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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(12): 1757-1762. |
| Fibroblast Heterogeneity of Nasal Mucosa in Allergic and Non-Allergic Rhinitis. |
| Sung Wan Kim, Kwang Il Kim, Joong Saeng Cho, Hwoe Young Ahn |
1Department of Otolaryngology, KangNam General Hospital, Public Coorporation, Seoul, Korea.
2Department of Otolaryngology, College of Medicine, Kyung Hee University, Seoul, Korea. |
| 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염에서의 섬유아세포의 이형질 |
| 김성완1 · 김광일1 · 조중생2 · 안회영2 |
| 지방공사 강남병원 이비인후과1;경희대학교 의과대학 이비인후과학교실2; |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Some components of ground substance are involved in developing nasal allergy. The Langerhans' cells and dendritic cells are known as antigen presenting cells which initiate the allergic responses. The fibroblasts are a major component of the ground substance in respiratory epithelium and have many immunologic roles. Heterogeneity of fibroblast has been observed in other anatomical sites. But that was not reported in the nasal mucosa.
OBJECTIVES:
We focused on the fibroblasts and attempted to compare the functions of these cells in allergic rhinitis(AR) and non-allergic rhinitis(NAR). The purpous of this study is to prove the heterogeneity of fibroblasts of nasal mucosa between AR and NAR for further evaluation to reveal the function of fibroblasts of nasal mucosa.
MATERIALS AND METHODS:
We used the fibroblasts from normal skin as a control, and fibroblasts from the nasal mucosa of AR and NAR for experimental study. We investigated the proliferation potential of the fibroblasts by the comparison of cell growth and we compared IL(Interleukin)-6 and TNF(Tumor necrosis factor)-alpha production in this culture system.
RESULTS:
There was a difference of specific growth rate in the three groups(AR, NAR and normal skin). The specific production of IL-6 and TNF-alpha of the three groups showed different responses.
CONCLUSION:
The differences in cell proliferation potential and cytokine production in these culture systems suggest the possibility of heterogeneity in fibroblasts of nasal mucosa between AR and NAR. |
| Keywords:
FibroblastㆍAllergic rhinitisㆍNon-allergic rhinitis |
서론
알레르기성 비염과 비알레르기성 비염에서의 조직상에서 고유층의 비후가 만성화의 특징적인 소견인데 고유층 비후의 대부분이 섬유아세포로 구성되어 있어 이 세포는 여러가지 환경적 요인에 노출되므로 그 발생 및 분화양상, 기능상의 차이가 있을 것으로 생각된다.
섬유아세포는 세포들간의 구조를 유지하고, 여러가지의 cytokine을 분비하며, 여러 종류의 물질에 반응하여 cytokine의 분비가 촉진되며1), 또한 antigen presenting cell로서 알려져 있다.
Interleukin-6(이하 IL-6)와 tumor necrosis factor-α(이하 TNF-α)는 전구 염증 물질 중의 하나로 급성기 단백을 생산하고 hematopoietic growth를 통하여 염증세포를 활성화시키는 물질로 알려져 있다.2)
여러 다른 조직에서의 섬유아세포의 이형질은 이미 여러 문헌에서 보고되고 있다.3-5) 또한 같은 조직에서 여러가지 상태에 따른 섬유아세포의 기능적, 구조적 차이가 보고되고 있다.
6)7)
이에 저자들은 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염에서의 비점막에서 섬유아세포를 세포 배양하여 그 들의 증식속도, 그 들의 cytokine 생산 등을 측정하여 이들의 이형질을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
1. 재료
저자들은 정상 대조군으로 정상 피부의 섬유아세포를 배양하였고, 실험군으로 알레르기성 비염 환자(이하 AR군)와 비알레르기성 비염환자(이하 NAR군)의 비점막의 섬유아세포를 배양하였다. 정상 피부는 포경 수술시 얻은 것을 사용하였고, 비점막은 하비갑개 절제술로 얻어진 것을 사용했다.
