| Histochemical Localization of NADPH-diaphorase in Olfactory System of Rat. |
| Heung Man Lee, Choong Sik Choi, Sang Hag Lee |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. |
| 흰쥐 후각계에서 NADPH-diaphorase의 조직화학적 분포 |
| 이흥만 · 최충식 · 이상학 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
|
|
|
|
|
| ABSTRACT |
|
Nitric oxide(NO) has recently been identified as a short-lived intracellular messenger in the central and peripheral nervous systems. Nitric oxide synthase(NOS) is a key enzyme for NO biosynthesis by formation of citrulline from L-arginine. This enzyme reaction requires reduced nicotine adenine dinucleotide phosphate(NADPH) as a co-factor and the electron transferring c-terminal sequence of NOS give rise to its NADPH-diaphorase activity. However, it has yet to prove that NO is a sensory neurotransmitter in olfactory nervous system. The purpose of this study was to localize histochemically the distribution of NADPH-diaphorase in the olfactory system of rats. In the olfactory mucosa, NADPH-diaphorase positive cells were demonstrated in the ciliary layers, Bowmann's glands and olfactory nerve bundles. In main olfactory bulb, a large number of NADPH-diaphorase positive cells were also demonstrated in nerve fibers of olfactory nerve layer, periglomerular cell, superficial short axon cells of external plexiform layer and deep short axon cells between granular and subependymal layers. Furthermore there were NADPH-diaphorase positive cells of plexiform and granular cell layers of the accessory olfactory bulb. Therefore, it is suggested that the presence of NADPH-diaphorase acitivity in nerve fibers of olfactory system may be involved in odor processing. |
| Keywords:
Nitricㆍoxide synthaseㆍNADPH-diaphoraseㆍOlfactory nervous systemㆍHistochemistry |
서론
산화질소는 자유기(free radical)로 6∼8초의 매우 짧은 반감기를 가지는 반응성이 강한 화학물질로 L-arginine로 부터 citrulline을 형성할 때 생성된다.13) 이러한 산화질소는 포유류의 신경계, 심혈관계 및 면역계에서 세포내 신경 전달물질로 알려져 있고, 산화질소 합성효소(nitric oxide synthase)는 산화질소의 합성에 관계되는 중요한 효소로서 그 생성기전은 아직까지 명확히 알려져 있지 않으나 NADPH(nicotine adenine dinucleotide phosphate), tetrahydrobiopterin, Ca2+, calmodulin 등의 여러 보조인자를 필요로 한다.1)10)13)17) 중추신경계에서 산화질소 합성효소는 흥분성 아미노산 수용체에 작용하는 다른 신경전달물질과 함께 후시냅스 신경원을 자극하여 수용성 guanylate cyclase을 활성화시켜 cGMP를 증가시키며10)13)17), 말초신경계의 전시냅스 말단에서 유리되어 후시냅스 반응세포의 cGMP를 증가시킨다.3) 말초신경계에서 산화질소 합성효소는 뇌실질, 뇌하수체 문맥계, 눈의 포도막, 혀, 음경, 폐 및 기관 등의 후근신경절(dorsal root ganglia)의 감각신경원과 혈관주위 신경섬유에 존재한다.1)7)12)13) 최근 산화질소가 후각계의 수용체 신경원에서 감각신경정보의 전달에 관여하는 것으로 보고되어 있으나5)12) 흰쥐의 후각신경계에서 NADPH-diaphorase의 분포에 관하여는 잘 알려져 있지 않다.
본 연구는 흰쥐의 후각신경계에서 NADPH-diaphorase의 조직화학적 염색방법을 이용하여 산화질소 합성효소의 소재를 간접적으로 관찰하고자 하였다.
실험재료 및 방법
1. 실험재료
실험군으로 건강한, 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐(체중 200∼300g) 10마리를 사용하였고 대조군으로는 같은 종의 흰쥐 5마리를 사용하였다.
