Immunohistochemical Expressions of TrkB and TrkC Receptors in Rat Cochleas with Amikacin-induced Ototoxicity.

Park, So Young; Chae, Sa Yong

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(12); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(12): 1507-1512.

Immunohistochemical Expressions of TrkB and TrkC Receptors in Rat Cochleas with Amikacin-induced Ototoxicity.

Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea. sypark@sph.cuk.ac.kr

Amikacin 이독성을 유발시킨 흰쥐 와우에서 TrkB와 TrkC 수용체들의 면역조직화학적 발현

박소영 · 채세용

가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실

주제어: 와우ㆍtrkㆍ이독성ㆍ면역조직화학적 염색.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Neurotrophins have been known to be responsible for the differentiation and survival of developing neurons as well as for aiding the recovery of adult neurons from injury. The neurotrophin family includes NGF, BDNF, NT-3, and NT-4/5, and they exert their biological functions through activation of the high-affinity binding receptors, that is trkA, trkB, and trkC, with high characteristic specificity. Previous studies indicate that spiral ganglion cells express trkB and trkC mRNAs, while auditory hair cells produce NT-3 mRNA that directly affect maturation and survival of auditory neurons. It has been reported that the loss of target innervation and the eventual degeneration of auditory neurons caused by aminoglycoside ototoxicity can be prevented by the infusion of neurotrophic factors. The purpose of this study is to provide the expression patterns of trkB and trkC in the normal chochleas and damaged cochleas with aminoglycoside ototoxicity.
MATERIALS AND METHODS:
Adult Sprague-Dawley rats were treated with amikacin 500 mg/kg for ten days, and sacrificed on the 7th, 14th, 21th, and 28th day following the last injection. Auditory brainstem response was measured in each animal. Immunohistochemical method was used to study the localization of trkB and trkC receptors in the cochleas of adult rats of either normal control group or ototoxicity group.
RESULTS:
Immunoreactivities to trkB and trkC receptors were strongly positive in the spiral ganglion cells of all cochleas, especially in the neuronal perikarya of the type I cells. No difference in staining pattern was seen among the cochleas with different hearing thresholds.
CONCLUSION:
The uniform expression pattern of trkB and trkC receptors in the spiral ganglion cells regardless of the degree of ototoxicity suggests that neurotrophic factors may bind to these receptors to initiate the cellular mechanisms for neuronal survival in the injured auditory system.

