An Experimental Study on Bisphosphonates Ototoxicity.

Park, Il Seok; Kim, Hyung Jong; Lim, Hyun Joon

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(3); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(3): 307-312.

An Experimental Study on Bisphosphonates Ototoxicity.

Il Seok Park, Hyung Jong Kim, Hyun Joon Lim

Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. hjk1000@www.hallyn.or.kr

Bisphosphonates의 이독성에 관한 연구

박일석 · 김형종 · 임현준

한림대학교 의과대학 이비인후과학교실

주제어: Bisphosphonateㆍ이독성.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Bisphosphonates are known to inhibit bone resorption, and some researchs are also undergoing on their protective effect against localized bone resorprion in aural cholesteatoma. However, ototoxicity has been reported recently after pamidronate, a bisphophonate, is introduced intravenously. Functional and morphologic changes of the inner ear were observed after local application of bisphosphonates onto the round window membrane (RWM).
MATERIALS AND METHODS:
Auditory brainstem response (ABR) changes and histopathologic changes of the inner ear were observed after application of pamidronate, alendronate, risedronate to the RWM of guinea pigs. ABR recordings were taken prior to the bisphosphonate application as well as one hour after the application. These recordings were also taken each day after the application, continuing upto four weeks. Cochleas were dissected at the fourth week, and the organ of Corti was examined under the light microscope and scanning electron microscope.
RESULTS:
After pamidronate was applied onto the RWM, the hearing level was elevated upto 13 dB, and then returned to normal at 4 weeks. After the alendronate application, hearing level was lowered to 48 dB at 2 weeks. After the risedronate application, hearing level was elevated to 33 dB at 3 weeks. The surface preparations and the scanning electron microscopic examination revealed loss of the third row of the outer hair cells. The inner hair cells and the remainder of outer hair cells were intact.
CONCLUSION:
Reversible or irreversible hearing loss was induced and the outer hair cells were partially missing after the local application of biphosphonates onto the RWM.

Keywords: BisphosphonateㆍOtotoxicityㆍAuditory brainstem responseㆍSurface preparationㆍScanning electron microscopy

