가 편평세포암종이었다. 환자는 남자 57명과 여자 4명으로 남자가 많았으며, 연령은 30세에서 79세로 평균 63세였다. American Joint of Cancer Committee의 분류방법에 따른 환자의 T 병기는 1기가 8례, 2기가 26례, 3기가 14례, 그리고 4기가 13례였다. 추적 기간은 2개월에서 30 개월로 평균 13개월이었다. 추적 기간내 재발의 증거를 보인 환자는 총 12명(19.6%)으로 성문상부암이 9례, 성문암이 3례였다. 병리조직학적 분화도는 분화가 좋은(well differentiated) 암이 29례, 중등도(moderately differentiated)가 23례, 분화가 좋지 않은(poorly differentiated) 암이 9례였다. 대상례의 조직표본 재료는 적출된 조직의 hematoxylineosin 염색 표본을 검토하여 종양이 많이 포함되고 파라핀 포매조직의 보관상태가 양호한 부위를 선택하였다. DNA 분리(DNA extraction) 파라핀 조직 블록을 8 μm 두께로 3내지 5등분으로 절편하여 xylene 처리를 통하여 탈파라핀화 시킨후, 70% 에탄올 1 ml를 이용하여 2회 세척한 후 56℃에서 30분간 건조시켰다. 세포막의 파괴를 위하여 100 μl의 digestion buffer(50 mM tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.5% Tween20)에 부유한 후 proteinase K(20 mg/ml) 5 μl 등을 넣고 분해된 것이 확인될 때(over-night)까지 incubation 하였다. 이후 2회, 10분간 끓는 물에 둔 후, 다시 spindown 30초 후 그 상층액을 PCR 반응에 이용하였다. 시발체(primer)의 준비 시발체는 DNA 합성기에서 임의로 합성할 수 있으며 대략 20 mer(20개의 nucleotide) 정도가 실용적이다. 먼저 HPV 감염여부에 대해 screening하기 위하여 -globin 양성으로 반응된 sample을 Manos 등 8)이 명명한 consensus primer(MY11과 MY09)를 사용하였다. HPV 16과 18의 시발체로는 각각 257 bp와 227 bp크기의 내부 시발체가 사용되었다(Table 1). 중합효소반응(PCR) Sample의 중합효소반응은 screening용으로 consensus primer(MY11과 MY09)를 사용하였으며 HPV 16과 18의 시발체로는 각각 257 bp와 227 bp크기의 내부 시발체가 사용되었다. 16과 18을 제외한 바이러스의 typing은 다음에 소개되는 점상 블롯 기법을 이용하였다. 중합효소반응은 분리된 DNA 0.5 μg과 25 pmol MY11 1μl, 25 pmol MY09 1 μl, bovine serum albumin 10 μl, 2.5 mM dNTP 8 μl, Taq polymerase 1.5 U/μl, 10X buffer 2.5 μl, 탈이온수 적량을 혼합한 후 94℃에서 변성반응(denaturation), 56℃에서 결합반응(annealing), 72℃에서 연장반응(extension)을 총 30회 반복 시행하였다. 이러한 반응은 Gene Amp PCR system 2400(Perkin Elmer 사)을 이용하여 자동처리 하였다. 증폭된 DNA의 일부를 5% 한천 겔(agarose gel)에서 전기 영동하고 ethidium bromide 용액으로 염색하여 자외선 투사기(ultraviolet transilluminator)에서 260 nm로 관찰하고 밴드가 확인되면 폴라로이드 카메라로 촬영하였다. 점상 블롯(dot blot) Screening에서 HPV 존재가 확인된 검체를 PCR 증폭을 위해 sequence specific biotinylated primer set을 사용하였다. 