| The Effect of Phenylephrine Hydrochloride on Ciliary Beat Frequency in Nasal Respiratory Epithelium. |
| Chong Nahm Kim, Myoung Sil Ju, Yang Gi Min, Kang Soo Lee |
1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Ewha Womans University, Seoul, Korea.
2Department of Otolaryngology, College of Medicine, Seoul National University, Seoul, Korea. |
| Phenylephrine Hydrochloride가 비강호흡상피세포의 섬모운동에 미치는 영향 |
| 김종남1 · 주명실1 · 민양기2 · 이강수2 |
| 이화여자대학교 의과대학 이비인후과학교실1;서울대학교 의과대학 이비인후과학교실2; |
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| ABSTRACT |
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The mucociliary system has primary defence mechanism in the respiratory tract. The effects of various drugs used clinically in the treatment of disease of the nasal cavity have not been fully elucidated. The aim of this study was to investigate the effects of alpha1 receptor agonist, phenylephrine hydrochloride on ciliary beat frequency in vitro using a video computerized analysis technique. The ciliated epithelial cells from the nasal mucosa in four volunteers were collected in a culture medium and exposed to 0.125%, 0.25%, 0.5%, 1.0%, and 2.5% phenylephrine hydrochloride solution according to 0.5 hour, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, 12 hours, 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, and 6 days. There was a significant decrease in ciliary beat frequency with exposure to 0.125% phenylephrine hydrochloride solution for 12 hours, and 0.25% phenylephrine hydrochloride solution for 8 hours(p<0.05).
There were cilioinhibitory effects with concentration dependent response by phenylephrine hydrochloride solution.
After substitution of the culture medium with phenylephrine hydrochloride free one showed no ciliary recovery in all groups. The results of this study suggest that phenylephrine hydrochloride may have phamacologically a cilioinhibitory effect in vitro on ciliated epithelium. |
| Keywords:
Phenylephrine hydrochlorideㆍCiliary beat frequencyㆍNasal respiratory epithelium |
서론
혈관수축제는 비폐색의 치료목적으로 이비인후과에서 널리 사용되고 있는 약물중의 하나이다. 그중 phenylephrine hydrochloride는 주로 α1 교감신경계 수용체에 작용하는 효현제로 비강점막의 수축 효과를 나타낸다.2) 감기 등의 급성 질환에서는 비폐색이 짧은 기간내에 소실되나 만성 질환에서의 비폐색은 지속되는 불편함으로 혈관수축제의 사용이 불가피한 경우가 많다.
그러나 이러한 혈관수축제는 부작용으로 약물성 비염(rhinitis medicamentosa)과 반동현상을 일으킬 수 있다. 약물성 비염은 장기적으로 혈관수축제를 사용한 경우 발생하는 질환으로 만성 비폐색이 주 증상이며, 반동현상이란 혈관수축제를 장기간 사용하다 중지하면 비폐색이 더욱 악화되는 현상이다.3) 혈관 수축제는 국소 혈류량이나 조직반응, 비강내 호흡기류, 그리고 가장 중요한 비점막 호흡상피의 섬모운동에 영향을 줄 수 있는데 아직 그 정확한 기전은 규명되지 않았다.
비강점막의 섬모기능은 호흡기도로 들어오는 이물질에 대한 생체방어의 필수적인 기능으로 만약 이런 기능에 이상이 초래되면 이물질이나 세균 등이 점막으로 쉽게 침입하여 여러가지 상기도의 질환을 일으키게 된다. 따라서 섬모기능의 측정은 임상에서 중요한 의미를 지닌다.
혈관수축제의 독성에 관한 연구는 임상에서 사용되는 적정농도 이상의 고농도를 사용하는 임상실험은 심한 부작용때문에 시행할 수 없어 동물 실험이나 생체외에서의 연구만이 행해지고 있다. 임상에서 사용되는 약물에 의한 섬모운동 횟수의 변화의 분석은 그 분석 결과가 객관적이고 정량화된 방법이라야 약물의 임상용량을 제시할 수 있고 이의 측정을 통한 병태병리가 규명될 수 있으나 보고가 없는 실정이다.
