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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(3): 360-365. |
| Immunohistochemical Localization of Insulin-Like Growth Factor-I in the Eustachian Tube of the Rat. |
| Yong Joo Yoon, Byung Am Park, Young Ki Kim |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, School of Medicine, Chonbuk National University, Chonju, Korea. |
| 흰쥐 이관에서 IGF-I의 국소화에 대한 면역조직화학적 연구 |
| 윤용주 · 박병암 · 김영기 |
| 전북대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| ABSTRACT |
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Insulin-like growth factor-I(IGF-I) is a peptide hormone of approximately 7.5 kilodaltons which has been shown to be involved in cellular growth and differentiation. Because the IGF-I is synthesized in a variety of tissues, it is thought to act both locally in a paracrine/autocrine manner, as well as a true endocrine hormone after entering the circulation.
It may be considered that IGF-I is very important for differentiation of bone, cartilage, and muscle. The eustachian tube has the function of ventilation, clearance, and protection of the middle ear, contributing to the maintenance of normal hearing. After the opening of eustachian tube, it may return to its original position by elasticity resulting from the recoil of elastic fiber, muscle itself, and other deformed soft tissues surrounding the tube. Previously we have studied the distribution of elastic fibers in the rat eustachian tube and ascertained enormous elastin in the cartilage of the eustachian tube.
The maintenance of elasticity in the tubal cartilage, related to closing of the eustachian tube, has been suspected as one of important factors in the pathogenesis of otitis media. Rich13) previously described that IGF-I acts as a modulator of the elastogenesis, essential for stretch and recoil actions. However, the examination of the presence of IGF-I in the eustachian tube, especially cartilage may very important as one of factors for well functioning of the eustachian tube. This immunohistochemical study, the tubal cartilage has a considerable content of IGF-I in the capsule around the chondrocytes. The submucosal connective tissue layer of the eustachian tube contained some immunostained cells, considered to be fibroblasts. These findings suggest that IGF-I may be important for normal chondrocyte growth of rat eustachian tube. |
| Keywords:
IGF-IㆍEustachian tube cartilage |
서론
성장호르몬은 191개의 아미노산으로 구성되어 있고 분자량이 2만2천 달튼(22kDa) 정도되는 폴리펩타이드로서 뇌하수체 전엽에서 분비되어 혈관을 타고 간으로 가서 인슐린양 성장인자-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ；IGF-Ⅰ)합성을 자극한다. IGF-Ⅰ은 70개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드로서 분자량 7천5백달튼이며 구조와 생체내 작용이 인슐린과 비슷하여 인슐린양 성장인자로 불려지고 있다.7) IGF-Ⅰ은 세포막에 존재하는 IGF-Ⅰ 수용체(receptor)에 결합하여 G단백질을 활성화시키고 이와 관련되어 있는 세포내 매개물질을 자극함으로써 세포내 칼슘농도를 변화시켜 세포의 분열과 분화에 관여하게된다.1) 한편 IGF-Ⅰ은 호르몬 양상으로의 작용이외에 국소적으로 방계분비(paracrine) 및 자가분비(autocrine) 경로를 통하여 작용을 나타내고 있으며 특히 뼈, 근육 및 연골의 증식을 유도하는 등 성장인자의 역할을 담당하고 있다.6)8)16)
이관의 연골부는 중이강에 대한 환기, 배액 그리고 비인강으로부터 침범되는 병원균에 대한 방어기능 등 매우 중요한 기능을 하고 있어 중이염의 병인연구의 표적이 되고 있다. 이관은 연하 등의 생리적 작용으로 열린 후 곧바로 원위치로 돌아가므로서 상기와 같은 기능들이 유지되며 이때 발생되는 이관의 외판과 내판사이의 연골 탄력도와 유순도(compliance)의 이상은 중이병인에 중요한 요소로서 작용될 수 있다.9)11)17)
최근 중이염에 관한 많은 연구들이 그 병인을 밝히기 위하여 노력을 기울여 이관의 기능 부전이 중이염을 일으키는 주요한 원인으로서 받아들이게 되었다.3)10)15) 그러나 대부분의 연구는 이관의 기능적, 임상적 및 병리적 관점에서 시행되어 왔고 이관벽의 연골에 관한 연구는 적은 실정이다. 따라서 저자들은 이관 주위에서 탄성 연골의 탄성반도(elastic recoil) 유지역할에 주목하여 태생 후 연골세포의 성장에 중요한 성장호르몬으로 알려진 IGF-Ⅰ의 존재를 면역조직학적으로 연구하게 되었다.