먼저 HPV type 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 유형별로 각각의 tailed oligoprobe를 만들었다. Tailing mixture는 200 pmol oligonucleotide, 60 unit terminal transferase, 10 mmol dTTP, 1X reaction buffer 등을 섞어 37℃에서 60분간 반응시킨후 10 mM EDTA 100 μl를 첨가하였다. Tailing mixture를 20X standard saline citrate(SSC) 95 μl에 희석하여 미리 준비한 nylon strip에 12개의 well을 만들어 각각의 well에 HPV 유형별로 자외선(50 mJ/cm 2)을 이용하여 고정하였다. 이후 Hybridization buffer(5X SSPE와 0.5% SDS) 200 ml로 55℃에서 12분간 가열하여 denaturation 시켜 이중 30 μl를 Hybridization buffer：Enzyme conjugate(3.0 ml：10 μl)와 반응시켰다. 발색반응을 위하여 citrate buffer 10 ml에 TMB chromogen solution 0.5 ml와 30% H 2O 2 5 μl를 넣어 실온에서 흔들어 준 뒤 적당히 발색되면 증류수로 씻어 반응을 정지시켰고 물기를 제거한 후 마른상태로 보관하였다. 자료분석과 통계처리 HPV DNA 검출 유무와 환자의 임상병리학적 발현 양상에 따른 발생 빈도의 차이는 X 2-검정을 이용하였고 표본수가 적은 경우에는 Fisher’s exact test로 하였다. 유의성 검정에서 유의수준을 p<0.05 범위로 하였다. 결과 HPV DNA의 검출과 환자의 임상병리학적 양상과의 관계 61명의 환자 중 L1 영역 MY 시발체를 이용한 screening에서 HPV DNA가 총 5례에서 검출되었다. 5례는 모두 남자 환자였으며 연령별로는 60세 이상이 4례로 고령의 환자에서 비교적 많이 검출되었으나 통계적으로는 유의하지 않았다. 원발병소에 따른 HPV DNA 분포는 성문상부암에서 총 34례 중 2례(6%), 성문암 총 26례 중 3례(12%)로 성문암에서 많았으나 원발병소에 따른 통계적 유의성은 없었다. 병기별로는 T2에서 3례, T3와 T4에서 각각 1례로 모두 T2 이상에서 발현되었으나 병기별로 통계적 유의성은 없었다. 암세포에 대한 분화도에 따른 HPV DNA 발현율은 well differentiated 환자군 29명 중 4명(14%)과 moderately differentiated 환자군이 23명 중 1명(4%)이었으며 통계적 유의성은 없었다(Table 2). 재발된 환자군에서는 총 12명 중 3례(25%)에서 HPV DNA가 검출되어 재발되지 않은 나머지 49명 중 2례(4%)에서 검출되는 확률보다 재발된 환자군에서의 발현 빈도가 높았다(Table 3)(p<0.05). HPV 아형 검색 HPV 16과 18의 시발체인 257 bp와 227 bp 크기의 내부 시발체를 이용한 PCR 이나 점상 블롯을 통해 성문암이 있던 남자환자 한명에서만 HPV 31형으로 증명되었고 나머지 4명의 환자들은 아형 분석이 이루어지지 않았다(Table 4). 즉 4명의 환자들은 검색이 가능한 HPV type 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 이외의 다른 아형의 HPV 감염을 보였다. 고찰 현재까지 가장 일반적으로 받아들여지고 있는 HPV의 암화 기전은 HPV의 ‘early’ gene 중 암 기전에 관련이 있다고 생각되는 E6, E7의 발현이 숙주 DNA와 결합함으로써 이루어지는 것이다. 