교신저자：김형종, 431-070 경기도 안양시 동안구 평촌동 896  한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   중이진주종의 병리기전으로서 상피세포의 이주(migration), 과증식, 분화 및 세포고사(apoptosis) 등이 밀접한 관련이 있으며 많은 인자들이 이 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.¹⁾
   진주종에서 케라틴 축적은 증가된 각질세포의 사멸과 이에 따른 세포고사에 의하여 이루어지며 Park 등²⁾은 실험적 방법에 의해 유발된 진주종에서 세포고사가 증가함을 관찰하였다. 세포고사에 관여하는 유전자로서 p53, bcl-2 및 fas 등이 알려져 있으며, Shinoda 등³⁾은 진주종 상피에서 p53의 발현을 관찰하고 이것이 세포고사의 조절에 관여할 것이라고 하였고, Kojima 등⁴⁾은 진주종 상피에서 세포고사 억제의 작용을 하는 bcl-2 관련 유전자인 bcl-xL의 발현을 보고하였다.
   본 연구에서는 진주종 동물모델을 이용하여 진주종의 병변 부위와 진주종 병기에 따라 세포고사 관련 인자의 발현정도가 어떻게 변화하는지 관찰함으로써 진주종 병변의 진행에서 세포고사가 관련이 있는지 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

재  료
   이경검사상 정상 고막 및 외이도 소견을 보이는 생후 60~ 90일 된 mongolian gerbil 18마리를 사용하였다. Kim & Chole⁵⁾의 방법에 따라 우측 이개 후방을 절개한 후 외이도를 결찰하여 진주종 발생을 유발하였고 좌측 귀는 대조군으로서 관찰하였다. 진주종이 유발된 측두골을 반대쪽과 함께 en bloc 적출하여 탈수한 후 파라핀에 포매하였다. 제작된 조직표본에서 우측은 외이도의 케라틴 축적 및 고막의 중이강내로의 전이정도에 따라서 진주종 병기를 분류하였고, 좌측은 정상 대조군으로서 관찰하였다. 진주종의 병기는 네 단계로 분류하였다.⁵⁾ 병기 Ⅰ은 상피 과형성이 발생하며 고막 외측에 케라틴 축적이 일어나기 시작하는 상태이다. 병기 Ⅱ는 고막 외측의 케라틴 축적이 증가함으로써 케라틴 plug이 외이도를 완전히 막게 되고 고막이 중이강쪽으로 밀고 있으나 중이강의 내측 벽과는 접하지 않는 상태이다. 병기 Ⅲ는 진주종이 부피가 증가함으로써 중이강 내측벽인 와우갑각과 접한 상태이다. 그리고 병기 Ⅳ는 진주종이 외이와 중이를 가득 채운 상태이다(Fig. 1). 본 연구에서 제작된 실험적 진주종을 분류한 결과 각각 1기 5례, 2기 5례, 3기 5례 및 4기 3례였다.

방  법

면역조직화학적 염색
   Paraffin 조직 절편을 xylene으로 5분씩 3회 탈파라핀한 후 100%, 95%, 90% 및 70% 에탄올에 각각 3분씩 연속 처리하여 함수화 과정을 진행하였다. 조직내 내인성 과산화 효소의 활성을 억제하기 위하여 0.3% 과산화수소수에 15분 동안 반응시킨 후, 항 bcl-2 일차 항체(Santa Cruz, CA, USA)를 1：100으로 희석하여 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 이차항체를 15분 동안 반응시킨 뒤 streptavidin peroxidase와 15분 동안 반응시켰다. 발색반응을 위하여 chromogen(AEC, 3-Amino-9-ethyl-carbazole)을 20분 동안 반응시킨 뒤 hematoxylin으로 대조 염색하였다. 전 과정에서 각 반응 사이 마다 Tris-buffer로 세척하였다. p53항체(Santa Cruz, CA, USA)와 bax항체(Santa Cruz, CA, USA)도 동일한 방법으로 염색을 시행하였다.