재료 및 방법
1. 실험동물 및 조직처리
본 실험에 사용한 동물은 체중 250∼300g 내외의 건강한 Sprague-Dawley계 흰쥐로 20마리를 암수 구별없이 사용하였다. Sodium pentobarbital(Mebumal )을 체중 kg당 30mg 복강내 주사하여 마취시킨 후 수술 현미경하에서 외이 및 고막을 관찰하여 중이의 이상을 확인한 후 건강한 흰쥐을 선택하여 흉곽을 절개하고 심장을 노출시킨뒤 좌심실을 통하여 상행 대동맥으로 150ml의 0.1M phosphate buffered saline(PBS)을 주입시킨 후 4% paraformaldehyde 고정액 500ml를 차례로 관류시켰다. 그리고 두부를 절단 후 이관의 고골구와 인두구를 노출시켜 인두구를 통하여 주사기로 고정액을 주입하여 중이강 내로 관류한 다음 중이 일부를 포함한 이관을 채취하여 수시간동안 상기고정액에서 추가로 고정을 하였다.
2. 조직표본 제작 및 면역조직화학법
중이 일부를 포함한 이관부를 수술현미경하에서 미세조작 후 0.1M PBS에 2회 세척한후 0.1M EDTA(ethylene diamine tetracetic acid, pH 7.6)를 매일 갈아 주면서 약 3주동안 반복시행하여 탈회시킨 후 그 정도를 미세침으로 확인한 뒤 0.1M PBS에 3회 세척한 후 xylene과 alcohol로 탈수처리 후 paraffin에 포매된 조직을 5μm 두께로 절편을 만들어 일주일 이내에 면역조직 화학법에 사용하였다.
3. 면역조직화학법(Avidin-biotin complex method)
Poly L-lysine으로 도포된 슬라이드에 부착된 절편을 xylene과 alcohol로 처리하여 파라핀을 제거한 후 내인성 과산화효소에 의한 반응을 막기 위해 1% H2O2에 반응시켰으며, 비특이적인 단백반응을 없애기 위해서 정상 염소혈청과 반응시켰다. IGF-Ⅰ 분포는 avidin-biotin immunoperoxidase(ABC)법을 사용 하였는데 간기하면 다음과 같다. IGF-Ⅰ에 대한 특이 면역조직 화학반응을 시행하기 위하여 먼저 1차 항체인 rabbit antirat synthetic IGF-Ⅰ antiserum(Peninsula Laboratories Europe Ltd, Merseyside, England)을 PBS에 1：200으로 희석시켜 각 절편당 100 ul씩 떨어뜨려 주위로 번지지않는 것을 확인한뒤 4℃에서 48시간 동안 반응시켰다. 그리고 PBS에 30분씩 3번 세척한 후 2차 항체로서 biotinylated goat anti-rabbit immunoglobulin(Dakopatts AB, Hagersten, Sweden)을 1：500으로 PBS에 희석시켜 4℃에서 24시간 적용시켰다. 다시 PBS로 30분간 3번 세척한 후 avidin biotin complex(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)을 1 ：200으로 희석하여 사용하였다.
조직절편은 기질액에 0.03% diaminobenzidine tetrahydrochloride(Sigma Co, St Louis, MO, USA)을 용해시켜 흡지에 여과시킨 후 H2O2를 0.01%가 되도록 첨가한 용액에 5분간 반응시킨 후 gelatin을 입힌 슬라이드에 얹어 실온에서 건조시킨 다음 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다. 대조군은 일부 절편에서 1차 항체대신 정상 염소혈청으로 반응시킨 후 실험군과 동일하게 진행하였다.
결과
광학현미경으로 이관의 IGF-Ⅰ의 조직학적 분포 및 그 특성을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
흰쥐 이관의 연골에서 광범위하게 IGF-Ⅰ이 분포하고 있으며(Fig. 1) 특히 이관 연골의 내측벽에서 보다 저명하게 나타나고 있었다(Fig. 1, 2). 이관 연골부의 IGF-Ⅰ의 염색상은 연골세포 주위를 돌아 피막(capsule)에서 아주 강하게 양성반응을 보이고 있는 반면 연골 세포핵과 핵주위 세포질에는 거의 염색반응을 보이지 않았다(Fig. 3). 이관 점막 상피의 IGF-Ⅰ염색 반응은 전체적으로 연골의 양성반응에 비하여 미약하게 위중층 섬모상피와 기저세포 그리고 기저막에서 IGF-Ⅰ에 대한 양성반응이 관찰되었으며(Fig. 4) 위중층 섬모상피의 섬모에서 비교적 IGF-Ⅰ에 대한 강한 염색소견이 관찰 되었다. 섬모가 보이지 않는 분비세포들 특히 배세포에서는 전혀 반응을 보이지 않았다. 점막하 결합조직층에선 IGF-Ⅰ에 대한 염색반응이 상피세포와 비슷하게 소수의 결합 조직세포들에서 IGF-Ⅰ의 면역염색상을 관찰할 수 있었다(Fig. 5). 한편 이관 내외측에 분포하여 있는 선조직에서는 장액세포 그리고 점액세포 공히 면역염색을 보이고 있었다(Fig. 6).