2. 방법
1) 섬유아세포의 배양
피부조직과 비점막을 1mm 3 크기로 절단하여 배양용 접시에 1cm 간격으로 놓고 5분간 실온에서 유착시킨후 배양액(Dulbeco’s Modified Eagle’s medium, 이하 D-MEM)을 첨가하여 배양하였다. 단층을 형성하면 DM-EM을 제거한 후 phosphate buffered saline(PBS)로 세척하고, 0.05% trypsin-0.02% ethylene diamine tetraacetic acid(EDTA)로 37℃에서 5분간 처리한 후 조직을 분해하였다. 그 후 분해된 세포를 얻어 20% fetal calf serum이 첨가된 DMEM액을 넣은 플라스크에서 배양하였다. 각 각의 군에서 3차 계대배양된 세포의 광학현미경적 소견(Fig. 1, 2, 3)을 보았는데 난원형의 핵을 가지고 있는 편평한 세포로 전형적인 섬유아세포의 모양을 가지고 있었으며, 광학현미경상 이들의 형태학적 차이를 구별할만한 특이소견은 관찰되지 않았다.
2) 세포수와 증식속도의 측정
각각의 군에서 배양된 세포를 3차 계대배양에서 mm당 1×10 5/mL의 농도로 분주한 후 세포수를 Trypan blue dye 염색을 통해 매일 같은 시간에, 살아있는 세포만을 hemacytometry로 측정하여 세포성장곡선을 그렸다.
증식속도는 산술적으로 배수기(doubling time)와 비생육속도(specific growth rate)를 측정하였는데 배수기는 배양상의 exponential phase에서 세포농도가 Log함수로 2배가 되는데 걸리는 시간이고 비생육속도는 단위 시간당 증가된 세포 수를 기저세포수로 나눈 값을 말한다. 본 실험에서는 단위시간을 24시간(1일)으로 정하였다.
3) IL-6, TNF-α의 측정
3차 계대배양된 세포의 부유액에서 매일 같은 시간에 하루당의 전체 IL-6와 TNF-α의 생산양을 ELISA 방법을 사용하여 측정하였고, 산술적으로 섬유아세포당 IL-6와 TNF-α의 양(specific production)을 계산하였다. 또한 각각의 성장속도와 Cytokine의 생산양을 비교해 보았다.
결과
1. 배수기와 비생육속도의 측정
정상 피부 섬유아세포와 알레르기성 비염, 비알레르기성 비염에서 각각 증식속도의 차이를 보였다. 배수기를 비교해 보면, 정상 피부섬유아세포의 경우, 1.63일인데 반해 비점막에서는 양자 모두 1.00일이었다. 하지만 비생육속도는 정상 피부 섬유아세포의 경우, 0.441/일인데 반해 비알레르기성 비염은 0.693/일, 알레르기성 비염은 0.723/일로 각각의 군이 차이를 보였다. 이것은 알레르기성 비염에서의 섬유아세포가 정상 피부 섬유아세포와 비알레르기성 비염에서의 섬유아세포보다 더 높은 증식력을 가지고 있는 것을 시사하고 있다(Table 1).
2. 세포성장곡선의 차이
세포성장곡선상 대조군에서는 배양 2일째부터 성장이 진행되어 5일째 성장이 둔해지는 양상을 보인 반면, 실험군에서, 특히 AR군에서는 성장이 급격히 증가하였으며, AR군은 배양 5일째부터 성장이 둔해졌으나 NAR군에서는 배양 7일째까지 성장이 멈추지 않는 양상을 보였다(Fig. 4).
3. Cytokine 생산양의 측정
1) 전체 IL-6의 생산의 차이
IL-6의 생산은 각 군에서 유의한 차이가 있었다. 대조군에 비해 실험군은 IL-6의 분비양이 많았으며 AR군에서는 4일째에, NAR군에서는 5일째 보다 급격히 증가하는 차이를 보였다(Fig. 5).