세포고사 인자 발현정도의 관찰
   광학현미경(Olympus BX-50, Japan)으로 관찰하여 세포고사 인자의 발현정도를 면역조직화학염색 정도로서 측정하였다. 우선 실험군의 분류를 위해서 진주종의 진행 정도에 따라서 구분한 병기별로 나누었고 각 조직 슬라이드에서 정상 쪽과 진주종이 유발된 쪽의 외이도와 고막을 각각 다섯 부위로 나누었다(Fig. 2). 외측 외이도 상부와 하부, 내측 외이도의 상부와 하부, 그리고 고막 부위로 나누어 400배 시야에서 상피세포의 핵에 과립상의 갈색으로 염색되는 세포를 양성으로 간주하였다. Micrometers내의 세포 중에서 bcl-2 및 p53 양성 반응을 보이는 세포 수를 각각 측정하여 전체세포 수와의 비율로써 표시지수를 산출하였으며 400배 시야에서 무작위로 5곳을 선정하여 측정하였고 그 평균값을 최종 표시지수로서 계산하였다. bax는 상피세포층의 세포질 내에서 갈색 반응이 보일 때 양성으로 판독하였고, 관찰자 1인의 주관적 기준에 의하여 염색반응이 강할 경우를 3, 염색반응이 아주 약한 경우를 1, 중간정도의 염색반응을 보이는 경우에 2로 판정하여 표시 등급을 산출하였다.
   각각의 표시 지수와 표시 등급을 산출한 후 정상과 진주종 상피에서의 차이, 정상과 진주종 상피에서 각 부위별 차이 및 진주종의 병기별에 따른 차이를 ANOVA test와 SAS program의 mixed model과 generalized estimating equations을 사용하여 통계학적으로 비교 검정하였으며 유의수준은 95%로 하였다.

결     과

Bcl-2
   Bcl-2의 발현은 정상 상피와 진주종 상피 모두 전 층에 걸쳐서 세포핵 부위에 갈색의 염색반응이 관찰되었고 특히 기저세포층에서 강하게 관찰되었다(Fig. 3-1).

부위별 비교
   정상과 진주종 상피에서 bcl-2의 발현 정도를 진주종의 병기별로 각 부위간에 비교한 결과 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았지만(p>0.05), 전체 진주종군으로서 비교하였을 때 외측 외이도에서 표시지수가 0.51±0.04, 고막은 0.34±0.05를 나타내어 외이도에서 높았다(p<0.05)(Table 1, Fig. 4-1).

병기별 비교
   정상과 진주종 전체로서 비교한 결과 각각 0.38±0.06 및 0.44±0.04로 진주종에서 높은 값을 보였으나 통계적으로 유의하지는 않았다(p>0.05). 다만, 진주종의 병기간에 비교한 결과 병기 Ⅰ에서 정상보다 유의하게 높은 것으로 관찰되었다(p<0.05)(Table 2, Fig. 5-1).

p53
   p53의 발현은 정상외이도 상피와 진주종 상피 모두 기저세포층에서 과립층에 걸쳐 세포핵 부위에 갈색의 염색반응이 관찰되었고, 특히 기저세포층에서 강하게 염색되었다(Fig. 3-2).

부위별 비교
   진주종의 병기별로 각 부위간에 비교한 결과 병기 Ⅰ, Ⅱ와 Ⅲ에서 외측 외이도의 표시지수가 고막보다 높게 관찰되었고(p<0.05), 진주종군 전체를 비교하였을 때에도 표시지수가 외측 외이도 0.51±0.04, 내측 외이도 0.39±0.04 및 고막 0.24±0.02로 측정되어 외측 외이도가 가장 높았다(p<0.05)(Table 1, Fig. 4-2).

병기별 비교
   정상과 진주종군 전체로서 비교한 결과 진주종 상피에서 높은 표시지수를 보였으나 통계적으로 유의하지는 않았다(p<0.05). 진주종의 병기 간에 비교한 결과 병기 Ⅲ에서 정상보다 유의하게 높은 것이 관찰되었다(p<0.05)(Table 2, Fig. 5-1).

Bax
   Bax의 발현은 bcl-2와 p53와는 달리 정상과 진주종 상피의 세포질에서 관찰되었고 주로 과립층에서 강한 염색반응을 관찰할 수 있었다(Fig. 3-3).

부위별 비교
   정상과 진주종 상피에서 진주종의 병기별로 각 부위간에 비교한 결과 모두에서 통계적으로 유의한 차이를 관찰할 수 없었다(Table 1, Fig. 4-3).

병기별 비교
   정상과 진주종군 전체를 비교하였을 때 표시지수는 각각 2.1±0.4와 2.3±0.6으로서 진주종군에서 통계적으로 유의하게 높았다(p<0.05). 정상과 진주종의 병기별로 비교한 결과 병기 Ⅰ에서 정상보다 유의하게 높은 것이 관찰되었다(p<0.05)(Table 2, Fig. 5-2).

