| Expression of Matrix Metalloproteinase-2 in the Cervical Lymph NodeMetastasis of the Head and Neck Squamous Cell Carcinoma-A Clinicopathologic Study-. |
| Seung Hyun Kim, Jae Shik Cho, Sang Chul Lim, Jun Baik, Chang Soo Park |
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Chonnam University Medical School, Kwangju, Korea. CJSCYY@orion.chonnam.ac.kr
2The Research Institute of Medical Sciences, Chonnam University Medical School, Kwangju, Korea.
3Department of Pathology, Chonnam University Medical School, Kwangju, Korea. |
| 두경부 편평상피암종에서 Matrix Metalloproteinase-2의 발현과 경부림프절 전이에 관한 연구 - 임상병리학적 연구 - |
| 김승현1 · 조재식2 · 임상철1 · 백 준1 · 박창수3 |
| 전남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실1;의과학 연구소2;병리학교실3; |
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| 주제어:
경부림프절 전이ㆍ두경부 편평상피암종ㆍMMP-2. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Death as a result of cancer is primarily due to regional and/or systemic metastasis. The first essential step of metastasis is active migration of cancer cells from their tissue organ. It is associated with the degradation of extracellular matrix macromolecule, including the basement membrane component of vessels and interstitial stroma. Matrix metalloproteinase-2, one of many matrix degrading enzymes, has been identified as a basement membrane-degrading enzyme and is thought to play an important role in the malignant behavior of cancer. But only a little is known about clinicopathologic features of head and neck squamous cell carcinoma in the relation to the production of MMP-2. This study was designed to investigate the relationship between MMP-2 expression in the cancer cell membrane and ervical lymph node metastasis in the head and neck squamous cell carcinoma using immunohistochemistry.
MATERIALS AND METHODS:
Tissues were obtained from 55 patients with head and neck cancer who underwent the surgery of primary tumor resection and radical neck dissection. And paraffin embedded 5nm thin sections were immunohistochemically stained for MMP-2.
RESULTS:
1) Immunoreactivity for MMP-2 was detected primarily in the cancer cell nests, whereas it was either not observed or observed infrequently and only faintly in the normal epithelium. 2) Metastasis to a lymph node was more frequently observed with the MMP-2 production in the head and neck cancer than that with no expression of MMP-2 (p<0.01). 3)There was no significant correlation between the expression of MMP-2 and the patient's age, tumor size, primary tumor site, clinical tumor stage (TNM classification), and histologic grading.
CONCLUSION:
These results suggest that intensity of MMP-2 expression in the cancer nests may be a biochemical parameter to predict a metastatic potential, prognosis, and aggressiveness of the head and neck squamous cell carcinoma. |
| Keywords:
Matrix metalloproteinase-2ㆍCervical lymph node metastasisㆍSquamous cell carcinoma |
서론
암종세포의 침윤 및 전이는 두경부종양 환자의 예후에 가장 큰 영향을 미치는 인자 중의 하나이다. 이러한 침윤 및 전이과정의 첫번째 단계는 세포외 기질의 파괴 및 통과과정으로 종양세포와 세포외 기질과의 상호작용을 검토하는 것은 종양의 악성도를 진단하는데 유용하다고 생각된다. 두경부에서 가장 많이 발생하는 편평상피암종은 병변이 진행됨에 따라 암소(cancer nest)를 형성하는 경향이 있으며 이를 둘러싼 암소주위막을 기저막이라고 하며1) 종양세포의 전이는 세포외 기질의 혈관 및 림프관을 통해 이루어지므로 이 암소주위막의 파괴가 필수적인 단계라고 할 수 있다. 이 기저막은 특히 IV형 교원질, laminin 및 heparan sulphate proteoglycan등으로 구성되어 있는데2)3) 이중 IV형 교원질이 주요 골격을 형성하고 있다.4) 한편 세포의 기질을 파괴하는 효소로 cathepsin, tissue와 urokinase-type plasmogen activator 및 metalloproteinase계의 효소 등이 알려져 있다.5)
이 중 matrix metalloproteinase-2(이하 MMP-2라 함)는 gelatin과 IV형 교원질을 파괴하여 종양 침습과 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나5-8) 두경부 편평상피세포암에서는 림프절 전이여부 및 다른 임상적 소견과의 관련성에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
이에 저자들은 원발병소에 대한 수술적 적출술 및 두경부곽청술을 시행받은 55례의 두경부 편평상피암종에서 면역조직화학적으로 암세포질에서의 MMP-2의 발현과 경부림프절전이 여부 및 다른 임상적 소견과의 관련성을 규명해보고자 본 연구를 시행하였다.
