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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(1): 76-81. |
| Distribution of Cytokeratins in Cholesteatomas according to the Induction Period of Cholesteatoma in Gerbil. |
| Chong Sun Kim, Jong Woo Chung, Seung Ho Choi |
1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Seoul National University, Seoul, Korea.
2Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea. |
| Gerbil에서 유발기간에 따른 중이진주종의 Cytokeratin 분포 |
| 김종선1 · 정종우2 · 최승호1 |
| 서울대학교 의과대학 이비인후과학교실1;울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실2; |
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| ABSTRACT |
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The exact pathogenesis of aural cholesteatoma is not yet fully understood in spite of many studies. Animal models are very important in studying the pathogenesis of aural cholesteatoma because such models can provide large quantities of tissue and the environment is easily controlled. Distribution of cytokeratins in experimentally induced aural choesteatoma was studied in gerbils. Success rate of the induction of cholesteatoma was 60% to 100% according to the duration of external auditory canal ligation. In cholesteatomas, the distribution of cytokeratin was similar to that in external auditory canal skin, but different from that in middle ear mucosa. Among all cholesteatomas with different duration of external auditory canal ligation, the distribution of cytokeratin was same.
The results of this study suggest that the external auditory canal ligation is successful and reproducible method in making experimental aural cholesteatoma in gerbil, and the cholesteatoma can be induced by the migration of external auditory canal skin. The cytoskeleton of cholesteatoma may be changed at certain time in the course of cholesteatoma while the characteristic pattern of cytoskeleton may not be changed. |
| Keywords:
CholesteatomaㆍExternal auditory canal ligationㆍCytokeratinㆍPathogenesisㆍAnimal model |
서론
진주종성 중이염의 병리소견에 대한 많은 연구에도 불구하고 현재까지도 그 병태생리에 대한 논란이 있는 것은 적합한 동물모델이 없었기 때문이며, 1950년대 이후에는 몇몇의 연구자들에 의해 기니픽 및 토끼에서 진주종을 유발시킨 결과들이 있지만,4)8)9)10)15) 진주종 유발빈도가 낮고 항상 일정한 결과를 유지하지 못하는 것이 문제가 되었다. 최근에는 gerbil을 이용한 진주종 유발 모델12)이 각광을 받고 있으며 이를 이용한 연구가 계속되었다.11)19) 그러므로 동물에서 진주종 유발모델을 확립하는 것은 향후 계속되는 연구에 없어서는 안 될 필수적인 것이라고 할 수 있다.
Cytokeratin은 포유동물의 cytoskeleton중의 하나이며 세포의 변형 또는 성질의 변화에도 그 특이성을 그대로 유지하고 있으므로 cytokeratin의 발현양상을 통하여 진주종 상피의 기원조직을 추측할 수 있고 또한 진주종의 발생시기에 따른 변화의 양상을 알 수 있다. 지금까지 사람의 중이진주종에 관한 cytokeratin 연구가 많이 보고되었으나, 이는 일정한 시기의 중이진주종의 상태를 반영한 것일 뿐 그 세포학적인 특성의 변화를 추적하지는 못하였다.
본 연구에서 gerbil을 이용하여 외이도결찰법으로 진주종 유발모델을 만들고 각각 서로 다른 결찰기간을 가진 진주종의 상피세포를 이용하여 형태학적인 검사 및 anti-cytokeratin 면역염색을 하여 진주종의 발생기원 및 발생기전 그리고 진주종의 시간에 따른 특성 등을 보다 자세히 알고자 하였다.
연구방법
생후 2∼4개월된 Mongolian gerbil(Mariones unguiculatus) 30마리에서 외이도 결찰방법12)으로 중이 진주종을 유발시켰다. 실험동물들을 각각 1, 2, 3, 4, 6, 9개월후에 5마리씩 희생시켜서 측두골을 얻은 후 10% 포르말린으로 고정하고, 탈석회화, 탈수과정을 거쳐서 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직을 6μm의 두께로 박절하고, hema-toxylin-eosin염색으로 형태학적인 검사를 하였다. 외이도 결찰후 유발된 진주종은 Chole등7)의 분류에 따라 stage I부터 stage V까지로 나누었다(Table 1). 면역조직화학적 검사는 Vectastain ABC kit(Vector, USA)를 이용한 peroxidase-antiperoxidase 방법을 이용하였고, DAB로 발색시키고, Meyer’s hema-toxylin으로 대조염색을 시행하였다. 염색과정마다 항 cytokeratin 항체대신 항체희석용액을 넣어서 음성대조군을 삼았다. 연구에 사용한 항 cytokeratin 및 실험시 사용한 희석비율은 Table 2와 같다.