고찰
IGF-Ⅰ은 7.5 kDa의 분자량을 가진 펩타이드 호르몬으로서 세포성장, 분화 및 대사에 관여한다.6)8)10) IGF군(IGFs)에는 IGF-Ⅰ과 IGF-Ⅱ가 있으며 혈중에서 높은 농도로 존재 하는데 대개 간에서 생성되어 유리된 것으로 혈장내에선 특수한 결합단백질(IGF-Binding Protein, IGFBP)과 결합되어 있다. IGF-Ⅰ과 IGF-Ⅱ는 구조적으로 proinsulin과 유사하여 A, B 및 C-domain 을 포함하고 있고 이외에도 D-domain을 갖고 있다. IGFs와 proinsulin의 유사성은14) 구조적이외에 기능면에서도 유관되는데 IGF-Ⅰ이 인슐린과 유사하기 때문에 인슐린에 대한 표적이 되는 조직들에서 인슐린의 효과를 발휘하게 된다.18)
완전한 IGF계는 배위자들, 수용체들 및 IGF 수용체들과 동일한 아미노산 배열을 공유하지 않는 결합단백들로 구성된다. IGF-Ⅰ은 비교적 확실하고 안정성이 있는 펩타이드로 알려져 있는데 그 이유는 IGF-Ⅰ이 혈장내에서는 결합단백과 결합되어 있기 때문이다. 결합단백은 지금까지 혈액과 그외 체액에서 6종류가 존재하고 있음이 증명되었고 이중 IGF-Ⅰ은 혈장에서 IGFBP-3에 대부분(95% 이상)이 결합되어 있다.2)
IGF-Ⅰ이 그 효과를 수행하기 위해선 IGF 수용체와 결합하여야 하는데 주로 type-1 수용체와 결합하여 중재된다. 사람의 IGF-Ⅰ 수용체는 disulfide-linked heterotetrameric glycoproteins을 포함하고 있어 인슐린의 수용체와 매우 흡사하며 인슐린과 IGF-Ⅰ 수용체들은 훨씬 성장인자의 수용체에 가깝다.
말초조직에서 성장호르몬의 작용은 IGF-Ⅰ에 의해 중 재되며 성장호르몬은 다양한 조직에서 IGF-Ⅰ의 생성을 조절하는 것으로 알려져 있다. IGF-Ⅰ은 여러부위의 다양한 조직들에서 생성되어 순환기로 들어간후 호르몬으로서의 역할을 할 뿐만 아니라 방계분비와 자가분비의 작용을 갖고있는 것으로 알려져 있다.4)5) 성장에 관여하는 많은 호르몬들이 연골대사와 골격계 성장에 관여하고 있고 연골세포들은 세포외 조성들을 생성하고 붕괴시켜 기계적으로 기능하고 있는 세포간 기질을 정상적으로 유지 시킨다. 따라서 이관연골에서 IGF-Ⅰ의 높은 발현은 그 생리적 역활에대한 가능성을 예견하게 하는데 이는 이미 IGF-Ⅰ 수용체들이 배양한 연골세포에서 증명되었고 흰쥐에서 IGF-Ⅰ의 주입이 연골의 성장을 자극하며 병변상태에서 IGF-Ⅰ의 투여가 연골의 크기와 양을 증가시키며 연골에서 IGF-Ⅰ과 IGFBP의 생성이 증명되었기 때문에 이관연골에서도 IGF-Ⅰ의 분포 및 생성의 가능성을 더욱 강하게 뒷받침해 주었다. IGF-Ⅰ은 연골대사에서 국소 조절작용을 하는 성장유발인자로서 뿐만 아니라 다양한 기관들에서 성장을 위한 필수 호르몬으로 규명되고 있다. 따라서 성장호르몬의 영향아래 국소적으로 생성된 IGF-Ⅰ이 연골세포의 분화에 결정적인 역활을 하며 이관연골도 IGF-Ⅰ의해 조정될 수 있을 것으로 시사된다. 흰쥐 이관 연골세포에서 IGF-Ⅰ의 강한 면역반응의 소견은 IGF-Ⅰ이 분화를 일으키는 인자로서 연골세포의 분화와 성장에 깊이 관여할 것으로 여겨진다. IGF-Ⅰ은 성장유발효과 이외에도 대사계에서 동화작용 그리고 항지질 용해작용을 갖고 있다. 흥미로운 것은 IGF-Ⅰ이 수용체에 결합 후 각질세포증식에 관여하는 점으로서 각질세포들이 IGF-Ⅰ을 생성하여 외피증식을 자극하는 능력을12) 갖게 될 수 있어 중이 진주종의 형성에 깊이 관련될 수 있다.