재료 및 방법
대상
전남대학교 병원에서 1990년 1월부터 1994년 12월까지 5년간 과거력상 항암제 및 방사선 치료를 받은 적이 없고 원발병소에 대한 수술적 적출술 및 경부곽청술을 시행 받은 구강(23례), 인두(11례) 및 후두(21례)에서 편평상피암종으로 진단된 55례를 대상으로 하였다.
임상 병기
구강, 인두 및 후두에 대한 이학적 소견 및 경부 전산화 단층촬영소견을 바탕으로 1988년 미국합동위원회(AJCC)가 제정한 TNM분류법을 적용하였다.
조직학적 분화도
헤마톡실린-에오신 염색절편을 이용하여 세포와 핵의 비정형성이 없으면서 많은 양의 케라틴을 함유하고 세포간교를 쉽게 관찰할 수 있는 예는 고분화 편평상피암종으로, 세포와 핵의 비정형성이 높으면서 케라틴과 세포간교를 관찰할 수 없는 예를 저분화 편평상피암종으로, 고분화와 저분화 사이의 조직학적 소견을 보이는 예를 중등도분화 편평상피암종으로 각각 분류하였다.
면역조직화학적 염색 및 양성반응의 산정
10% 중성 완충포르말린에 고정한 후 제작한 파라핀 포매괴를 5μm 두께로 박절하여 Probe-On Plus(Fisher) 슬라이드에 부착시켜 건조시킨 다음 검색에 사용하였다. 염색은 Probe-On Plus 슬라이드를 맞대어 생기는 capillary gap action의 원리를 응용하여 개발된 Microprobe Imm-uno/DNA염색기(Biomeda)를 이용하였다.
파라핀 절편이 부착된 슬라이드를 탈파라핀과 함수과정을 거쳐 내재성 과산화효소의 불활성화를 위하여 메탄올과 과산화수소가 혼합된 Autoblocker(Research Genetics)에 2분간 부치시킨 후 완충액으로 세척하였다. 일차항원의 특이적 결합을 위해 Protein Blocker(Research Genetics)에 2 분간 부치시킨후 완충액으로 세척하고 IV형교원질에 대한 일차항체인 MMP-2(Biodesign)를 1：30으로 희석하여 30분간 부치시킨 후 세척하였다. 일차항체의 검출을 위한 이차항체는 biotinylated antimouse IgG(Sigma)를 이용하여 8분간 작용시켰다. 검출계로는 peroxidase reagent를 8분간 작용시켰고, 발색은 완충액으로 수세를 한 후 chromogen를 20분간 작용시켜 적갈색의 양성반응이 나타나도록 하였으며 헤마톡실린으로 대조 염색을 시행한 후 양성반응을 관찰하였다.
염색의 전 과정에 있어서 부치온도는 40℃로 하였다.
면역조직화학적 염색을 시행한 슬라이드를 광학현미경하에서 검색하여 양성과 음성으로 나누고 양성반응 분류를 참고하여 정상 상피세포와 비교하여 같은 정도로 염색되면 (-)군, 약간 강하게 염색되면 (＋/-)군, 중등도 강하게 염색되면 (＋)군, 현저히 강하게 염색되면 (＋＋)군으로 분류하였고 (-)과 (＋/-)군을 MMP-2 음성군으로 (＋)군과 (＋＋)군을 MMP-2 양성군으로 분류하였다.