2. 실험방법
실험동물을 6∼8mg/kg의 Urethane(Aldrich, USA)으로 복강마취하에 4% paraformaldehyde(Sigma, USA)로 심장경유의 전신관류로 고정시킨 후 두개골을 절개하여 후구 및 비중격 점막을 채취하였다. 채취된 조직을 4% paraformaldehyde(Sigma, USA) 용액에 2시간 재고정 시킨 후 30% 자당에 하루밤 담근 후 OCT compound(Miles, USA)에 포매한 후 cryostat(Leica CM 1800, Germany)를 이용하여 15μm 두께로 동결절편을 만들었다. 만들어진 동결절편을 β-NADPH(Sigma, USA) 10mg, nitroblue tetrazolium(Sigma, USA) 100μg과 0.3% Triton-X100(Sigma, USA) 100μl를 PBS 10ml에 혼합한 반응 용액에 30분에서 1시간 동안 37℃로 보온시켰다. 반응을 억제시키기 위하여 조직절편을 PBS와 증류수에 세척하였고 하루밤 공기에 건조시켜 봉입한 후 광학현미경하에서 관찰하였다.
실험군은 NADPH-diaphorase의 조직화학적 염색법으로 염색을 시행하였으며 대조군은 NADPH-diaphorase 염색 시약 대신 인산완충용액(pH 7.4, 0.1M, 이하 PBS로 약함)을 이용하여 실험을 시행하였다.
결과
1. 주후구(main olfactory bulb)
후신경층과 사구체에서 양성반응이 관찰되었고 사구체주위세포(periglomerular cell)에 양성반응이 관찰되었으며 수상돌기가 사구체로 뻗어 있는 것이 관찰되었다(Fig. 1A). 외총상층(external plexiform cell layer)의 표재성 단축삭 세포(superficial short axon cell)(Fig. 1B) 및 과립세포층(granular cell layer)과 상의하층(subependymal layer) 사이에 존재하는 심재성 단축삭 세포(deep short axon cell)에서 양성반응이 관찰되었다(Fig. 1C).
2. 부후구(accessory olfactory bulb)
총상층과 과립세포층에서 양성반응이 관찰되었고, 양성반응 축삭 세포가 관찰되었다(Fig. 2).
3. 후각점막
후각상피의 상층에서 양성반응이 관찰되는 반면 호흡상피의 상층에서는 양성반응을 관찰할 수 없었으나 상피하층에 존재하는 점막하선에 모두 양성반응이 관찰되었고(Fig. 3A), 후각점막의 고유점막층에는 후각신경속과 혈관주위의 신경속(perivascular nerve bundle)에서 양성반응이 관찰되었다(Fig. 3B).
4. 대조군
양성반응이 관찰되지 않았다.
고안
산화질소는 매우 불안정하고 간단한 구조때문에 생체내에서 흔히 볼 수 있는 구조특이성이 없는 것으로 생각되어 80년대 초반까지는 주목을 받지 못하였다. 그러나 여러 분야에서 활발하게 연구가 진행되어 산화질소 합성의 생물학적인 중요성이 부각되었다. 대식세포의 항염증 작용에 대한 산화질소 분비 및 혈관 확장작용과 중추 및 말초 신경계에서 신경전달물질로서의 역할이 알려져 있다.2-4)6)7)10)
산화질소의 생성기전은 L-arginine, 산소 및 NAD-PH가 기질로 이용되어 산화질소 합성효소에 의하여 citrulline과 함께 산화질소가 생성된다. 이때 중간생성물로 NADPH 의존성 반응에 의해 N-OH-arginine이 형성되며, 이 중간생성물의 수산화되어 있는 질소가 산화질소로 되는 과정도 역시 NADPH 의존성 반응이다.13) 산화질소는 반감기가 짧은 기체이므로 그 존재를 형태학적으로 밝히기가 어려워 산화질소 합성효소와 동일한 물질로 생각되었으나 지금은 산화질소 합성효소의 조효소의 하나로 밝혀진 NADPH-diaphorase를 조직화학적 방법으로 조직내에서 국재화함으로써 산화질소가 관여하는 신경지배의 존재를 간접적으로 밝힐 수 있다.
