| Expression of Matrix-Metalloproteinase-2, Urokinase-Type Plasminogen Activator and Plasminogen Activator Inhibitor-1 in Invasion Mode and Lymph Node Metastasis of Laryngeal Squamous Cell Carcinoma. |
| Sung Min Jin, Seung Hoon Lee, Gun Choi, Jong Ouck Choi |
1Department of Otolaryngology, College of Medicine, Sungkyunkwan University, Seoul, Korea. KUENT@netsgo.com
2Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. |
| 후두 편평세포암종의 침윤양상과 림프절전이에 따른 Matrix-Metalloproteinase-2, Urokinase-Type Plasminogen Activator와 Plasminogen Activator Inhibitor-1의 발현양상 |
| 진성민1 · 이승훈2 · 최 건2 · 최종욱2 |
| 성균관대학교 의과대학 이비인후과학교실1;고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실2; |
|
|
|
|
|
| 주제어:
후두 편평세포암종ㆍMatrix-metalloprotei-nase-2(MMP-2)ㆍUrokinase-type plasminogen activa-tor(u-PA)ㆍPlasminogen activator inhibitor-1(PAI-1). |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Metastatic process of carcinoma cells involves dissolution of tumor matrix and penetration of the basement membrane (BM) which involves the active proteolysis of type IV collagen, proteoglycan, laminin, and fibronectin. The hallmark of invasion is the penetration of epithelial BM by serine protease and matrix metalloproteinase. Matrix metalloproteinases (MMP) include type IV collagenase, interstitial collagenase, and stromelysin, where MMP-2 and MMP-9 are considered to be the most important in tumor invasion. Urokinase-type plasminogen activator (u-PA) promotes conversion of plasminogen to active plasminogen causing degradation of fibrin, fibronectin, proteoglycan, and laminin. Plasminogen activator inhibitor (PAI-1) is a specific inhibitor of u-PA, and it is involved in defense from tumor invasion through metastasis. In this thesis, the expression patterns of MMP-2, u-PA and PAI-1 were investigated in laryngeal squamous cell carcinoma in tumor invasion and lymph node metastasis.
MATERIALS AND METHODS:
Tumor tissue from 50 cases of laryngeal cancer paraffin block specimens were used from the archives of Department of Pathology in Korea University hospital to study the expression pattern of MMP-2, u-PA, and PAI-1.
RESULTS:
The results have shown that in laryngeal cancer, the positive expression rate for MMP-2 was 54%, u-PA 72%, and PAI-1 46%. The expression of MMP-2 was related with lymph node metastasis, and u-PA expression increased according to the increase of primary tumor staging. There were no significant relationship between the expression rates of MMP-2, u-PA, and PAI-1 with histopathologic grading and invasion mode. These results suggest that u-PA could be used as a biological marker for tumor size and MMP-2 for lymph node metastasis, whereas PAI-1 is not a significant marker for tumor invasion or lymph node metastasis. |
| Keywords:
Matrix-metalloproteinase-2ㆍUrokinase-typeㆍplasminogenㆍactivatorㆍPlasminogen activator inhibitor-1ㆍLaryngeal squamous cell carcinoma |
서론
조기 후두 편평세포암종은 타암종에 비하여 주변조직 및 림프절 전이가 적고 병변이 국소적으로 국한되는 경우가 많아 예후가 양호한 것으로 알려져 있으나, 진행성 후두암은 국소침윤과 주변 림프절전이로 인한 재발과 원격전이로 인하여 예후가 불량하다.1)
암의 국소침윤과 전이는 기저막을 파괴한 후 기질에 침윤하여 전이를 유발하게 되는데, 기질내 종양세포와 주변의 간질세포는 여러 종류의 단백분해 효소를 분비함으로써 침윤과 전이를 초래한다.2)3) 이러한 기저막과 기질단백 분해는 matrix-metalloproteinase(MMP)와 serine protease가 중요한 역할을 한다. MMP중 type IV collagenase에 속하는 MMP-2와 MMP-9이 침윤에 중요한 단백분해 역할을 하며,4)5) serine protease중 urokinase-type plasminogen activator(u-PA)가 주로 종양세포의 침윤에 관여하고 tissue-type plasminogen activator(t-PA)는 혈전용해에 관여하는 것으로 알려져 있다.6)7) 이러한 u-PA의 특이억제인자인 plasminogen activator inhibitor(PAI)는 plasminogen activator(PA)의 종양의 침윤과 전이에 방어기전을 담당하며, 8)9) PA와 PAI의 균형에 의하여 종양세포의 침윤이 조절된다.10-13)
이 연구에서는 다른 부위 암종에 비하여 연골로 싸여 있고 연부조직이 적은 미세환경으로 인하여 종양의 침윤을 파악하기 쉬운 후두 편평세포암종에서 단백분해효소인 MMP-2와 u-PA의 발현양상과 억제인자인 PAI-1의 발현을 관찰함으로써 후두암종의 침윤과 전이기전을 이해하고 그 표지자로서의 가능성을 알아보고자 한다.