연구결과
1. 각 외이도 결찰기간에 따른 중이진주종의 형태학적 특징
외이도 결찰기간에 따른 중이진주종을 각 stage별로 분류한 결과는 Table 3과 같다. 외이도 결찰 1개월째는 고막의 내측 함몰이 거의 관찰되지 않았고, 5마리중 3마리에서 고막외 부분에 keratin 축적이 관찰되었다. 결찰 2개월째는 5마리중 3마리에서 고막외 keratin 축적이 관찰되었고, 1마리에서는 고막의 내측 함몰이 관찰되었다. 결찰 3개월째는 5마리중 1마리에서, 4개월째는 5마리중 3마리에서, 6개월째는 5마리중 4마리에서 진주종상피가 와우점막과 닿아있는 것이 관찰되었다(Fig. 1). 결찰 6개월째의 1마리와 9개월째의 4마리에서 진주종이 중이내를 가득 채우고 있는 소견이 관찰되었다(Fig. 2).
2. Anti-cytokeratin 면역조직화학염색 결과
각각 정상 외이도 상피, 정상 중이점막 상피 및 진주종 유발 1, 2, 3, 4, 6, 9개월후의 중이진주종 상피조직에서의 anti-cytokeratin 면역염색의 결과는 Table 4와 같다.
외이도 상피조직에서는 cytokeratin(CK) 4와 CK 10에 대해 suprabasal layer에서 양성반응을 보였고, 나머지 anti-cytokeratin에 대해서는 음성반응을 보였다. 중이진주종은 CK 4에 대해서는 granular layer와 corneal layer에서 양성이었으며, 중이진주종 유발기간이 길어질수록 기저층을 제외한 전층에서 염색되었다. CK 10은 suprabasal layer에서 K8.12는 전층에서 염색되었으며, 이는 진주종 유발기간에 상관없이 일정하였다. 또한 중이진주종에서 염색되는 소견은 병변의 정도, 진주종의 주위조직의 파괴정도에 상관없이 일정하였다. 정상 중이점막 상피세포에서는 CK 4와 CK 13을 제외한 모든 anti-cytokeratin에 대해 음성반응을 나타내었다.
고찰
Friedmann9)은 기니픽의 귀를 Pseudomonas pyocyanea 또는 Streptococcus pneumoniae으로 감염시킨 후 266마리중 6마리에서 진주종이 생긴 것을 보고하였다. 이렇게 생긴 진주종은 중층상피세포가 외이도로부터 중이로 유입되어서 생긴 것으로 보이나, 이러한 감염모델을 이용한 진주종의 유발에서는 여러가지의 문제점을 발견할 수 있다. 우선, 진주종 유발의 빈도가 너무 낮고, 진주종의 유발여부를 쉽게 알기가 어려우며, 항상 세균에 의한 염증을 동반하고 있다는 점이다. Ruedi15)는 talc와 fibrin을 기니픽의 고막내부에 반응시켜서 기저층의 과증식을 유발시켰으나 이 경우에도 21마리중 3마리에서 진주종이 유발되어 낮은 진주종 유발 빈도를 보였다. Fernandez와 Lidsay8)는 quinine과 alcohol을 기니픽의 중이강내에 주사하여 고막으로부터 각화세포가 중이강내로 유입되는 것을 관찰하였으나 확실한 진주종의 유발을 관찰하지는 못하였다. Abramson등4)은 기니픽의 중이강에 외이도 피부조직을 이식시켜서 21마리중 4마리에서 상피낭종을 유발시켰고, talc를 이용하여서는 11마리중 4마리에서 상피낭종을 유발시켰다. 이러한 상피낭종은 골흡수의 소견을 보여서 사람의 진주종에서와 같은 병태생리를 보였으나 이러한 상피낭종의 생성을 상피세포의 유입으로 보아야 할 지 또는 중이점막의 수술적인 조작에 의해서 생성된 것으로 보아야 할 지에 대해서는 확실하지 않다. Jackson과 Lim10)도 이와 비슷한 연구를 하여 7마리중 5마리에서 진주종의 유발을 관찰하였고, Steinbach와 Gruninger16)는 36마리의 토끼의 외이도를 결찰하여 12마리에서 중이 진주종의 생성을 관찰하였다. Chole등7)은 생후 1 내지 2년된 Monglian gerbil을 관찰한 결과 70귀중 32귀, 즉 45.7%에서 진주종이 자연적으로 생겼으며 이 진주종이 내이미로와 두개강까지도 파괴하는 조직소견을 보인다고하여 gerbil의 진주종 모델이 사람의 진주종과 거의 유사한 형태의 동물모델임을 주장하였다.