이에 저자들은 비강점막 호흡상피 섬모세포를 채취하여 여러가지 농도의 혈관수축제를 투여한후 섬모운동을 관찰하고, 이를 비디오 영상으로 녹화하여 컴퓨터 영상처리 프로그램으로 분석하는 실험을 시행하여 섬모운동을 정량적으로 측정하여 적정 약물농도와 노출시간에 대한 임상적인 자료를 제시하고자 본 연구를 시행하였다. 또한 앞으로 이런 방법을 통한 섬모운동의 정량적 분석은 여러 가지 임상 약물의 독성연구 분석에 유용하게 사용될 수 있으리라 사료된다.
재료 및 방법
1. 연구재료
연구재료로 정상 이학적 소견을 보이며 병력상 상기도 염증이나 천식, 알레르기성 질환 및 호흡기 질환이 없고, 과거력상 비강 및 부비동 수술을 받은 적이 없는 비흡연가로 성에 따른 차이를 배재하기 위하여 성인 남자 4명의 비강내 호흡상피세포를 채취하였다.
점막수축제 phenylephrine hydrochloride의 농도는 실제 임상 사용농도인 0.25%의 용액을 기준으로 하여 0.5배(0.125%), 2배(0.5%), 4배(1.0%)와 10배(2.5%)의 용액을 만들었다.
세포배양액은 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；Life technologies, NY, USA)과 F12(Ham’s nutrient F12；Life technologies, NY, USA)의 1：1 혼합배양액(D-MEM/F12)을 사용하였다.
세포배양을 위해 35 mm 배양용기를 사용하였는데 용기의 바닥이 두껍기 때문에 1000배 시야에서 섬모운동을 관찰하기 위해 용기바닥을 얇게하고 덮개 유리를 붙였다.
2. 연구방법
1) 호흡상피세포 채취
마취를 하지 않고 직경 2mm인 상피세포 채취용솔(BC-15 AE, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 하비갑개의 전단으로부터 5mm 뒤에서 하비갑개의 외측을 따라 호흡상피세포를 채취하였다. 조직 배양액이 들어 있는 시험관에 상피세포 채취용솔을 넣고 흔들어 세포가 떨어지게 한 후 시험관을 37℃, 5% CO2 배양기에 보관하여 계속되는 실험에 사용하였다. 실험농도를 동일하게 맞춘 조직배양액을 2일 간격으로 바꾸어 주었다.
2) 농도별 조직 고정
채취한 호흡상피세포 덩어리를 micropipette으로 채취하여 각각의 농도의 phenylephrine hydrochloride가 희석된 배양액이 들어 있는 35mm 크기의 배양용기에 넣은 후 현미경 관찰시 용이하도록 백금선을 사용하여 관찰중인 세포를 고정하였다.
3) 온도유지방법
일정한 온도를 유지하기 위하여 배양용기에 맞는 열판(heating chamber)과 온도 조절장치를 이용하여 관찰하는 동안 배양용기내의 온도를 37℃로 유지하였다.
4) 섬모운동 측정
희석된 각각의 표본을 phenylephrine hydrochloride 희석전, 희석후 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일 간격으로 도립 현미경 1000배에서 관찰하였다. 같은 표본에서 약물 투여 없이 섬모운동을 측정하여 대조군으로 하였다.
Charged coupled device(CCD) camera(Digitstar, Xomed, Jackson Ville, Florida, USA)를 이용하여 섬모가 뚜렷이 보이는 상태를 수상기에서 관찰하며 녹화하였는데 세포자체도 움직이지 않고 주위 세포의 섬모운동에 의한 간섭이 적은 섬모를 택하여 세포당 15초 동안 녹화하였다. 각 표본당 가장 활발히 움직이는 세포를 선택하여 10개의 화면을 녹화하였다.
5) 섬모운동 횟수의 분석
녹화된 섬모운동을 컴퓨터 메모리에 2초 내지 4초의 영상을 불러들여 퓨리어 분석(fast Fourier transform analysis)방법을 통하여 분석하였다. 불러들인 영상을 네개의 영역(block)으로 나누어서 분석하였는데 1000배하에서 한세포의 섬모는 한개 내지 두개의 영역에서 관찰하였다. 메모리내에 저장된 영상을 느리게 보면서 컴퓨터로 섬모운동 횟수를 분석하였고 측정하고자 하는 섬모가 위치한 두개의 영역에서 분석한 수치가 일치하는지를 보아 분석치를 확인하였다.