통계학적 분석
통계학적 분석은 MMP-2 음성군과 MMP-2 양성군 두군으로 나누어 Mantel -Haenszel test를 이용하였다.
결과
대상환자의 성별은 대부분(52명)이 남자였으며 연령분포는 33세부터 69세까지로 평균 56.7세였고, 60세 미만인 경우가 37례 (67.3%), 60세 이상인 경우가 18례(32.7%)였다.
종양의 원발부위에 따른 두경부암의 분포는 구강암이 23례(설암 20례, 구순암 1례, 구강저부암 2례), 인두암 11례(하인두암 5례, 편도암 4례, 설기저부암 1례,구개수암 1례), 후두암 21례(성문상암 15례, 성문암 5례, 성문하암 1례)였다.
원발성 편평상피암종의 크기는 9 mm부터 49 mm까지 다양했으며, 20 mm 이상부터 40 mm 미만이 26례(47.2%)로 가장 많았고, 20 mm 미만인 경우가 4례(7.2%), 40 mm 이상은 25례(45.4%)였다(Table 1).
임상 병기는 병기 III, IV가 각각 22례(40.0%)로 가장 많았고, II는 9례(16.4%), I는 2례(3.6%)였다(Table 2). 또한 연구 대상 중 다른 장기로의 전이(M 1)는 없었다.
조직학적 분화도는 고분화 편평상피암종이 34례(61.8%)로 가장 많았고, 중등도분화가 17례(61.8%)로 가장 많았고, 중등도분화가 17례(30.9%), 저분화인 경우가 4례(7.3%)였다(Table 3). 림프절 전이가 없는 군에서 중등도분화암종 1례를 제외하고는 모두 고분화 편평상피암종으로 나타났다.
림프절 전이는 55례의 환자 중 39례(70.9%)에서 병리조직학적으로 전이가 있었다. 전이 림프절이 없는 경우가 16례(29.0%), 림프절이 있는 경우가 39례(71.0%)였다(Table 4).
암소에서 MMP-2에 대한 면역조직화학적 염색상 (-)군은 55례중 5례, (＋/-)군은 21례, (＋)군은 24례였으며 (＋＋)군은 5례 였다. 그래서 55례 중 26례(47.3%)에서 음성 반응군이 였으며 양성반응군은 29례(52.7%)였다.
암소주위막에서의 MMP-2의 발현과 임상 및 조직학적 예후인자와의 관계에 대해 환자의 나이를 60세 미만과 60세 이상의 군으로 나누어 MMP-2의 발현을 비교해 본 결과, 60세 미만인 군에서는 37례중 20례 (54.1%), 60세 이상인 경우는 18례 중 9례(50.0 %)에서 양성반응을 보여 환자의 나이와 MMP-2 발현사이의 통계학적 유의성은 없었다.
종양의 원발부위에 따라 살펴보면 구강암 23례 중 11례(47.8%), 인두암 11례 중 7례(63.6%), 후두암 21례 중 10례(47.6%)에서 반응을 나타내어 부위에 따른 차이는 없었다.
원발성 편평상피암종 크기와 MMP-2의 발현을 비교해 볼 때 20 mm 미만인 4례 중 1례(25.0%), 20 mm 이상 부터 40 mm미만인 26례 중 18례(69.2%), 40 mm 이상인 25중 10례(40.0%)에서 양성 반응을 나타내었으나 통계학적 유의성이 없었다(p>0.05) (Table 1).
임상 병기(TNM병기)와 MMP-2의 발현에 대해 살펴보면 양성 반응이 병기 I에서 0%, II에서 44.4%, III,에서 50.0%, IV에서63.6 %로 관찰되어 병기 I, II, III에 비해 IV에서 강양성을 보이는 경향이 있으나 통계학적인 유의성은 없었다(Table 2).