척추 동물의 후각신경계는 다양한 종류의 냄새분자에 의해 자극받아 후신경세포에서 이차 매개체에 의한 전기화학적 전달과정을 유발시켜 신경전달에 관여한다. 다량의 냄새분자에 의해 자극을 받으면 후각신경세포는 섬모에 있는 이차 매개체인 c-adenosine 3’,5’-monophosphate(cAMP)와 4,5-triphosphate(IP 3)의 농도가 순간적으로 올라가 섬모막에 있는 cAMP 혹은 IP 3-gated 양이온 통로를 활성화시켜 세포내로 Ca 2+ 유입이 일어나 산화질소합성효소를 활성화시켜 L-arginine으로부터 산화질소의 생성을 증가시킨다.4) 또한 산화질소는 cGMP 합성효소인 guanylyl cyclase의 활성을 증가시켜 GTP로부터 cGMP의 합성을 증가시키며(NO/cGMP system) 증가된 cGMP는 신경조직과 심혈관계에서 여러가지 생리적인 작용을 한다. 냄새분자에 의해 증가된 cGMP 반응은 산화질소의 합성에 선택적으로 억제하는 L-N G-nitroarginine이나 산화질소와 결합하여 합성을 방해하는 헤모글로빈에 의해 억제하며 증가된 Ca 2+ 자체가 guanylyl cyclase의 활동을 억제하며, cGMP의 생성을 억제한다. 따라서 산화질소는 짧은 반감기 때문에 활동이 국한된 조직 환경에서만 제한되게 된다. 산화질소는 주변에 있는 다른 섬모로 확산되어 들어가 다시 주변 섬모막에 있는 NO/cGMP system을 가동시켜 주변 세포에서 cGMP을 증가시키고 이러한 반응은 산화 질소의 짧은 반감기와 guanylyl cyclase을 억제시키는 Ca 2+의 유입에 의하여 감소된다.4)
주후구는 5가지 신경세포로 구성되는데 승모세포(mitral cell), 소방세포(tufted cell), 사구체주위세포(periglomerular cell), 과립세포(granule cell), 단축삭 세포(short axon cell)로 나누어진다.8) 승모세포 및 소방세포는 후구의 주된 신경원으로 후각자극의 전달에 중요하며 사구체주위세포, 과립세포와 단축삭 세포는 이러한 후각의 전달과정에서 국소반응의 조절 작용을 하는 중간신경원(interneuron)으로 알려져 있다.8)14)15)16)17) 따라서 NADPH-diaphorase의 양성반응이 이러한 중간신경원에 국소적으로 존재하여 산화질소 합성효소가 후각반응의 국소적인 전달 및 조절에 관여할 것으로 생각된다. 본 연구에서는 NADPH-diaphorase 활성도가 주후구의 후각 신경 섬유와 사구체 주위세포 및 표재성 단축삭 세포와 심재성 단축삭 세포에서 강한 반응을 보여 Croul-Ottmann 등5), Scott 등17)의 결과와 일치하였다. 이 외에도 사구체주위세포 및 단축삭 세포에는 methionine enkephalin, GABA/glutamic acid decarboxylase, cholecystokinin, tyrosine hydroxylase, neuropeptide Y, somatostatin과 vasoactive intestinal peptide등의 여러가지 신경활성 물질이 존재하나11)12)17) 그 양은 충분하지 못하여 이러한 물질들은 상호 보조작용이 필요하며 NADPH-diaphorase의 활성도 또한 기본적인 양이 발견됨으로써 NADPH-diaphorase가 신경전달 및 조절작용에 역할을 할 것으로 생각된다.
후구에 존재하는 표재성 단축삭 세포는 사구체주위세포 뿐만 아니라 소방세포 혹은 원심성 신경섬유로부터 기인하는 신경종말로부터 신경 정보를 받는다. 사구체주위 세포와 다른 표재성 단축삭 세포에 대하여 억제작용을 하고, 상의하층과 과립세포로 신경을 전달한다. 심재성 단축삭 세포는 과립세포에서 탈억제 작용을 하고 NPY와 VIP 면역양성반응 세포는 과립세포에 대하여 영향을 미친다.17)
부후구는 서골코 기관(vomeronasal organ)에서 화학지각 신경원을 받는다. 본 연구에서는 NADPH-diaphorase의 양성반응이 부후구의 총상층과 과립세포층의 축삭세포에서 관찰되어 서골코 기관의 후각 신경섬유로부터 기원하는 후각전달 수용에 산화질소가 관여할 것으로 생각된다.