고     찰

   정상 각질세포의 성장 및 사멸 기전에 의하면 기저세포가 증식하고 기저 상부세포로 분화하면서 이동하여 결국 각질층에 도달하게 되면 각질형성 후 세포고사에 빠지게 된다.⁶⁾ 정상 각질 상피세포는 증식과 분화가 균형을 유지하고 있으나 진주종에서는 이 균형이 깨짐에 의해서 증식과 분화가 가속화되어서 과각화를 보이게 된다. 진주종의 대표적 특성은 케라틴의 축적이며, 이의 기전으로서 각질세포 사멸현상의 증가가 예상되나, 종양세포와는 달리 무제한의 증식은 되지 않고 일정한 선에서 증식이 중단된다고 생각되고 있다. 세포의 대표적 사멸기전인 세포고사 현상을 진주종 상피에서 확인하고 이와 관계된 유전인자를 검출함으로써 진주종 상피세포의 사멸기전을 규명하려는 시도들이 있어 왔다.³⁾⁴⁾
   진주종에서 케라틴의 축적이 이루어지려면 각질세포의 사멸이 증가되어야 하고 이에 따른 세포고사의 현상에도 변화가 있을 것으로 예측할 수 있다. Kojima 등⁷⁾은 진주종 상피에서 in situ labeling방법으로 세포고사의 발현을 관찰하였고 Park 등²⁾은 진주종 상피에서 TUNEL 방법으로 세포고사가 현저히 증가됨을 확인하였다.
   본 연구에서는 실험적으로 유도한 중이진주종에서 면역조직화학법을 이용하여 세포고사에 관계된 단백의 발현을 진주종 상피의 부위별, 진주종의 진행 정도에 따른 병기별로 나누어서 관찰하였다.
   세포고사에 관여하는 유전자로는 p53, bcl-2, bax 및 fas 등이 알려져 있다. 종양억제 유전자인 p53은 각질세포의 증식, 분화, 세포고사, 세포주기 조절, 각질세포의 악성변이에서 중요한 역할을 하며 세포가 스트레스 상황이나 DNA에 대한 손상이 생기면 변이형 p53단백이 나타나게 되고 이것은 여러 종류의 종양세포에서 발견된다. 그러나 진주종에서의 p53의 증가는 종양과는 달라서 유전적인 불안정성이나 전형적인 p53 발현의 증가를 보이지 않는다.¹⁾ Shinoda 등³⁾은 진주종 상피의 과립층에서 발현된 p53이 세포고사 조절에 관여하고 있다고 주장하였다. 본 연구에서는 기저세포층에서 과립층에 걸쳐서 p53의 염색반응을 관찰할 수 있었다. 병기간의 비교시 병기가 높아질수록 세포고사 정도도 심해서 이와 관련된 p53의 발현도 병변의 진행에 비례하여 나타날 것으로 예측하였으나 진주종 병기 Ⅲ에서만 p53의 발현이 정상 상피보다 높게 나타났다. 이러한 p53의 증가는 진주종 병변을 나타내는 특징이라기 보다는 진주종 병변의 진행의 일부과정에서 세포고사에 관련된 p53이 증가하는 시기가 있음을 암시한다고 해석할 수 있다. 진주종 상피내에서 p53 발현의 부위별 차이를 살펴본 결과 외측 외이도에서 고막 상피보다 높게 나타났다. 외이도를 결찰하여 진주종이 유도되는 과정에서 부위별 세포고사의 차이가 존재함으로써 p53 발현의 차이가 발생한 것이며 인체에서 후천성 진주종이 상피의 이동이나 함입에 의하여 발생하는 과정에서도 진주종 병변의 부위별로 세포고사의 차이가 존재할 것으로 추론할 수 있다.
   Bcl-2 유전자는 18번째 염색체에 위치하는 원종양 유전자(proto-oncogene)이다. bcl-2 유전자가 위치한 염색체 18번의 일부가 14번 염색체 일부와 전위되어 면역 글로불린 중쇄유전자가 존재하는 부분과 근접해지면 비정상적으로 많은 bcl-2 단백을 생성하고 세포고사를 억제함으로서 세포의 수명을 연장하는 것으로 알려져 있다.⁸⁾⁹⁾ Bcl-2 단백은 혈액종양 이외에도 여러 종류의 종양에서 발현이 보고되어 왔으나 bcl-2가 종양세포의 세포고사와 연관된 기전에 대해서는 학자들마다 이견이 있다. bcl-2의 기능은 bcl-2 family인 다른 단백에 의해 조정되어지는데 즉, bax, bad는 bcl-2의 활동을 억제시켜 세포고사를 촉진시키고 bcl-xl은 bcl-2의 활동을 증가시켜 세포고사를 억제한다고 알려져 있다. Sheu 등¹⁰⁾은 비인두를 대상으로 한 연구에서 정상, 이형증, 암순으로 bcl-2의 발현율이 높았고 이는 bcl-2의 세포고사를 억제하는 작용이 발암과정 중 발생초기에 중요한 역할을 한다는 것을 의미하는 소견이라고 하였다. Kojima 등⁴⁾은 사람의 진주종 상피의 기저층에서 bcl-2와 85%의 상동성을 갖고 세포고사 현상을 억제하는 기능을 가진 bcl-xL 단백질의 발현을 관찰하였으나 정상 외이도 상피와의 차이는 없었다고 보고하였다. 