서론 Bisphosphonate계 화합물은 Fleisch 등1)이 처음으로 그 작용에 대하여 보고한 이래 다양한 종류의 골대사 및 칼슘 대사 장애 질환의 진단 및 치료 목적에서 개발되어 온 물질이다. Bisphosphonates는 pyrophosphate의 화합물에서 산소기가 탄소기로 치환된 것으로 골세포에서 프로스타 글란딘의 생성을 억제한다고 알려져있고,2) 파골세포의 역할과 관계가 있을 것이라고 주장되어져 왔다.3)4) Bisphosphonates의 골흡수 억제작용은 cyclo-oxygenase 억제제와는 달리 골기질의 hydroxyapatite 결정과 직접 결합함으로써 골흡수를 억제하기 때문에 골대사 이외의 전신 부작용이 경미하다. 이러한 까닭에 Paget씨 병과 악성 종양으로 인한 과칼슘혈증의 치료나 골다공증에서 골절을 예방하기 위한 목적에서 실제로 임상에서 전신적 골흡수 억제제로서 사용되고 있다. Bisphosphonates의 하나인 etidronate에 의해서 중이강에 압력을 가하여 골흡수를 유발시킨 동물 모델에서 파골세포의 누가 현상에 의한 골흡수작용이 억제되고,5) 다른 하나인 risedronate에 의하여 마우스의 두개관(calvaria) 배양에서 부갑상선호르몬에 의한 칼슘 분비가 억제된다는 보고가 있다.6) 한편, 골파괴에 의해 중대한 합병증을 초래하 는 중이 진주종에서 골흡수 억제제로서 bisphosphonates의 가능성 여부에 관해 관심이 집중되고 있으나, bisphosphonates를 전신적으로 투여하였을 때 발생할 수 있는 부작용 때문에 실용화되기엔 어려움이 있어 왔다. 전신적 부작용을 최소화하고, 중이의 국소 병변에서 약물의 농도를 높게 유지하기 위하여 국소 지향성 약물 전달 체계를 이용한 시도가 있는 반면 최근 bisphophonates의 다른 하나인 pamidronate를 Paget씨 병 환자에게 정맥 투여한 후에 청력 소실, 어지러움증과 이명이 발생하였다는 보고가 있었다.7) 국소용 약제 개발의 전제 조건으로 이 종류의 약제가 이독성이 없다는 것이 선행되어야 하므로 본 연구는 bisphosphonates의 이독성 여부를 알아보기 위해 기니픽의 정원창막에 다른 세대의 bisphosphonates인 pamidronate, alendronate, risedronate를 각각 점적한 후 청성뇌간유발반응으로 청력 역치의 변화를 시간별로 측정하고 내이 코티씨 기관의 병변을 병리 조직학적으로 관찰하였다. 재료 및 방법 실험 동물은 정상 고막 소견과 이개 반사를 보이는 기니픽(albino guinea pig, 250∼350 gm)을 사용하여 생리 식염수(0.9%)를 점적한 음성 대조군, 10% 베타딘 용액을 점적한 양성 대조군과 pamidronate, alendronate, 및 risedronate를 점적한 군(Table 1)으로 나누어 각각 실험을 하였다. 각 약제를 정원창막에 투여한 후의 청력 변화는 청성뇌간유발반응 역치의 변화로써 측정하였고, 약제 투여 전과 투여 후 1 시간, 1 일, 1, 2, 3, 4주 후에 일정한 체온을 유지시키면서 양측 귀에서 각각 청성뇌간유발반응을 측정하였다(Fig. 1). Bisphosphonates 점적 후 청력역치의 변화 마취는 xylazine HCl 15 mg/kg과 ketamine HCl 40 mg/kg의 혼합 용액을 복강내 주사하여 마취하였다. 수술 현미경하에서 우측 귀의 후상방을 alcohol과 betadine 용액으로 깨끗이 소독하고 말린 후 약 1 cm의 절개를 하여 연조직을 분리하고, 귀의 후상방에서 중이 골포를 2 mm의 전기 드릴로 개방하여 정원창 막을 노출시켰다. 음성 대조군으로서 생리 식염수, 양성 대조군으로서 10% 베타딘 용액, 그리고 여러 세대의 bisphosphonates 로서 pamidronate(3 mg/ml), alendronate(3 mg/ml)와 risedronate(3 mg/ml)를 각각 1×1 mm의 소독된 gelfoam에 충분히 적시어 우측 정원창 막에 놓은 후 피부 절개를 봉합하였다. 이독성 약제에 의한 영향을 배제하기 위하여 항생제는 사용 치 않았다. 청성뇌간유발반응은 Nicolet사의 Compact Fo-ur Electrodiagnosis system을 사용하였는데, 자극음은 insert-phone을 통해 광역 주파수대의 click음을 사용하였고 반대쪽 귀는 차폐하였으며, 반응파의 기록은 2 channel system으로 하여, 양측 earlobe에 기준 전극을, 그리고 전두부 중앙에 활성 전극을 부착하고 두정부에 접지 전극을 위치시켜 전기 저항을 2 kilo-ohm 이하로 유지하였다. 음자극 횟수는 분당 2,000회로 하였고 음의 강도를 5dB 씩 낮춰가며 측정하며 청력 역치 수준에서는 매 2회 반복 검사 하였다. Bisphosphonates 점적 후 시간 경과에 따라 측정한 청력 역치에서 투여 전의 청력 역치를 뺀 값을 실제의 청력 손실로 간주하였다. 