조직학적 분화도에 따른 MMP-2의 발현은 고분화 편평상피암종 34례 중 27례(79.4%), 중등도분화 편평상피암종 17례 중 9례(11.8%), 저분화 편평상피암종 4례 중 3례(75.0%)에서된 양성 반응을 보여 분화도와는 상관관계가 없었다(p<0.05) (Table 3).
총 55례의 두경부 편평상피암종 중 술후 병리조직학적으로 확인된 경부림프절 전이가 없는 16례 중 12례(75.0%)에서 MMP-2의 발현이 음성반응으로 관찰되었고, 림프절전이가 있는 39례 중 25례(64.2%)에서 MMP-2의 발현이 양성반응으로 관찰되었다. MMP-2의 발현이 될 수록 림프절 전이가 많은 통계학적 유의성을 나타내었다(p<0.001)(Table 4).
고찰
암종세포의 침윤 및 전이는 두경부종양 환자 뿐만 아니라 암환자의 예후에 가장 큰 영향을 미치는 인자 중의 하나이다. 전이는 암세포가 원발병소에서 탈출하여 세포외 기질과 기저막의 장벽을 파괴한 후 새로운 곳에서 집락화를 이루는 과정이다.5) 양성상피 종양과 악성 상피 세포암과의 중요한 차이는 대부분의 정상 상피조직에 있는 기저막을 파괴하는 암세포의 능력이다. 이 기저막은 특히 IV형 교원질, laminin, 및 heparan sulphate proteoglycan등으로 구성되어 있는데2)3) 이중 IV형 교원질이 주요 골격을 형성하고 있다.4) 이러한 기저막을 파괴하는 효소로 aspartic proteinase인 cathepsin B, cystine proteinase인 cathepsin B, L, serine proteinase인 tissue 및 urokinase-type plasmogen activator등과 함께 주로 IV형 교원질을 파괴하는 metalloproteinase계의 효소 등이 알려져 있으며5-8) 분자병리학의 발전과 더불어 이런 종양의 악성도 및 전이 경향성을 예견할 수 있는 생화학적 변수를 개발하려는 많은 연구가 진행되고 있다. 그러므로 이러한 효소를 많이 생산하는지의 여부는 암 환자의 예후를 예측하는 중요한 인자로 사료된다.
특히 MMP-2는 암세포의 전이 가능성과의 연관관계가 있을 것이라는 사실에 대해 많은 연구가 이루어 왔다. Gelatinase A로 불리우는 72 kD MMP-2는 변성된 교원질 뿐만 아니라 IV형 교원질을 파괴 하므로 type IV collagenase로서 암세포에서 분비하여 기저막의 주요 골격을 파괴함으로서 종양의 국소 침습과 전이에 중요한 역할을 한다고 발표되었다.8-11)
MMP-2의 발현과 환자의 나이에 따른 차이는 없었으며, 종양의 원발부위와 MMP-2의 발현에 대한 통계학적 유의성은 없었으나 하인두암 5례 중 림프절전이가 없는 1례는 음성, 림프절전이가 있는 4례는 양성으로 발현되었다. 이는 하인두암에서 림프절전이 및 암소주위막의 소실이 많이 관찰되어 In situ hybridization을 이용하여 MMP-2 발현을 연구한 Miyajima의 결과와 일치하였다.6)
또한 종양 크기의 측정은 체적 또는 무게가 정확히 측정되어야겠으나 현실적 어려움이 있어 직경을 사용하였으나 원발성 편평상피암종 크기와 MMP-2의 발현의 연관성이 없다는 구강암에서의 Kusukawa등의 보고5)와 일치하는 소견이였다.