대상 및 방법
대 상
연구대상은 최근 5년간 고려대학교병원 이비인후-두경부외과학교실에서 후두 편평세포암종으로 진단받고, 후두적출술과 경부청소술을 시행한 58례에서 방사선치료를 우선적으로 시행하였던 예와 종양조직의 보존상태가 불량하였던 8례를 제외한 50명의 후두암 환자에서 적출된 원발병소를 대상으로 하였다. 대상의 평균연령은 58.3세, 남녀비는 9：1이었으며, 원발병소는 성문암 20례, 성문상부암 30례이었다. 종양의 국소병기는 T1 2례, T2 15례, T3 23례, T4 10례이었으며, 경부청소술을 시행한 37례 중 34례에서 경부 림프절전이가 확인되었다. 임상적 병기는 제 3 기 32례, 제 4 기 18례로 모두 진행된 병기였다.
방법
재료
포르말린으로 고정 후 파라핀에 포매되어 보존된 종양조직을 3~5 μm 두께로 10편씩 박절하여 실험재료로 사용하였다.
병리조직학적 검색
채취된 절편을 hematoxylin-eosin염색하여 검경하였다. 종양의 병리조직학적 병기(pTNM)를 미국암협회 분류기준(AJCC, 1997)에 따라 종양의 분화가 좋은 것은 grade 1, 분화도가 중등도인 것은 grade 2, 분화도가 나쁜 것은 grade 3로 구분하였다. 종양의 침윤형태는 침윤양상이 심한 부위를 선정하여 조직의 기질과 종양의 경계가 뚜렷한 형태는 well deifined border, 식물의 뿌리처럼 침윤하는 형태는 cord-like invasion, 산재성으로 종양세포가 흩어져 침윤하는 형태는 diffuse invasion으로 구분하였다.
면역조직화학적 검색
염색
채취된 종양의 절편을 슬라이드에 부착시켜 항온기에 건조시킨 후 xylene을 이용하는 탈파라핀과정을 거치고, 100% 에탄올부터 95%, 80%, 70% 에탄올 탈수과정을 시행하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위하여 3% 과산화수소수로 10분간 처리한 후 수세하였다. 항원이 잘 노출되게 하기 위하여 citrate 완충용액(sodium citrate 10 mM, pH 6.0) 3L를 압력용기에 채우고 가온하여 끓을 때 슬라이드를 넣고 압력이 최고(103 kPa)에 도달한 후부터 2분간 더 끓인 다음, 찬물에 담그어 압력을 낮추고 뚜껑을 열어 슬라이드를 꺼내 수돗물에 헹군 후 일차항체를 4C에서 overnight 반응시켰다. 일차항체로는 MMP-2(Biogenesis, 5980-0207, 1：10), u-PA(Biogenesis, 7441-0634, 1：20) 및 PAI-1(Biogenesis, 7441-0004, 1：20)을 사용하였다.
일차항체를 반응시킨 후 Tris완충용액(Tris 5 mM, sodium chloride 140 mM, pH 7.4)으로 씻은 후 biotin이 결합된 이차항체를 가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 Tris완충용액으로 씻은 후 streptavidin-peroxidase용액을 가하여 30분간 반응시켰다. 재차 Tris완충용액으로 씻은 후 발색제인 60% 3,3’diaminobenzidine용액을 가하여 10분간 반응시켰다. 수세 후 Harris’ hematoxylin으로 대조염색하고 알콜로 탈수 후 봉입하여 판정하였다.
대조군
MMP-2, u-PA 및 PAI-1에 대한 일차항체인 MMP-2 (Biogenesis, 5980-0207, 1：10), u-PA(Biogenesis, 7441-0634, 1：20) 및 PAI-1(Biogenesis, 7441-0004, 1：20)으로 처치하지 않은 군을 음성대조군의 대상으로 하였다.
판정
염색결과의 판정은 광학현미경 200배 시야에서 종양세포의 세포질에 희미하거나 또는 강하게 발현되는 경우를 모두 양성으로 판정하였고, 일차항체로 처리하지 않은 음성대조군과 같이 염색이 전혀되지 않는 경우를 음성으로 판정하였다(Figs 1, 2 and 3).