베타딘 용액 또는 생리 식염수를 점적한 군과 pamidronate, alendronate, 및 ris-edronate를 점적한 군간의 청력 변화의 양상이 각 집단간에 차이가 있는지 알아보고 각 군에서 처치 후 시간별로 차이가 있는지를 살펴보았다. Bisphosphonates 점적 후 병리조직학적 변화 4주까지의 청성뇌간유발반응을 측정한 후 pentobarbital sodium 복강내 주사 마취하에 개흉하여 좌심실을 통해 대동맥으로 카테터를 삽입하고 phosphated buffer saline 용액과 modified Karnovsky 용액을 관류하여 생체 고정하였다. 절두하여 두경부에서 골포를 포함한 양측 측두골을 각각 분리하여 채취한 뒤 modified Karnovsky 용액에 4℃에서 24시간 동안 고정하였다. 0.2M EDTA 용액으로 탈회하고 0.05M sodium cacodylate buffer로 중화한 후 수술 현미경하에서 와우관만을 분리하여 2% OsO4 용액으로 고정하고 농도별 아세톤으로 연속적 탈수 후에 Epon 용액에 봉매하였다. Epon block을 수술 현미경하에서 조심스럽게 각 와우관의 회전별로 분리하여 유리 슬라이드에 부착시켰다. 표본은 광학현미경하에서 각각의 코티기를 관찰하여 정원창 막에 점적한 물질별로 나누어 유모세포의 병리조직학적 변화를 관찰하였다. 유모세포의 손상정도는 Hul-tcranz 등8)의 방법을 응용하여 유모세포의 손상이 없거나 5% 미만이면(-), 10% 미만은(＋), 10%에서 50% 미만이면(＋＋), 50% 이상이거나 유모의 융합 또는 거대유모의 관찰은(＋＋＋), 유모의 전 회전부에서의 소실은(＋＋＋＋)로 분석하였다. 주사전자현미경 조직표본을 위해서는 심장관류고정없이 즉시 와우부를 채취하고 해부 현미경하에서 박리하여 2% OsO4 용액으로 고정하고 농도별 알코올로 연속적 탈수 후에 critical point drying과 gold coating하여 주사전자현미경(JEOL 820)으로 관찰하였다. 결과 0.9% 생리식염수 및 10% 베타딘 용액을 정원창 막에 점적한 후의 변화 각 물질을 점적한 후 시간 경과에 따라 측정한 청력 역치에서 투여 전의 청력 역치를 뺀 값을 실제의 청력손실로 보정하여 비교하였다(Table 2). 생리 식염수 점적 전 청력 역치는(평균±표준편차) 22.5±3.5 dB HL이었고, 생리 식염수 투여 후 청력 역치의 변화는 거의 관찰되지 않았다. 베타딘 용액 점적 전 청력 역치는 30±5.0 dB HL이었고, 점적 후 1시간에 약 17 dB의 역치상승을 보인 후 점차적으로 진행하여 4주에 약 33 dB의 역치상승을 보였다(Fig.2). 병리조직학적검사상 생리 식염수 점적 후 와우의 유모세포는 안쪽의 내유모세포 1열, 바깥쪽의 외유모세포 3열로 정상소견이었다. 내, 외유모세포의 유모는 와우축에서 멀수록 길이가 긴 3열로 구성되어 있었다. 베타딘 점적 후 와우의 기저 회전부에서 특히 외유모세포의 외층유모(특히 바깥쪽 2열)의 변화가 심하고 첨단부의 변화는 미약하였다(Table 3, Fig. 3). Bisphosphonates를 정원창 막에 점적한 후의 변화(Table 2) Pamidronate 점적 전 청력 역치는 25±5.0 dB HL이고, 점적한 후 1주에 약 8 dB의 역치상승을 보이고 2주에 37 dB의 역치상승을 보인 후 서서히 감소하여 4주에 10 dB로 회복되었다. Alendronate 점적 전 청력 역치는 30±7.0 dB HL이고, 점적한 후 1일에 20 dB의 역치상승을 보이고 2주에 35 dB의 역치상승을 보인 후 4주까지 계속되었다. Risedronate 점적 전 청력 역치는 22.5±3.5 dB HL이고, 점적한 후 1주에 3 dB의 역치상승을 보이고 3주에 13 dB의 역치상승을 보인 후 4주에 8 dB의 역치상승을 보였다. 약제를 점적한 우측의 청력 역치에서 대조군인 좌측의 청력 역치를 뺀 값으로 청력 역치를 다시 보정하였을 때 청력 역 치의 변화는 allendronate가 가장 심하였고, risedronate이 다음이고, pamidronate는 가장 경미하였다(Fig. 4). Surface preparation 소견상 bisphosphonates 점적 후 와우 외유모세포 변성의 심한 정도는 음성 대조군인 생리 식염수와 양성 대조군인 베타딘 점적 후의 변화의 중간 정도로 관찰되었다(Table 3, Fig. 3). 주사전자현미경검사상 alendronate 점적 후 기저 회전부에서 외측외유모세포의 변성이 가장 심하였고, pamidronate와 risedronate 점적 후의 변화는 제 3열에서 약하게 관찰되었다(Fig. 5). 