이와 같은 많은 연구자들의 결과를 바탕으로 하여 McGinn등12)은 Mongolian gerbil의 외이도를 수술적인 방법으로 결찰한 결과 진주종이 유발됨을 증명하였고 이는 자연적으로 생긴 진주종과 조직학적으로 구분이 되지 않으며 또한 사람의 진주종과 유사한 골파괴, 주위조직의 파괴, 케라틴의 축적 등의 소견들이 발견되어 진주종의 병태생리를 연구하는 아주 적합한 동물모델임을 주장하였다. 또한 gerbil뿐 아니라 고양이, 기니픽, 햄스터, 쥐 등에서도 외이도 결찰을 이용한 실험을 하였지만 케라틴의 축적만이 있었을 뿐 고막의 함몰이나 주위조직의 파괴 등을 볼 수 없었기 때문에 더욱 gerbil의 진주종 모델의 우수성을 강조하였다.13) 본 연구에서는 gerbil을 이용하여 McGinn등12)의 방법과 같이 외이도를 결찰하여 중이진주종을 유발시켰는데, 전체 30마리중 24마리에서 성공하여 80%의 유발성공율을 나타내었다. McGinn등12)은 외이도 결찰후 2개월에서는 stage Ⅱ가 2마리, 4개월후는 stage Ⅲ 2마리, 그리고 9개월후는 stage Ⅳ 2마리를 관찰하여 외이도 결찰기간이 길어질수록 진주종이 심해진다는 것을 발견하였다. 박 등3)도 역시 외이도 결찰 2개월째부터 stage Ⅱ 4마리, 4개월째 stage Ⅲ 2마리, 그리고 6개월째 stage Ⅳ 1마리 등을 보고하여 비슷한 양상을 나타내었다. 본 연구에서도 다른 연구자들의 결과와 유사하여, 외이도 결찰기간이 길어질수록 진주종의 파급범위가 넓어짐을 알 수 있었다. 본 연구에서 진주종이 유발되지 않은 6마리의 동물은 각각 유발 1개월째 2마리, 2개월째 1마리, 3개월째 2마리, 4개월째 1마리였고, 6개월이상에서는 모두 진주종이 유발되었다. 이는 수술시 외이도 결찰이 불완전하게 되었더라도 시간이 흐름에 따라 정도의 차이는 있지만 중이진주종이 유발되는 것으로 생각된다. 또한 본 연구에서는 9개월까지 관찰한 결과 중이강을 벗어나서 두개내로 파급된 진주종을 발견할 수 없었으며, 이는 다른 저자들의 연구에 비추어 볼 때 결찰기간을 더 늘려서 관찰하면 발견할 수 있었으리라 생각된다.