통계학적 검정
통계분석은 Student t-test, Fishers’ exact test, chisquare test를 이용하여 검정하였으며, 유의수준은 0.05 이하인 경우로 하였다.
결과
발생부위별 MMP-2, u-PA, PAI-1의 발현양상
후두암종에서 MMP-2의 양성 발현은 54%(12례), u-PA 72%(36례), PAI-1이 46%(23례)이었다. 발생부위별로는 MMP-2가 성문암종 60%(12례), 성문상부암종 50%(15례), u-PA는 성문암종 80%(16례), 성문상부암종 66.7%(20례), PAI-1은 성문암종 50%(10례), 성문상부암종이 43.3%(13례)로서 발생부위별 MMP-2, u-PA, PAI-1의 발현양상은 유의한 연관성이 없었다(p>0.05).
원발병소의 종양병기(T stage)에 따른 MMP-2, u-PA, PAI-1의 발현양상
원발병소의 종양병기에 따른 MMP-2의 양성 발현율은 T2, 40%, T3, 60.9%, T4, 70%이었고, u-PA의 양성 발현율은 T2, 46.7%, T3, 87%, T4, 90%이었으며, PAI-1의 양성 발현율은 T2, 46.7%, T3, 52.2%, T4, 40%이었다. PAI-1의 발현율은 종양병기의 진행에 따른 차이가 없었으나 MMP-2와 u-PA는 병기가 진행하면서 발현율이 높았으며, u-PA의 발현율 증가는 통계학적으로 유의하였다(p<0.05)(Table 1).
경부 림프절전이에 따른 MMP-2, u-PA, PAI-1의 발현양상
MMP-2는 림프절전이가 있었던 예에서 양성 발현율이 70.6%, 전이가 없었던 예에서 18.8%, u-PA는 림프절전이가 있었던 예에서 양성 발현율이 67.7%, 전이가 없었던 예에서 81.3%, PAI-1은 림프절전이가 있었던 예에서 양성 발현율이 52.9%, 전이가 없었던 예에서 31.3%이었다.
u-PA와 PAI-1은 림프절전이 여부와 유의한 연관성이 없었으나, MMP-2는 림프절전이가 있으면 양성 발현율이 유의하게 높았다(p<0.05)(Table 2).
병리조직학적 병기에 따른 MMP-2, u-PA, PAI-1의 발현양상
병리조직학적 분화도에 따른 MMP-2의 양성 발현율은 grade 1, 40%(4례), grade 2, 58.8%(20례), grade 3, 50%(3례)였고, u-PA는 grade 1, 60%(6례), grade 2, 76.5%(26례), grade 3, 66.7%(4례)이었으며, PAI-1은 grade 1, 50%(5례), grade 2, 44.1%(15례), grade 3, 50%(3례)로써 MMP-2, u-PA, PAI-1 모두 분화도에 따른 발현양상은 유의한 연관성이 없었다(p>0.05).
종양의 국소침범형태에 따른 MMP-2, u-PA, PAI-1의 발현율
국소침범형태에 따른 MMP-2의 양성 발현율은 well defined 형태 33.3%(3례), cord-like형태 60%(15례), diffuse형태 56.3%(9례)이었고, u-PA는 well defined 형태를 보인 예에서 55.6%(5례), cord-like형태 80%(20례), diffuse형태 68.8%(11례)이었으며, PAI-1은 well defin-ed 형태 55.6%(5례), cord-like형태 40%(10례), diffuse형태 50%(8례)로써 종양의 국소침범형태에 따른 MMP-2, u-PA, PAI-1의 발현율은 유의한 차이가 없었다(p>0.05).
고찰
암의 침윤과 전이기전은 침윤한 암세포와 기저막과의 상호작용으로 시작된다.1) 일차적으로 종양세포가 세포의 기질에 유착된 후 세포의 기질이 단백분해에 의한 결손이 유발되며, 결손 부위를 통하여 종양세포가 이동한다. 이차적으로 종양세포나 주변 간질세포는 다양한 단백분해효소를 분비한다. 후두 편평세포암종은 주변구조가 연골부로 구성되어 있고 연부조직이 적은 미세환경으로 형성되어 단백분해효소의 발현이 침윤 및 전이기전에 관여한다.2) 종양침윤의 초기 단계인 기저막 분해와 기질의 단백분해기에서는 MMP와 serine protease가 중요한 역할을 하며, PAI은 serine protease인 PA의 특이억제인자로 보고되어 있어,1)3) 후두 편평세포암종에서의 MMP와 u-PA 및 억제인자인 PAI-1의 발현양상은 후두암종의 침윤과 전이기전의 이해에 도움이 된다.