고찰 아직까지 bisphosphonates에 의한 골흡수 억제기전에 관하여 정확하게 알려져 있지 않지만, 골세포에서 프로스타글란딘의 생성을 억제한다는 보고와,2) 파골세포의 역할과 관계가 있다는 보고가 있었다.3)4) Bisphosphonates는 실제 임상에서 골다공증, Paget씨 병, 그리고 악성 종양으로인한 과칼슘혈증 등의 예방 및 치료제로 사용되고 있으나 전신 부작용으로 오심, 구토, 복통, 설사 등의 소화기장애, 골대사작용으로 인한 과포스페이트혈증, 골절, 체온상승, 신손상9), 혈전정맥염,10) 이독성 등7)이 보고되어 전신적 약제로서 실용화되기엔 어려움이 있어 왔다. Bisphosphonates는 오래전부터 여러 세대로 개발되어 왔으며 etidronate는 임상적으로 처음 사용된 bisphosphonate이지만 골흡수 억제작용은 적고 정상적인 광화작용을 억제하는 작용이 크기 때문에 부작용이 크다. 본 연구에 사용된 아미노산 기로 치환시킨 유도체인 pamidronate는 etidronate 보다 100배의 강도를 가진다.11) 4개의 탄소기 를 가지고 있는 alendronate는 pamidronate보다 10배 높은 강도를 나타내며,12) 고리구조에 질소 원자를 가지고 있는 risedronate는 이 보다 더 높은 활성도를 나타낸다.13) 본 연구에서는 bisphosphonates의 이독성 여부를 알아보기 위하여 pamidronate, alendronate, 및 risedronate를 각각 기니픽의 정원창 막에 점적한 후 청성뇌간유발반응의 역치를 측정하여 청력의 변화를 관찰하였고, 병리조직학적 검색을 병행하여 청력의 변화가 감각기 세포의 형태학적 변화에 의한 것인지를 증명하고자 하였다. 국소적으로 투여하였을 때 이독성을 일으키는 것으로 잘 알려진 베타딘 용액을14) 양성 대조군으로 하고, 생리 식염수를 음성 대조군으로 각각 사용하여 비교하였고 음성 대조군인 생리 식염수군에서는 양측에 유의한 차이를 보이지 않음으로써 gelfoam에 의한 전음성손실 성분은 유의하지 않다고 간주할 수 있었다. 각 물질의 점적 전 청력과 점적 후 청력의 차이를 계산하여 실험군에서 이독성에 의한 실제의 청력변화로서 간주하여 비교하였다15). 청력역치의 측정방법으로 청성뇌간유발반응보다 청신경 복합활동전위를 측정하는 방법이 더 정확한 것으로 알려져 있지만16) 본 연구와 같이 시간에 따른 변화를 관찰하기 위해서는 중이강내 전극이 필요한 청신경 활동전위를 측정하는 것은 부적절하며 Anniko 등17)은 청력역치의 시간에 따른 변화를 측정하기 위해서는 청성뇌간유발반응을 권장하고 있다. 본 연구의 결과는 pamidronate를 점적한 군은 13 dB의 일시적 청력손실을 보였고 alendronate를 점적한 군은 4 주까지 38 dB의 청력소실을 보였으며 risedronate를 점적한 군은 4주에 28 dB의 청력소실을 보였다. 병리조직학적 소견상에도 청력의 변화에 비례하는 외유모세포의 부분적 손상을 관찰할 수 있었다. 이상으로써 bisphosphonates는 정도의 차이가 있으나 국소적 투여시 일시적 또는 영구적 청력역치의 변화를 초래하며 와우의 코티씨 기관내에도 형태학적 변화를 초래함을 알 수 있었다. 그러나 이상의 결과를 사람에서 그대로 적용할 수 있을지는 의문이다. 왜냐하면 사람의 정원창 막은 기니픽의 정원창 막보다 훨씬 두껍고, 국소용 이 점적액을 쓰는 중이염환자인 경우 훨씬 더 두꺼워지며 정원창 막 투과성도 감소되게 된다.15) 한편, 본 실험에 사용한 bisphosphonates의 농도는 임상에서 보통 사용되는 것보다 훨씬 고농도를 사용하였기 때문에 본 결과에서 이독성 변화를 나타냈을 수 있다. 따라서 bisphospho-nates를 중이진주종에서 국소형 골흡수 억제제로 사용할 수 있기 위해서는 정원창막의 투과성이 저하되는 중이염 상태에서 이독성 이 초래되는지 여부를 알아보아야 하고, 실제 임상에서 사용되는 국소형 약제의 농도에서 이독성을 보이는지에 관한 연구도 병행되어야 할 것이다. 결론 Bisphosphonates를 중이내 국소적 투여시 이독성 여부를 알아보기 위해 pamidronate, alendronate, risedronate를 각각 정원창막에 점적하였을 때 초래되는 청력 변화와 병리조직학적 변화를 관찰하였다. 청력역치의 변화는 pamidronate를 점적한 군에서는 일시적인 10 dB의 변화 를 보였고, alendronate를 점적한 군에서는 약 40 dB의 변화를 보였으며, riserdronate를 점적한 군은 약 30 dB의 변화를 보였다. 병리조직학적 변화로서 와우의 내유모세포층은 잘 유지가 되었으나 청력의 변화와 비례하는 외유모세포층, 특히 바깥 열의 부분적 손실이 관찰되었다. 이상으로 bisphosphonates를 기니픽의 중이 정원창 막에 국소적으로 점적할 때 물질에 따라 정도의 차이가 있는 이독성을 초래하는 것으로 생각된다. 그러나 인체의 중이염이 있는 정원창막에서는 투과성이 저하되기 때문에 본 실험의 결과를 해석하는데 주의를 필요로 한다. 그러므로 실제와 같은 중이염 상태에서 국소용으로 개발된 물질을 정원창막에 점적한 후의 변화에 관한 연구가 계속 진행되어야 할 것이다.
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