Cytokeratin의 존재를 찾는 방법은 면역조직화학적 방법 뿐 아니라 조직에서 추출된 단백의 전기영동에 의한 방법이 있으나 어떤 일정한 조직에서 추출된 단백질이라도 혈액이나 혈관벽 등을 구성하는 단백질의 혼합을 피할 수 없으므로 그 조직만의 cytokeratin이라고 말하기는 곤란하다. 따라서 각 subclass가 어디에 어느 정도 발현하며 병적상황에서는 어떻게 변화하는가를 검색하는 면역조직화학적 염색법이 좋으며 결과에 관하여도 신뢰성이 있다고 알려져 있다.14) 면역조직화학적 방법으로 진주종의 기원을 설명하고자 한 연구를 보면, Van Blitterswijk등17)은 사람의 진주종의 기질과 외이도 상피, 그리고 중이강내의 상피조직에 대한 항 cytokeratin 염색을 한 결과, 진주종 기질과 외이도 상피조직에서 비슷한 양상의 cytokeratin 양성소견을 보였고, 중이강 내의 상피조직에서는 다른 양상의 양성소견을 보였다고 하여 진주종이 외이도 상피로부터의 유입에 의해 생겼을 것이라는 추측을 하였다. Chao와 Huang6)도 사람의 진주종을 이용하여 면역조직화학적인 염색을 통하여 위의 저자들과 같은 결과를 얻었다. 그러나 Broekaert등5)은 사람의 후천성 진주종에서 면역조직화학적인 염색을 통하여 진주종과 상피조직과의 유사성은 알 수 있었으나 진주종이 고막 또는 외이도 상피의 유입에 의해서 생긴 것인지의 여부는 알 수 없다고 하였다. 박 등2)도 사람의 중이진주종에 대한 cytokeratin 연구를 통해 중이진주종의 발생기전으로 상피설의 가능성을 시사하였고, 또한 김 등1)은 사람의 중이진주종, 외이도, 후이개, 고막 및 중이점막 상피세포에서 면역염색방법을 통한 cytokeratin 분포에 대한 연구를 하여 중이진주종의 기원이 표피상피임을 시사하는 결과를 얻었으나, 점막상피세포의 이형성에 의한 이론을 완전히 배제하기는 어렵다고 하였다. 본 연구에서는 중이 진주종 상피세포에 대한 항 cytokeratin 면역염색 결과 대개 외이도 상피세포에서와 유사한 양상이었고, 중이점막 상피세포와는 큰 차이를 보였다. 이를 통하여 중이진주종이 외이도 상피세포의 유입으로 인하여 생긴다는 결론을 얻을 수 있다. 그러나, 진주종의 유발방법이 외이도 결찰법이어서 Fig. 1에서와 같이 외이도 상피가 중이강속으로 유입될 수 밖에 없는 환경이었으므로 이는 당연한 결과라고도 볼 수 있다.그러므로 다른 방법으로 중이진주종을 유발시킨 후 이에 대한 항 cytokeratin 면역염색이 필요하리라고 본다. 또한 본 연구에서 시간의 경과에 따른 진주종 상피세포에서의 cytokeratin 분포는 차이가 없었는데, 진주종 유발 9개월까지의 결과임을 감안하더라도, 이는 일단 진주종이 생기면 그 성질을 그대로 유지하고 있음을 나타내고 있으며, 이러한 성질을 그대로 가지고 있는 한 수술적인 치료가 필수적인 것이라고 생각한다. 중이진주종은 K8.12에 대해 강한 양성반응을 보였는데, CK13에 대해 음성반응을 보이는 것으로 보아 이는 CK16에 대한 강양성반응으로 생각되며, CK16은 과증식의 지표가 되는 cytokeratin 으로서,18) 중이진주종의 과증식상태를 반영한다고 볼 수 있다. 중이점막상피세포에서도 K8.12가 양성이었으나 이는 CK13에 대한 양성반응인지 또는 CK16에 대한 반응인지는 더 연구해 보아야 할 것이다. 그리고, CK17은 외이도상피와 중이점막 상피세포에서는 음성으로 염색되었고, 중이진주종 상피세포에서만 양성으로 염색이 되었다. 이러한 결과로 보아 중이진주종이 대개 외이도 상피세포의 유입에 의해서 생기나 진주종으로 되기 위해서는 cytoskeleton의 변화, 좀 더 나아가서 단백질을 encoding 하고있는 유전자수준의 변화가 선행되어야 할 것으로 생각된다.
결론
Gerbil에서 외이도결찰법으로 유발한 중이진주종모델은 성공률 및 재연성이 뛰어난 방법이며, 유발된 진주종은 외이도 상피세포의 유입에 의해 생길 것으로 생각된다. 그리고 중이 진주종의 cytoskeleton이 어느 순간에 변화되어 진주종의 특성을 가지게 되며 이는 시간이 경과함에 따라 변화하지 않으므로 중이진주종의 치료에 수술적 방법이 필수적일 것으로 생각된다.
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