통계학적인 유의성을 검증하기 위해 대조군과 실험군의 연구결과를 repeated measures AVOVA를 이용하여 p-value를 구하고 5% 유의수준에서 통계학적으로 검증하였다.
결과
1. 저농도군의 phenylephrine hydrochloride에서의 섬모운동
0.125%의 phenylephrine hydrochloride농도에서는 30분후에는 섬모운동이 증가하다가 그후 서서히 감소 하여 12시간후부터 유의하게 섬모운동이 감소하였으며(p<0.05), 실험 6일째까지 미약한 섬모운동이 지속되었다.
0.25% 실험군에서도 30분후까지는 섬모운동이 증가하다가 그후부터 감소하기 시작하여 8시간 이후부터는 유의한 감소를 보였고(p< 0.05), 실험 4일째부터는 섬모운동이 관찰되지 않았다.
0.5% 실험군에서는 2시간까지 섬모운동이 증가하다가 4시간 이후부터 유의하게 섬모운동이 감소하였다(p<0.05)(Table 1). 섬모운동은 실험 2일째까지 관찰되었다.
Fig. 1은 대조군과 저농도인 0.125%, 0.25% 및 0.5 % phenylephrine hydrochloride 실험군에서의 약물투여후 시간 경과에 따른 섬모운동 횟수의 변화를 도식화한 것이다.
2. 고농도군의 phenylephrine hydrochloride에서의 섬모운동
1.0%의 phenylephrine hydrochloride 실험군의 경우는 약물투여 1시간까지는 섬모운동의 증가를 보이다가 그후부터 섬모운동이 감소하였고 1시간 이후부터 유의한 섬모운동의 감소를 보였다(p< 0.05).
섬모운동은 실험 4일째까지 관찰되었다.
2.5%의 용액에 노출된 경우는 30분이후부터 유의하게 점막 섬모운동이 감소하였다(p<0.05)(Table 1).
2.5%농도에서는 모든 표본에서 약물투여 직후부터 섬모운동이 감소하였으며 8시간 이후로는 섬모운동이 관찰되지 않았다(Fig. 2).
일단 phenylephrine hydrochloride 용액에의해 섬모운동이 정지된 후에는 용액이 들어있지 않은 배양액으로 교환하여 2일 동안 관찰하였으나 섬모기능은 회복되지 않았다.
고찰
임상에서 사용되고 있는 자율신경계 약물은 주로 심장과 호흡기 질환에 사용되어지고 있으나 비강점막 섬모운동에 미치는 영향은 아직 잘 알려져 있지 않다. 임상적으로 일부 교감 흥분성 약물이 점막 섬모운동을 감소시킬 수 있고 따라서 이들 약물의 남용은 상기도 질환의 병인이 될 수 있다.15) 따라서 점막 섬모운동에 대한 이러한 약물의 효과를 알아 보는 것은 매우 중요하다.
교감 흥분성 약물은 수용체에 따라 두가지 계열로 분류될 수 있는데 아민에 대한 반응을 기준으로 α와 β로 구분하였고1) 이를 다시 α1과 α2, β1과 β2로 구분할 수 있다.12)13) 그중 phenylephrine은 주로 α1 교감신경계 수용체에 작용하는 효현제로 비점막 수축제로 널리 사용되고 있는 약물이다. Wikberg21)는 phenylephrine이 주로 α1 수용체에 작용해 섬모운동을 감소시키며 이는 농도증가에 비례한다고 하였다. Tsuchiya 및 Kensler20)는 가토의 기관지에서 α1 수용체 효현제가 점막섬모 수송속도를 감소시킨다고 하였고 Simon 등19)은 정상 성인의 비강내에서 같은 결과를 얻었다.
섬모운동은 점액의 양과 점액의 점도, 섬모자체의 활성도 그리고 전신적인 혈류량 조절에 따른 점액생성 정도에 의존한다. 따라서 정확한 섬모자체에 미치는 영향을 알아보기 위해서는 상피세포만을 분리하여 섬모운동을 측정하는 것이 적절하다 하겠다.