MMP family는 type IV collagenase, interstitial collagenase 및 stromelysin의 세가지로 분류되며 총 11종류의 효소가 알려져 있다. 종양의 칩습기전은 기저막이 주로 type IV collagen으로 형성되어 있기때문에 type IV collagenase계의 MMP-2와 MMP-9이 가장 중요한 단백분해효소로 작용한다.3)4) MMP를 차단하는 자연억제단백이 숙주나 종양세포에서 형성되며, 이들 억제인자는 전이억제단백으로 세포기질로 종양세포의 침윤을 저해하는 tissue inhibitors of metalloproteinase가 여기에 속한다. 전이기전도 type IV collagenase로 구성되어 있는 기저막에 단백분해에 의한 이차적인 결손으로 유발된다.5) 종양세포나 주변 간질세포는 heparinase, serine proteinase, cathepsin, MMP 등 여러 종류의 단백분해효소를 분비하며, 이중 MMP가 세포의 기질분해에 관여하여 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다. 현재까지 많은 학자들이 MMP발현이 증가함에 따라 침윤 및 전이가 증가함을 생체외 실험과 생체내 동물모델에서 증명하였으며, 두경부 편평세포암종에서도 MMP의 발현이 종양의 침윤 및 전이에 관여한다고 보고하였다.14)
이 연구에서는 후두암종 MMP-2의 양성 발현율은 54%로서 발생부위별과 침윤양상, 병리조직학적 분화도에 따른 유의한 차이는 없었으나, 원발병소의 병기가 진행될수록 발현율이 높았고 림프절전이가 있는 경우MMP-2 양성 발현율이 70.6%, 전이가 없으면 18.8%로서 림프절전이가 있으면 양성율이 유의하게 높았다.
Serine protease는 배양된 내피 세포주에서 분비되고, tissue-type plasminogen activator(-PA)와 urokinasetype plasminogen activator(u-PA)가 있으며, 이중 t-PA는 주로 혈전용해에 관여하고, u-PA는 주로 암종의 침윤에 관여하는 것으로 보고되고 있다.6)7)u-PA는 분자량 52 kD인 serine protease의 일종으로 고형암에서 발현이 증가되어 기저막 분해의 중추적인 역할을 담당한다. 종양세포는 u-PA를 비활성화 형태의 proenzyme인 pro-uPA로 합성 분비하며, 이는 plasmin 등에 의하여 활성화 형태로 전환된다. 8) 활성화된 u-PA는 plasminogen에서 plasmin으로의 전환을 더욱 증가시키며, 증가된 plasmin은 종양 주위의 기질을 구성하고 있는 fibrin, fibronectin, proteo-glycan, laminin등을 파괴하고, type IV collagenase를 활성화하여 기저막의 중요 구성성분인 type IV collagen를 간접적으로 파괴시킨다.8)
최근 인체 종양조직에서 u-PA의 발현이 예후인자로서의 이용 가능성이 제시되고 있으며, ELISA(enzyme-linked immunoabsorbent assay)법에 의하여 검색된 u-PA의 면역활성능(immunoreactivity)은 고형암에서의 예후인자로 제시되었다.9)
이 연구에서는 후두 편평세포암종에서 u-PA의 양성 발현율은 72%이었고, 원발병소 종양병기별 u-PA의 양성 발현율은 T2 46.7%, T3 87.0%, T4 90%로 u-PA는 병기가 진행할수록 통계학적으로 유의하게 증가하였다. 그러나 종양의 임상적 병기, 림프절 전이, 병리조직학적 분화도 및 침윤양상과는 유의한 상관관계가 없었다. PA는 분자량에 따라 urokinase형과 tissue형이 있으며,10) 전자가 주로 종양세포에서 생성되는 PA로 알려져 있다. 이 효소의 활성도를 결정하는 주요인자는 효소억제인자인 PAI-1과 PAI-2로서 PAI은 serine protease인 PA의 특이억제인자이다.11) PAI-1은 종양의 침윤과 전이에 대한 방어기전에 관여하며, PA와 PAI의 균형에 의하여 종양세포의 침윤을 주관하는 PA의 활성도가 조절된다.1)11) PAI-1은 주로 종양세포에서만 발현되나 PAI-2는 정상과 종양세포에서 동시에 발현되어 의미가 적다. 종양조직내 PAI-1의 기능은 침윤과 전이를 위하여 종양세포가 PAI-1을 필요로 한다는 가설과 PAI-1이 침윤에 대한 방어기전을 대표한다는 가설이 있다.12) 또한 PAI-1이 유방암, 전립선암, 위암 등에서 림프절전이의 생물학적 표지자로서 보고되었으나,13) 두경부 영역에서는 보고가 드물다. 이 연구에서는 후두 편평세포암종에서 PAI-1의 양성 발현율은 46%이었으나, 발생부위, 원발병소의 병기, 병리조직학적 분화도, 경부 림프절전이 및 종양의 침윤양상과는 유의한 연관성이 관찰되지 않았다. 이러한 이유는 PAI-1이 종양의 침윤과 전이기전에는 무관하며, 침윤 및 전이에 대한 방어기전에 관여하기 때문일 것으로 추정된다.