2) 전체 TNF-α의 생산의 차이
TNF-α의 생산은 대조군에서는 6일째 급격히 증가한 후 감소하는 양상을 보였으며, 실험군에서는 두 군 모두 5일째 급격한 증가를 보인 후 서서히 감소하는 추세를 보이나 NAR군이 AR군에 비해 더 많은 생산을 보였다(Fig. 6).
3) 정상 대조군에서의 전체 IL-6, TNF-α의 생산양과 세포성장곡선과의 비교
IL-6의 생산은 세포농도와 비례하여 많아지는 양상을 보였으나 TNF-α는 그렇지 않았다(Fig. 7).
4) AR군에서의 전체 IL-6, TNF-α의 생산양과 세포성장곡선과의 비교
IL-6는 세포성장이 정체되면서 생산양이 증가하는 양상을 보였으나 TNF-α에서는 세포성장과의 연관성을 볼 수 없었다(Fig. 8).
5) NAR군에서의 전체 IL-6, TNF-α의 생산양과 세포성장곡선과의 비교
IL-6의 생산은 세포성장과 비례하여 많아지는 소견을 보였으나 TNF-α의 생산은 세포성장과는 연관성이 없었다(Fig. 9).
6) 섬유아세포당 IL-6의 생산양(specific production)
대조군에서 IL-6는 2일째까지 생산되었으며 이후 서서히 속도가 감소하는 양상을 보인 반면 실험군에서는 1일째 급격히 생산된 후 2일째 급격히 속도가 감소하는 소견을 보였으며, 4일째부터 서서히 증가하는 소견을 보였다(Fig. 10).
7) 섬유아세포 당 TNF-α의 생산양(specific produc-tion)
TNF-α는 대조군에 비해 실험군에서 더 많이 생산되는 양상을 보였으며, 대조군에서는 2일째, NAR군에서는 3일째, 그리고 AR군에서는 4일째 감소하는 소견을 보였다(Fig. 11).
고찰
알레르기성 비염이 만성화되면 비점막에서 여러가지 구조적인 변화를 초래하는데 호흡기 상피의 탈피, 상피하조직의 섬유화, 평활근의 비대, 점막의 부종 등이 이것이다. 저자들은 이중 부신피질 호르몬에도 반응하지 않고 비가역적인 기도의 폐색, 계속되는 기도의 과민반응에 작용하는 것으로 알려진 상피하 조직의 섬유화에 초점을 맞추어 이것이 알레르기성 비염의 만성화 내지 영구화에 어떤 작용을 할것이라는 추측하에 이러한 실험을 고안하였다.
섬유아세포는 난원형의 핵을 가진 편평한 세포로서 세포외 기질성분을 합성하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다.8) 섬유아세포에 영향을 주는 물질들로서는 보체(complement), 여러 종류의 cytokine(Interleukin-1, TNF-α, TGF-β, GM-CSF 등), 성장 인자(platelet derived growth factor, alveolar macrophage derived growth factor 등)와 prostaglandins, Interferon 등이 있다. 저자들은 아무런 자극을 주지않은 상태에서 각각 다른 환경에 노출되었던 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염에서의 비점막에서 배양된 섬유아세포를 재료로 사용하여 각 질환에서의 비점막의 섬유아세포의 이형질을 보고자 하였다.