이관은 중이강에 대한 환기, 배액 그리고 비인강으로부터 침범되는 병원균에 대한 방어기능 등 매우 중요한 기능을 하고 있으며, 연하 등의 생리적 작용으로 이관이 열린 후 곧 원위치로 돌아가 닫히게 되어 상기 기능들이 유지하게 된다. 이관은 구개범장근(tensor veli palatini muscle)이 수축 함으로서 이관 측벽이 당겨져 열리게 되고 곧바로 본래의 위치로 돌아가 닫히게 되며, 이때 이관의 개폐와 동시에 발생되는 이관의 외판과 내판사이의 연골 탄력도와 유순도의 이상은 중이병인에 중요한 요소들로 작용할 수 있다. 이관기능은 중이의 압력을 대기압과 평형을 유지시켜 최선의 청력을 가지도록 하는데 기여하고 있다. 따라서 이관의 기능부전은 중이강의 환기와 배액에 장애를 일으키고 비인강으로 부터 방어기능이 상실되어 중이염과 진주종을 일으키며 그로 인해 정상 청력 유지에 손상을 입게 된다.
삼출성 중이염 원인은 비인강과 이관을 포함한 중이의 해부 생화학적 특징과 개체의 생체방어능력 등이 복합적으로 작용하여 발생하는 것으로 생각되고 그 중에서도 이관이 매우 중요한 역할을 하고있다. 그동안의 중이염의 원인에 대한 연구들이 단순한 기계적 원인(Hydrops exvacuo설15))으로 부터 탈피하여 이관의 기능 부전을 중이염이 발생하는 주요한 병인으로서 받아들이게 되었다. 저자들은 기능 부전을 유소아시의 미발육 그리고 성장기의 각종질환과 함께 일어나는 이관의 방어기능의 손상 등에 많은 관심을 두게 되었다.
이관연골의 성장에 관한 균형이 어떤 원인에 의해 깨어질때 이관의 신속한 폐쇄에 장애가 오고 구개범장근의 수축에의해 이관이 열린 후 따라야 할 이관의 reconciling 즉, 폐쇄부전으로 이관의 중요한 기능의 하나인 비인강으로 부터 중이를 차단하는 방어벽 기능을 상실하게 되어 중이염이 속발할 수 있다.
저자들은 이관의 기능부전을 조직 병리학적 관점에서 연구을 시행 하여왔다. 즉 이관 주위에서 탄성 연골의 탄성반도(elastic recoil) 유지역활에 주목하여 hinge부의 강한 탄력섬유 분포를 보고 한바 있으며 이관연골의 탄력섬유의 손상이 이관의 기능 부전을 야기할 수 있다는 것을 조직형태학적으로 증명한바 있다. 이와같이 이관이 열리고 닫히는데 작용하는 탄력성에 주역할을 하는 연골에서 그 성장에 영향을 주는 성장호르몬의 연구는 중이염의 병인을 밝히는데 매우 중요하다고 간주되며 최근 각종실험 그리고 실제 임상적으로 이용하고있는 IGF-Ⅰ의 이관부에서 국소화에 대한 연구는 소아 중이염의 병인을 규명하며 또한 그 치료에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
요약 및 결론
이관의 기능 중 중이 방어벽 기전에 매우 중요한 역할의 중요성은 매우 높아가고 있다. 이관 특히 이관연골의 존재 의의는 더한층 증대되고 있다. 저자들은 이관기능 부전에 이관연골이 미칠수 있는 영향들을 주시하여 그 성장에 중요성이 기대되는 IGF-Ⅰ의 존재를 알기 위하여 ABC법으로 면역반응을 국소화시켜 이관의 상피세포, 점막하 결합조직 그리고 이관연골에서 분포를 관찰하였다. 흰쥐 이관에서 IGF-Ⅰ은 이관 연골의 전지역에서 상당한 양을 포함하고 있었으며 연골세포의 피막에 광범위하게 분포하여 환상의 띠를 두르고 있었다. IGF-Ⅰ 분포망은 내외측 연골들이 만나는 hinge부 가까이 내측벽에서 가장 저명 하였다.
이관연골에서 풍부한 IGF-Ⅰ의 존재에 대한 증명은 이관발육 및 생리적기능을 이해하는데 중요하리라 생각되며 이관의 정상기능에 필수적인 이관연골의 태생 후 발육에 IGF-Ⅰ이 결정적인 역활을 하고 있으며 중이염에 대한 조직학적 이해를 도모할 수 있을것으로 유추된다.
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