따라서 기질 단백분해효소 중 MMP-2와 u-PA는 종양의 침윤과 전이를 예측할 수 있는 표지자의 하나라고 생각된다.
결론
단백분해효소 중 u-PA는 종양의 크기에 따라 발현한 예가 통계학적으로 유의하게 증가한 것으로 보아 종양의 크기를 반영하는 생물학적 표지자의 하나로 추정되고, MMP-2는 경부 림프절전이 양성인 군에서 음성인 군에 비하여 발현이 유의하게 증가하는 것으로 보아 림프절전이 여부의 표지자 중 하나로 추정할 수 있었으며, 단백분해억제인자인 PAI-1은 종양의 국소침윤과 림프절전이에 유의한 연관성이 없었다.
REFERENCES
1) Liotta LA, Steeg PS, Stetler-Stevenson WG. Cancer metastasis and angiogenesis: An imbalance of positive and negative regulation. Cell 1991;64:327-32.
2) Tryggvason K, Hoyhtya M, Pyke C. Type IV colagenase in invasive tumors. Breast Cancer Res Treat 1993;24:209-18.
3) Levy AT, Cioce V, Sobel ME, et al. Increased expresison of the Mr 72,000 type IV collagenase in human colonic adenocarcinoma. Cancer Res 1991;5:439-44.
4) Nakagawa T, Kubora T, Kabuto M, et al. Production of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases-1 by human brain tumors. J Neurosurg 1994;81:69-77.
5) Kim CN, Chung SM, Min JH, Kim SS, Kim MY. An immunochemical study on the expression of matrix metalloproteinase-2, tissue inhibitor of metalloproteinase-2 and angiogenesis in human laryngeal squamous cell carcinoma. Korean J Otolaryngol 1997;40:671-81.
6) Liotta LA, Goldfarb RH, Brundage R, Siegal GP, Terranova V, Garbisa S. Effect of plasminogen activator (urokinase), plasmin and thrombin on glycoprotein and collagenous components of basement membrane. Cancer Res 1981;41:4629-38.
7) Schmitt M, Janicke F, Graeff H. Tumor-associated fibrinolysis: The prognostic relavance of plasminogen activators uPA and tPA in human breast cancer. Blood Coagul Fibrinolysis;1990. p.695-703.
8) Foekens JA, Schmitt M, Putten WLJ, Peters HA, Bontenbal M, Janicke F, et al. Prognostic value of urokinase-type plasminogen activator in 671 primary breast cancer patients. Cancer Res 1994;54:6101-5.
9) Bianchi E, Cohen RC, Da A, Thor AT, Shuman MA, Smith HS. Immunohistochemical localization of the plasminogen activator inhibitor-1 in breast cancer. Int J Cancer 1995;60:596-601.
10) Liotta LA. Tumor invasion and metastasis-role of the extracellular matrix: Cancer Res 1986;46:1-12.
11) Nekarda H, Schmitt M, Ulm K. Prognostic impact of urokinase-type plasminogen activator and its inhibitor PAI-1 in completely resected gastric cancer. Cancer Res 1994;54:2900-11.
12) Ossowski L. Plasminogen activator dependent pathways in the dissemina-tion of human tumor cells in the chick embryo. Cell 1988;52:323-34.
13) Huber K, Kirchheimer JC, Sedlmayer A, Bell C, Ermler D, Binder BR. Clinical value of determination of urokinase-type plasminogen activator antigen in plasma for detection of colorectal cancer: Comparison with circulating tumor associated antigens CA 19-9 and carcinoembryonic antigen. Cancer Res 1993;53:1781-801.
14) Polette M, Clavel C, Muller D, et al. Detection of mRNAs encoding collagenase 1 and stromelysin 2 in carcinomas of the head and neck by in situ hybridization. Invasion Metastasis 1991;11:79-83.
|
|
PDF Links
Full text via DOI 
Download Citation 