이들 E6, E7 단백이 암억제 유전자(tumor suppressor gene)인 p53 및 RB 유전자 산물과 각각 결합함으로써 암억제 유전자의 기능을 불활성화 시키는 것이 HPV 발암의 기본 가설로 일반화 되어있다. 그외에도 Bernard 등9)은 자궁경부암 및 생식기암에서 암유전자(oncogene)인 c-Ha-ras와 c-myc의 발현이 HPV의 존재와 밀접한 관계가 있음을 밝혀냈다. 그는 이러한 결과를 HPV가 숙주 DNA와 융합할 때 c-Ha-ras와 c-myc의 발현을 활성화 시킴으로써 숙주세포의 암화를 유발하는 것으로 생각하였다. 이러한 발암기전을 뒷받침하는 여러가지 주장은 자궁 경부암 뿐만 아니라 후두암에서도 제시되고 있다.10-13) Pei10)는 소위 고위험군으로 분류되는 HPV 18형이 E6, E7에 의해 keratinocyte의 증식과 p53과 RB 유전자의 장애를 초래하여 mutagenesis를 잘하게 될 것으로 주장했다. Lopez-Amado 등11)은 증식성 종물로 발현되는 후두의 verrucous carcinoma에서 HPV의 감염과 mutant type p53의 과발현이 보인다고 주장했다. 이러한 가설은 앞으로도 더 검토할 필요가 있을 것으로 생각되며 특히 후두암에 있어서는 보다 더 조심스럽게 다루어져야할 사안으로 보여진다. 왜냐하면 HPV가 후두암에서는 임상적 중요성이 자궁경부암과는 다르기 때문이다. 즉 아직도 HPV 역할에 대한 많은 이견이 있고 후두암에서의 HPV의 존재에 대한 연구가 정립된 결과가 없어 과연 후두암과 HPV의 관련성에 대한 본질적인 의문이 있다. 후두 양성종양인 유두종에서는 대부분에서 HPV 감염이 확인되고 있으며 그 중 대부분이 HPV 6과 11형이라는데는 큰 이견이 없는 듯 하다. 반면에 후두암에서는 지금까지 HPV가 관련이 있다는 주장에 따르면 자궁경부암과 비슷하게 HPV 16과 18형이 세포의 악성화와 많이 관련되는 것으로 받아들여지고 있다. 그러나 본 저자들의 연구에서는 61례의 후두 편평세포암종 환자에게서 HPV DNA의 검출률이 총 5례(8%)로 후두암에서의 HPV 발현률이 상당히 낮은 것으로 나타났다. 또한 검출된 HPV의 아형도 후두암에서 많이 발견될 것으로 예상된 16이나 18형이 아닌, 31형과 아형 분석상 HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56 형 이외의 다른 아형의 HPV의 감염으로 밝혀졌다. HPV의 검출과 관련된 환자의 임상 양상은 성별, 연령별, 원발암의 위치, T 병기, 세포분화도 및 재발 유무와의 관계 분석을 통해 이루어 졌다. HPV가 검출된 환자 5례 모두가 남자였지만 후두암에서 남자환자가 차지하는 비중이 월등히 앞서기 때문에 통계적으로는 유의하지 않았다. 연령별로는 60세 이후에서 4례가 검출되어 60세 이전의 1례보다는 많았지만 역시 대부분의 환자가 60세 이후의 고령환자인 관계로 통계적인 의의는 없었다. 이는 젊은 연령에서 HPV 감염이 많이 동반되었다는 보고와는 차이가 있다.2) 암종의 위치별 HPV DNA 분포는 성문암에서 총 26례중 3례(12%)로 총 34례중 2례(6%)인 성문상부암에서보다 많았지만 통계적으로는 유의하지 않았다. 이와 같은 사실은 Hoshikawa 등2)이 발표한 성문암에서의 HPV 검출률이 9례중 4례(44.4%)로 성문상부암 23례중 2례(8.7%)보다 많았다는 결과와 상당히 비슷한 결과를 보였다. T 병기 및 세포분화도와 HPV와의 상관관계는 상호 큰 차이를 밝힐 수 없었다. HPV가 환자의 8% 밖에 검출되지 않아 전체적인 임상적 유의성을 말하긴 곤란하지만 한가지 특이한 사실은 전체 61명의 환자 중 12명(19.6%)의 환자에서 재발이 있었는데 이중 3례(25%)에서 HPV DNA가 검출되었고 재발이 없었던 49명 중 2례(4%)에서 검출되어 재발된 환자군에서의 발현 빈도가 높다는 점이다(p<0.05). 