α1수용체 효현제는 전신 투여시 혈관에 미치는 영향은 비점막내의 용량혈관(capacitance vessel)과 저항 혈관(resistance vessel)에 존재하는 α1 수용체에 작용하여 혈류량을 조절하여 비점막 수축을 가져온다. 또한 국소적으로 주어질 때에도 α1 수용체 효현제는 혈류량의 감소를 초래하여 미세혈관에 손상을 줄 수 있다.5) 섬모상피는 모세혈관과 비강사이에 위치하고 상피세포와 점막 섬모운동의 에너지원은 혈류량과 주위공기에 의존하는 것으로 알려졌다.7) 만일 비강이 염증반응으로 두껍고 비투과적인 분비물로 차 있는 경우 상피세포의 에너지원은 모세혈류로부터 오는 확산에만 의존할 것이다. 따라서 교감신경 흥분성 약물에 의한 모세 혈류량의 감소는 정상보다 병적 상태의 비점막에서 더욱 섬모운동을 떨어뜨릴 수 있다. Hybbinette 및 Mercke10)는 섬모운동 장애를 일으키는 농도를 가토를 사용한 실험을 통해 phenylephrine hydrochloride 농도를 0.01μg/Kg에서 20μg/Kg으로 제시한 바 있다. 또 Phillips 등16)은 정상성인에서 여러농도의 phenylephrine hydrochloride을 투여후 computerized microphotometry system을 이용하여 섬모운동 횟수를 측정하였는데 0.01%에서 섬모운동의 증가를 0.25%와 0.5%에서는 섬모운동의 억제를 관찰하였으며 0.05%에서는 유의한 차이가 없어 0.05% 농도가 섬모운동 저해를 일으키는 최저농도가 된다고 보고하였다. 1수용체 효현제는 임상 사용농도 이하에서도 점막 섬모운동에 손상을 초래할 수 있다.8)16) 이와 같은 섬모손상은 부비동염의 발병원인이 될 수 있다는 점에서 임상적으로 중요하다.15)
본 연구에서 임상농도보다 저농도인 0.125%과 임상농도인 0.25%의 phenylephrine에 노출된 경우 상피세포의 섬모운동은 각각 12시간, 8시간전까지는 유의있게 감소하지 않았다(p<0.05). 그러나 그보다 고농도, 그리고 장시간의 phenylephrine에 노출된 경우는 고농도일수록 짧은 시간내에 섬모운동의 장애가 나타났으며 같은 농도에서는 노출시간이 길어질수록 섬모운동의 장애를 초래하였다. 이는 생체에서 실험한 Phillips 등16)의 연구에서 1시간후 0.05%에서 유의있게 섬모운동이 감소한 것과 비교하여 볼때 생체외에서 섬모자체에 pheny-lephrine이 국소적으로 투여시, 저 농도에서도 섬모운동의 장애를 초래 할 수 있음을 시사한다. Sakakura 등18)은 동물실험을 통해서 섬모운동의 장애는 병리조직학적 손상보다 더 늦게 나타난다고 하였다. 그러므로 섬모운동의 장애는 이미 점막상피에 병리조직학적으로 손상이 있다고 추측할 수 있다. 생체내에서의 섬모운동 측정연구로는 Dalhamn6)가 수술현미경을 사용하여 점액파동으로부터 반사되어 나오는 빛을 이용하여 섬모운동 횟수를 구하였고 Hakansson 및 Toremalm9)은 동물에서 섬모운동에 따른 점액 파동횟수를 섬모운동횟수라고 생각하고 이를 측정하였다.
정확한 정량적 측정을 위해서 여러가지 생체외에서의 실험도 시도되었다. Ballenger4)는 섬모운동에 의해 세포가 회전하는 것을 이용하여 섬모운동을 측정하였으나 회전하는 세포가 기록되어야만 섬모운동횟수를 구할 수 있는 단점이 있다.
최근 20년 동안 섬모의 운동을 측정하기 위해서 광전 신호(photoelectric signal)를 이용하는 방법 및 레이저를 사용하는 방법도 시도되었다.14) 그리고 Kennedy 및 Duckett11)는 투과된 빛의 양의 변화에 fast Fourier tansform analysis기법을 도입함으로써 혼재해 있는 여러 주파수 가운데 섬모운동횟수에 해당하는 주파수를 얻는 방법을 사용하였다.