1960년대 초 피부, 관절 조직, 골막 등의 섬유아세포의 배양에서 서로 다른점들이 보고된 이후로9) 많은 저자들이 서로 다른 해부학적 부위에서의 섬유아세포의 이형질이 있음을 보고하고 있다.3-5) Smith 등은 후안부와 피부의 섬유아세포를 비교하여 T3와 recombinant Interferon-γ에 대한 glycosaminoglycan(GAG)의 축적억제 효과를 비교하여 서로 다른 반응을 입증하였고4)5), Heufelder 등은 후안부와 경골전부의 섬유아세포에서 Interferon-γ로 자극한 경우 배부 섬유아세포보다 HLA-DR의 발현이 현저하다는 것을 증명하였다.3)
또한 같은 해부학적 부위에서의 상태에 따른 섬유아세포의 이형질도 여러 저자들에 의해 보고되고 있다.10-14) Mitsui와 Schneider는 중력 침전(gravity sedimentation)에 의해 사람의 폐 섬유아세포를 두 군으로 분류하였고,13) Korn은 prostaglandin E 2 합성을 근거로 사람의 피부 섬유아세포에서 아종(substrain)이 있음을 증명하였다.11)
이러한 섬유아세포의 기능적인 이형질은 여러가지 물질에 대한 반응도, 성장속도, 세포 표면의 항원 발현(fluoresecence activated cell sorting), 교원질과 염증물질의 생산 등에 의해 여러 부위에서 밝혀져 왔다.2)6)11)15) 그러나 비점막의 이형질에 관한 연구는 저자들이 아는 바로는 보고된 바 없었다. 이에 저자들은 성장 속도와 cytokine의 생산에 근거하여 비점막에서 알레르기성 비염과 비알레르기성 비염에서의 섬유아세포의 기능이 차이가 있음을 보았다. 본 실험은 비점막에서의 섬유아세포의 기능을 밝히기 위한 예비 실험으로 앞으로 여러가지 실험을 통한 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
결론
저자들은 다음과 같은 결론을 얻었다.
1) 비생육속도로 측정된 성장속도는 AR군에서 NAR 군에 비해 빨랐다.
2) 섬유아세포당 IL-6와 TNF-α의 생산양은 대조군보다 실험군에서 더 많이 생산되는 양상을 보였다.
3) 섬유아세포당 TNF-α의 생산은 AR군에서 NAR군에 비해 더 길게 유지되는 양상을 보였다.
이상의 결과로 NAR군과 AR군 사이에 섬유아세포의 이형질을 시사할 수 있었다.
REFERENCES
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2) Botstein GR, Sherer GR, Leroy EC：Fibroblast selection in scleroderma：An alternative model of fibrosis. Arthritis Rheum. 1982；25：189-195
3) Heufelder AE, Smith TJ, Gorman CA, et al：Increased induction of HLA-DR by interferon-γ in cultured fibroblasts derived from patients with Grave’s ophthalmopathy and pretibial dermopathy. J Clin Endocrinol Metab. 1991；73：307-313
4) Smith TJ, Bahn RS, Gorman CA, et al：Stimulation of glycosaminoglycan accumulation by interferon gamma in cultured human retroocular fibroblasts. J Clin Endocrinol Metab. 1991；72：1169-1171
5) Smith TJ, Bahn RS, Gorman CA：Hormonal regulation of hyaluronate synthesis in cultured human fibroblasts：Evidence for differences between retro-ocular and dermal fibroblasts. J Clin Endocrinol Metab. 1989；69：1019-1023
6) Derdak S, Penny D, Keng P, et al：Differential collagen and fibronectin production by Thy1 ＋ and Thy1 - lung fibroblast subpopulations. Am J Phys. 1992；263：L283-L290
7) Elias KA, Rossman MD, Phillips PD：Phenotypic variability among density-fractionated human lung fibroblasts. Am Rev Respir Dis. 1987；135：57-61
8) Fries KM, Blieden T, Looney RJ, et al：Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast subpopulations in fibrosis. Clin Immunol Immunopa-thol. 1994；72：283-292
9) Castor CW, Prince RK, Dorstewitz EL：Characteristics of human “fibroblasts” cultivated in vitro from different anatomical sites. Lab Invest. 1962；11：703-713
10) Brody JS, Kaplan NB：Proliferation of alveolar interstitial cells during postnatal growth：Evidence for two distinct population of pulmonary fibroblasts. Am Rev Respir Dis. 1983；127：763-770
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13) Mitsui Y, Schneider EL：Characterization of fractionated human diploid fibroblast cell subpopulations. Exp Cell Res. 1976；103：23-30
14) Wolosewick JJ, Porter KR：Observations on the morphological heterogeneity of WI-38 cells. Am J Anat. 1976；149：197-225
15) Korn JH, Torres D, Downie E：Clonal heterogeneity in the fibroblast response to mononuclear cell derived mediators. Arthritis Rheum. 1984；27：174-179
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