결과는 통계적으로 유의하였으며 재발을 잘하는 후두암에서 HPV의 검출률이 좀 더 높아 후두암 환자에게서의 HPV의 검출은 환자 예후와 관련이 될 수 있음을 시사하였다. 하지만 stage와 치료방법 등의 차이가 재발에 기인했을 가능성도 높다. 재발이 HPV 감염과 관련이 있음을 증명하기 위해서는 재발에 영향을 미칠 수 있는 다른 여러 인자들에 대한 다양한 검정이 필요하겠다. 후두암과 HPV의 역할에 대한 보고들 3)6)13-17)을 종합하여 보면 후두암에서 HPV의 검출률은 0%에서 54%로 다양하게 보고되고 있다.PCR의 결과만 따지고 보면 16%에서 54%까지라고 할 수 있다(Table 5). Ogura 등16)은 31개의 조직 검체를 PCR과 Southern blot analysis를 동시에 이용하여 각 기법에 따른 HPV 검출 양상을 알아본 결과 다섯 검체에서 HPV의 존재를 확인할 수 있었다. PCR을 이용하였을 때 HPV 16형이 다섯 검체에서 나왔는데 반해 Southern blot analysis에서는 오직 한 개에서만 검출되었다. 이 차이는 검출이 안된 네개의 검체에서 HPV 함유량이 상대적으로 미세했을 것으로 생각되며 DNA 증폭을 통한 미세한 양까지 검출이 가능한 PCR 기법이 좀 더 민감도가 큼을 시사한다. 두 연구에서 정상 후두점막과 후두암을 비교하는 대조 연구를 시행하였는데 그들의 연구에서는 대조군인 정상 후두점막군과 후두암과의 바이러스 검출률을 각각 5%와 3%, 54%와 50%로 비슷하게 보고하고 있다.3)6) 그러나 대조군으로 선택된 정상 후두점막군이 후두암에 의한 후두 전적출술을 통해 얻어진 검체중 암위치와 무관한 반대편 성대조직을 이용한 것이어서 이들이 실제 정상을 대변하는 집단이라고 말하기는 힘들다. 또다른 연구14)15)에서는 후두 질환 없이 사망한 환자의 후두점막을 부검(autopsy)을 통해 채취하여 검체가 비교적 정상 후두조직과 가깝다고 할 수 있는데 이 검체에서도 HPV의 유병율이 각각 19%와 25%로 나타났다. 이는 본 연구 결과인 후두암에서 8% 검출된 것과 비교해 볼때도 오히려 많은 결과이다. 그러므로 HPV DNA는 정상적인 후두점막에서도 존재할 수 있다는 가정이 성립되며, 이와 더불어 HPV가 후두암의 암화 기전에 직접적인 관련이 있을지 상당한 의문을 갖게한다. 이상으로 미루어 볼 때 HPV가 후두암의 암화 기전에 어떠한 역할을 할지는 확실하지 않다. 본 연구뿐만이 아닌 기존의 다른 저자들에 의해서도 후두암에서 HPV 검출률이 낮게 나온다는 보고가 있는 것을 보면 후두암의 암화 기전에 HPV가 관여할 것이라는 결론을 내리기에는 무리가 있는 것으로 보인다. 결론 후두암 환자 61례의 조직 표본을 대상으로 PCR을 이용하여 HPV DNA를 총 5례(8%)에서 검출하였다. 이와 같은 결과는 HPV감염과 후두암의 발현과는 상관관계가 없음을 나타낸다. 하지만 재발이 있던 환자군과 재발이 없던 환자군에서 HPV 검출률이 각각 25%, 4%로 재발이 있었던 환자군에서 유의하게 높게 나와(p<0.05) HPV 검출과 환자의 예후와는 관련이 있을 것으로 생각된다. 따라서 HPV 감염은 후두암의 일차 병인이기 보다는 재발 등에 관여하는 잠재 인자로서 작용할 가능성이 많겠으며 이를 보완하기 위하여 향후 좀 더 많은 연구와 검정이 필요하겠다.
REFERENCES
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