임상병기와 MMP-2의 발현은 구강암의 연구에서는 본연구와 같이 연관성이 없다는 보고도 있으며5) 식도암의 연구에서는 보다 진행된 병기에서 양성 발현을 보인다는 보고도 있다.7) 그러나 병기 I에서는 2례중 2례 모두 병기 II에서는 9례중 5례가 음성 반응을 보였으며 병기 III에서는 22례중 11례, 병기 IV에서는 22례중 14례가 양성 반응 소견을 보여 병기가 진행될수록 MMP-2의 발현이 양성 반응을 보이는 경향은 있으나 통계학적 의의는 없었다. 그러나 두경부 상피세포암의 경우 초기 치료 방법이 수술적 치료보다는 방사선 치료를 선호하므로 증례가 많지 않아 더욱 많은 증례에서 연구가 필요하다.
조직학적 분화도와 암소주위막에서의 MMP-2의 발현에 있어서 암종의 분화도가 높을수록 양성 발현률이 높고 분화도가 낮은 암종일수록 낮아 서로 연관성이 없다는 보고들은5,7) 저자들의 연구 결과와 일치하는 소견이었다. 하지만 분화도에 따른 각군의 비교에 있어서 저분화 암종은 불과 4례뿐이였다. 더 많은 증례에 대한 연구가 필요하리라 사료되었다.
본 연구결과 임상적 및 병리조직학적 경부림프절 전이 유무에서 비교적 높은 15.4%의 위양성율과 31.3%의 위음성율을 보였는데 이는 이학적검사, CT 및 세침흡인검사등으로 경부림프절 전이를 진단하는데 있어서의 어느정도의 한계가 있음을 시사하며 미세 전이의 관점에서 볼 때 더욱 그러하리라 생각된다. 두경부 편평상피암종 중 술후 병리조직학적으로 확인된 경부림프절 전이가 없는 16례 중 4례(25.0%)에서 MMP-2의 발현이 양성반응으로 관찰되었고, 림프절 전이가 있는 39례 중 25례(64.1%)에서 MMP-2의 발현이 양성반응으로 나타나 MMP-2의 발현이 될수록 림프절 전이가 많은 통계학적 유의성을 나타내어 Kusukawa의 연구결과 5)인 76.9% 일치하였다. 경부 림프절 전이 갯수가 3개 이하인 군과 3개 이상인 군과의 MMP-2의 양성률의 차이는 통계학적 의의는 없었으나 향후 림프절 전이의 예후에 큰 영향을 미치는 것으로 알려진 림프절외 침범과 크기에 대한 연구도 필요할 것이다.
MMP-2의 발현은 임상적인 예후인자보다 더 민감하고 객관적으로 림프절전이를 예견할 수 있는 생화학변수로서의 가능성을 제시한다고 할 수 있겠으며 보다 많은 환자를 대상으로한 MMP-2의 발현과 다른 예후인자와 관계 뿐만 아니라 림프절 전이에 관여하는 것으로 알려진 다른 단백분해효소와의 연관성에 대한 연구를 통하여 전이경향성 및 악성도를 나타내는 예후지표가 되는지 검증할 필요가 있다.
결론
원발병소에 대한 수술 및 경부곽청술을 시행 받은 55예의 구강, 인두, 후두에 발생한 편평상피암종 환자를 대상으로 면역조직화학적으로 MMP-2의 발현양상과 경부림프절 전이여부 및 다른 임상적소견과의 관련성을 규명해 보고자 본 연구를 시행하였다.
MMP-2는 암소내에서 관찰되었으며 MMP-2가 발현될수록 림프절 전이가 많은 것을 알 수 있었으며, 환자의 나이, 종양의 크기, 종양의 조직학적 분화도 및 임상병기와 MMP-2 발현사이에는 유의성이 없었다.
이는 MMP-2의 발현이 양성일수록 전이 경향성이 큰 것으로 사료되며 두경부 편평상피암종에서 임상적인 예후인자보다 더 민감하고 객관적으로 림프절전이를 예견할 수 있는 생화학적 변수(biochemical parameter)로서의 가능성을 제시하고 있다.
따라서 원발병소의 암소주위막에서 MMP-2의 발현이 양성일 경우에는 경부림프절 전이 가능성을 염두에 두고 예방적 경부곽청술등의 좀 더 적극적인 치료를 요할 것으로 생각된다.
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