후각점막은 후각상피와 고유층으로 나뉘며 후각상피는 양극성 후각수용 신경원, 지지세포, 기저세포 및 보우만씨 선의 관이 존재하며 고유층에는 후각신경속, 보우만씨 선, 혈관과 자율신경섬유가 분포한다. 후각상피는 호흡점막 상피층에 비해 두껍고 보우만씨 선의 관으로 인해 구별된다.8) 본 연구에서는 후각상피의 상층에서 NADPH-diaphorase의 양성 반응이 관찰되는 반면 호흡점막상에서는 관찰되지 않았다. 그러나 후각점막과 호흡점막의 점막하선에서 모두 양성 반응을 보여 Hanazawa 등9)의 결과와 일치하였다. 또한 후각신경속과 혈관주위의 신경속에서도 양성반응이 관찰되었다. 앞으로 면역조직화학적 방법과 동소보합결합반응(in situ hybridization)을 이용한 산화질소 합성효소의 활성도를 보다 정확하게 국재화하여 산화질소가 후각전달 및 조절과정에 관여하는 기전에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
결론
흰쥐 후구에서 NADPH-diaphorase 양성반응 신경섬유는 주후구의 사구체주위세포, 과립세포와 단축삭 세포를 포함한 억제성 중간신경원, 부후구의 총상층, 과립세포층과 후점막에서 관찰되었다. 따라서 흰쥐의 후각계에서 NADPH-diaphorase 양성반응 신경섬유는 후세포와 후구의 출력 신경세포 사이에 후각 입력(input)을 조절하는데 관여할 것으로 생각된다.
REFERENCES
1) Bredt DS, Hwang PM, Snyder SH：Localization of nitric oxide synthase indicating a neural role for nitric oxide. Nature 347：768-770, 1990
2) Bredt DS, Glatt CE, Hwang PM, et al：Nitric oxide synthase protein and mRNA are discretely localized in neuronal populations of the mammalian CNS together with NADPH-diaphorase. Neuron 7：615-624, 1991
3) Bredt DS, Snyder SH：Nitric oxide, a novel neuronal messenger. Neuron 8：3-11, 1992
4) Breer H, Shepherd GM：Implication of the NO/cGMP system for olfaction. Trends Neurosci 16：5-9, 1993
5) Croul-Ottman CE, Brunjes PC：NADPH diaphorase staining within the developing olfactory bulb. Brain Res 460：323-328, 1988
6) Dawson TM, Bredt DS, Fotuhi M, et al：Nitric oxide synthase and neuronal NADPH-diaphorase are identical in brain and peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci USA 88：7797-7801, 1991
7) Fischer A, Mundel P, Mayer B, et al：Nitric oxide synthase in guinea pig lower airway innervation. Neurosci Lett 149：157-160, 1993
8) Greer CA：Structural organization of the olfactory system. In Smell and Taste in Health and Disease(ed. Getchell TV), New York, Raven Press, pp65-81, 1991
9) Hanazawa T, Motosugi H, Konno A, et al：Distribution of NADPH-diaphorase positive nerve fibers in the rat nasal mucosa. Neurosci Lett 159：71-74, 1993
10) Ignarro LJ：Endothelium-derived nitric oxide：actions and properties. J FASEB 3：31-36, 1989
11) Kream RM, Davis BJ, Kawano T, et al：Substance P and catecholaminergic expression in neurons of hamster main olfactory bulb. J Comp Neurol 222：140-154, 1984
12) Lischka FW, Schild D：Effect of nitric oxide upon olfactory receptor neurons in Xenopus laevis. Neuro Report 4：582-584, 1993
13) Lowenstein CJ, Snyder SH：Nitric oxide, a novel biologic messenger. Cell 70：705-707, 1992
14) Orona E, Scott JW, Rainer EC：Different granule cell populations innervate superficial and deep regions of the external plexiform layer in rat olfactory bulb. J Comp Neurol 217：227-237, 1983
15) Orona E, Rainer EC, Scott JW：Dendritic and axonal organization of mitral and tufted cells in the rat olfactory bulb. J Comp Neurol 226：346-356, 1984
16) Price JL, Powell TPS：The mitral and short axon cells of the olfactory bulb. J Cell Sci 7：631-651, 1970
17) Scott JW, McDonald JK, Pemberton JL：Short axon cells of the rat olfactory bulb display NADPH-diaphorase activity, neuropeptide Y-like immunoreactivity, and somatostatin-like immunoreactivity. J Comp Neurol 260：378-391, 1987
|
|
PDF Links
Full text via DOI 
Download Citation 