본 연구에서 bcl-2의 발현은 진주종의 병기별로 비교시 병기 I에서 정상보다 높게 나타나서 진주종 발생 초기에 bcl-2에 의한 세포고사의 억제가 일어난다고 추측할 수 있다. 한편 bcl-2의 발현의 차이를 진주종 부위별로도 관찰할 수 있었다. p53 유전인자의 부위별 발현도에서 관찰한 것과 같이 외이도를 결찰한 후에 발생하는 실험적 진주종에서 외이도의 부위에 따라 세포고사의 정도에 차이가 존재한다고 생각된다.
   Bax 단백은 bcl-2와 이종결합체(heterodimer)를 형성할 수 있는데 bax/bcl-2의 비가 클수록 세포고사를 촉진하는 역할을 한다.¹¹⁾¹²⁾ Apolinario 등¹³⁾은 폐암환자의 연구에서 bax 단백 단독으로는 생존율에 미치는 연관성을 발견하지 못했으나 bax+/bcl2-군에서 bax+/bcl2+군에 비해 통계학적으로 의미 있게 예후가 나빴다고 보고하였다. 본 연구에서 진주종에서 bax의 표시지수가 정상보다 의미 있게 증가된 것을 관찰할 수 있었고 병기별 발현을 살펴 보았을 때 bcl-2와 함께 병기 Ⅰ에서 정상 상피보다 높게 관찰되었다. 결과들로 미루어 볼 때 진주종 발생 초기에 bcl-2와 bax 단백이 함께 세포고사에 영향을 미치는 것으로 추측을 할 수 있지만 좀 더 명확한 기전의 이해를 위해서는 분자유전학적 규명이 필요할 것이다.
   이번 연구에서 bcl-2와 p53의 발현에서 부위별 차이를 관찰할 수 있었으나 인체에서는 다양한 부위에서 진주종의 발생과 진행이 있기 때문에 이와 관련된 연구가 필요할 것이다. 또한 사람에서 증상을 나타내는 진주종이 발견되었을 때에는 이미 진행되어 있는 상태이기 때문에 진주종의 발생이나 진행과정을 연구함에는 어려움이 많다. 그러나 동물모델을 통한 진주종의 연구는 병변의 정도에 따른 인자분석과 정량적 분석이 어느 정도 가능하므로 장점이 많다. 현재 동물모델에서의 진주종 유발 방법에는 외이도 결찰을 통한 진주종 유도 방법, 이관폐쇄법, propylene glycol 등의 화학물질의 중이강내 주입을 통한 방법 등이 있다.⁵⁾ 본 연구에 사용한 외이도 결찰법은 상피 과증식과 케라틴 축적 등의 조직학적 소견이 현저하게 관찰되어 세포고사의 연구에 가장 적합할 것으로 생각된다.⁵⁾¹⁴⁾
   저자들은 외이도 결찰을 이용하여 발생시킨 진주종에서 진주종의 진행 정도에 따라서 이에 비례하는 병기별 유전인자 발현의 차이를 알아보고자 하였으며, p53은 진행된 진주종의 특정시기에 세포고사에 영향을 주며 bcl-2와 bax는 서로 연관되어 진주종의 초기 병변에서 세포고사에 영향을 주는 것으로 생각된다. 진주종의 병기가 높을수록 과분화 및 과증식 성향으로 세포고사의 발현도 높아져 이에 따른 유전인자의 변화가 심할 것으로 예상하였으나 흥미롭게도 진주종 병기의 진행에 비례적이기보다는 일정시기에 특징적으로 나타난다는 것을 알 수 있었다.
   본 연구에서 관찰할 수 있었던 진주종에서 세포고사의 부위별 및 병기별 정도 차이의 상관관계는 진주종의 침습도와도 연관시켜 생각할 수 있다. 이를 위해서는 인체에서 진주종의 침범정도, 이소골 연쇄의 파괴, 골미란 등의 임상적 양상과 관련된 유전인자의 발현에 대한 분석이 추가로 이루어져야 할 것이다. 본 연구에서는 진주종의 병변진행에 따른 세포고사에 관한 구체적 변화를 관찰하였는바 진주종 병인 연구의 기초자료로서 도움이 될 것으로 사료된다.

결     론

   본 연구의 결과로서 진주종의 발생과정 중 병변 부위별로 세포고사 발현정도의 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 또한, p53, bax와 bcl-2 등의 세포고사 인자들이 진주종 발생 중 특정 시기 즉, 병의 진행정도에 따라 다르게 발현되는 점으로 미루어 진주종 발생 중 각자 서로 다른 역할을 할 것이라는 암시를 하였다.

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