위의 방법들은 동시에 많은 세포를 분석할 수 없고, 단일세포에서의 섬모를 측정할 수 없으며, 섬모의 움직임이 얼마나 큰 지를 알 수 없는 단점을 지니고 있었다. 그러나 이러한 단점은 비디오 녹화기를 이용하여 해결하려는 노력으로 많은 세포를 동시에 녹화하여 재생, 분석할 수 있고 카메라를 통해서 확대를 할 수 있기 때문에 각각의 세포에서 섬모움직임을 자세히 관찰할 수도 있다. Rautiainen 등 17)은 400배와 1,000배하에서 섬모운동을 관찰한 후 고속영상촬영술을 이용하여 섬모운동을 녹화하고 이를 느리게 재생하면서 섬모운동 횟수를 측정하고, 운동의 강도를 알 수 있었다. 그러나 섬모운동을 육안으로 직접 헤아림으로써 움직이는 폭이 적은 섬모운동을 간과할 수 있고 주변의 섬모와 혼동할 수 있으며 관찰자의 편견이 들어갈 수 있는 단점이 있었다. 따라서 이와 같은 점을 보완하면서 보다 적극적이고 정량적인 분석 방법이 필요하다. 본 연구에 사용된 방법은 단일 세포에서의 섬모운동을 관찰, 컴퓨터를 사용하여 섬모운동횟수를 구하는 분석시스템으로 다른 섬모 운동에 영향을 주는 요인을 배제할 수 있는 객관적이면서도 정량적인 정보를 제공할 수 있다는 데에 그 장점이 있다. 사용하는 현미경은 광학적으로 해상력이 높아야 하며 현미경의 배율은 한 개의 섬모세포가 영상에서 차지하는 가로, 세로의 화소 크기와 한 개의 화소가 나타낼 수 있는 공간적 정보량에 의해 결정되는데 즉, 섬모운동이 충분한 광량의 차이를 유도할 수 있을 정도의 배율이 되어야 한다. 광학 현미경은 200, 400, 1000배의 배율을 사용할 수 있으나 분석에 필요한 충분한 광량의 차이를 얻을 수 있는 배율인 1000배의 배율이 적당하며 다양한 실험을 위해서 도립현미경을 이용하였다. 모든 영상정보를 컴퓨터 메모리로 옮긴 후 섬모운동 횟수 및 섬모운동 크기는 정보처리 프로그램에 의해 구하여지는데 수집된 영상을 분석하는 프로그램은 크게 두가지 방법이 있다. 그 하나는 수집되는 각 영상의 화소들의 밝기를 전부 더하여 시간에 따라 각 영상의 전체 밝기량의 변화를 분석하여 섬모운동횟수를 구하는 방법이다. 다른 하나는 기준이 되는 초기 영상 화소의 밝기에 대해 연속해서 나오는 다른 영상 화소의 상대적인 밝기량을 얻어 영상전체값을 구한 뒤 시간에 따른 영상전체의 상대적 밝기량의 변화를 이용하여 섬모운동횟수를 구하는 방법으로 이 방법은 한 개 섬모세포의 운동 특성을 주위의 영향에서 배제하여서 분석할 수 있게 한다.
본 연구는 이러한 방법을 사용하여 약물이 섬모운동에 미치는 영향을 정량적으로 측정하여 약물의 적정 농도와 노출시간에 대한 자료를 제시할 수 있을 것으로 사료된다.
결론
Phenylephrine hydrochloride은 임상 사용농도이하인 0.125%에서도 12시간 이상 사용시 비점막 섬모운동의 저하를 가져오는 것으로 나타났으며 임상 사용농도인 0.25% phenylephrine hydrochloride에서는 8시간 이상 노출시 비점막 섬모운동의 저하를 가져왔다.
임상 사용농도보다 고농도인 0.5%, 1.0% 및 2.5% phenylephrine hydrochloride에서는 각각 2시간, 1시간 및 30분 이상 노출시 비점막 섬모운동의 유의한 저하를 관찰할 수 있어 비강점막 상피세포의 섬모운동의 횟수는 phenylephrine hydrochloride용액의 농도와 노출시간이 증가함에 따라 유의하게 감소함을 알 수 있었다. 또 phenylephrine hydrochloride용액에 의해 섬모운동이 정지된 후에는 용액이 들어있지 않은 배양액으로 교환하여도 섬모기능은 다시 회복되지 않는 것으로 관찰되었다.
결론적으로 α1 수용체의 효현제인 phenylephrine hydrochloride용액은 국소 투여시 임상적으로 쓰이는 농도 이하에서도 그 약리적 작용에 의해 섬모기능을 감소시킬 가능성이 있어 그 임상적 사용에 주의를 기울여야 하겠다.
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