Keywords: CochleaㆍTrkㆍOtotoxicityㆍImmunohistochemistry

서론 신경계의 발생과 분화 및 생존에 관여하는 신경영양인자(neurotrophic factor, neurotrophin)들은 일반적인 성장 인자들이 세포 증식을 일으키는 것에 반해 유사분열후의 신경세포(postmitotic neuron)에 작용한다. Neurotrophin family는 nerve growth factor(NGF), brain-derived neurotrophic factor(BDNF), neurotrophin-3(NT-3), neurotrophin-4/5(NT-4/5)를 포함하는 고도의 아미노산 동질성을 가지고 있는 단백질군이다. 이들의 신경세포에 대한 효과는 반응하는 신경세포가 가지고 있는 특이적 막결합 수용체와의 결합 후 신호 변환을 통해 일어나는데 그 수용체의 종류로는 친화력이 높은 protein tyrosine kinase 수용체의 trk family와, 친화력이 낮은 p75 neurotrophin 수용체가 있다. Trk 수용체는 trkA, trkB, trkC가 알려져 있으며 trkA는 NGF, trkB는 BDNF와 NT-4/5, trkC는 NT-3와 가장 높은 친화력을 가지고 우선적으로 결합한다.1) 모든 신경영양인자와 낮은 친화력을 가지고 결합하는 p75 neurotrophin 수용체는 그 기능이 아직 잘 알려지지 않았으나 trkA의 결합, 특이성, 신호전달 능력등을 조절하고 trk 수용체와 직접 상호작용이 필요하지 않은 독립적인 기전으로 여러 가지 역할을 수행할 것으로 생각된다.2) 발생시 표적 세포들은 신경세포의 화학적 유도와 생존을 위하여 신경영양인자를 생성 분비하며 표적지에 축삭이 도달한 직후에 일어나는 대량의 신경세포 사멸은 신경영양인자의 제한된 양에 기인한다.3) 청각 신경계에서도 신경영양인자와 그 수용체들은 태생기와 생후 초기에는 코르티기관의 신경지배의 성숙 과정과 신경세포 사멸에 관여하고, 성숙한 청각신경세포에서는 생존 유지와 변성 방지 및 손상된 신경세포의 재생을 촉진시킨다. 코르티기관에는 NT-3, 전정기관에는 BDNF가 주로 존재하고,4-8) 나선신경절과 전정신경절에는 trkB와 trkC 수용체가 발현한다고 알려져 있다.5)6)9)10) 이독성 약물이나 음향성 외상으로 코르티기관의 유모세포가 손상되면 청각신경세포의 변성을 초래하며 비가역적 청력 소실을 가져온다. 반면 이독성을 유발시킨 와우에서 초기의 신경영양인자 투여가 청각신경세포를 변성으로부터 보호할 수 있음이 보고되어 왔는데11-15) 이는 유모세포에서 분비되는 신경영양인자가 청각신경세포의 생존에 영향을 준다는 것과 그 수용체가 신경세포에 존재한다는 사실을 뒷받침 해준다. 기존의 연구들이 주로 발생과 분화 단계의 정상 와우에서 실행되어 왔으므로 저자들은 성숙한 흰쥐의 정상 및 이독성을 유발시킨 후 초기의 와우에서 신경영양인자 수용체들인 trkB와 trkC의 분포와 발현 양상을 면역조직화학적 염색으로 확인하고자 하였다. 재료 및 방법 재료 고막이 정상이고 정상 청성뇌간유발반응(ABR) 역치를 보이는 생후 8주된 250 gm 내외의 건강한 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐 20마리(40귀)를 사용하였고 amikacin sulfate로 이독성을 유발시켰다. 면역조직화학적 염색을 위한 일차 항체로 rabbit polyclonal anti-mouse trkB gp145 IgG, anti-porcine trkC gp140 IgG(Santa Cruz Biotech., CA, USA)를 사용하였고 일차 항체의 항원- 항체 결합을 검출하기 위해 DAKO LSAB kit K680(DAKO Co., CA, USA)과 발색 반응을 증폭시키기 위해 TSA-Indirect NEL700 kit(NEN Life Science Products, MA, USA)를 사용하였다. 방법 이독성 유발 및 청력 검사 실험 동물을 정상군 4마리와 이독성군 16마리로 나누고 이독성군에는 amikacin sulfate 500 mg/kg를 10일동안 근육주사한 후 마지막 주사한 날로부터 7일, 14일, 21일, 28일째에 4마리씩 희생하였다. 모든 동물은 희생하기 바로전에 방음실안에서 Bio-logic사의 Evoked Potential System(version 5.64, model 317, Bio-logic Systems Corp., IL, USA)을 사용하여 청성뇌간유발반응(ABR)을 측정하였다. 양측 외이도에 음전도관을 갖고있는 insert earphone을 통하여 위상이 교대로 바뀌는 광역(300 Hz~10,000 Hz)의 click음을 초당 13회 반복 자극하여 1024회를 평균하였다. 조직 고정 Ketamine 50 mg/kg과 xylazine 10 mg/kg를 근육주사하여 전신마취시키고 개흉하여 심장을 노출시킨 후 인산완충식염수용액(0.1M, pH 7.4)에 용해한 4% paraformaldehyde로 심장 관류를 통해 고정하였다. 측두골을 적출하고 4% paraformaldehyde로 난원창을 통하여 고실내 관류고정을 한후 동일 고정액으로 4℃에서 하룻밤 후고정하였다. 고정된 와우를 인산완충식염수용액(0.1M, pH 7.4)으로 세척하고 10% EDTA에서 3주동안 탈회한 후 파라핀에 포매하였다. 포매된 와우를 와우축에 평행하게 6 μm의 두께로 절편화 하여 ProbeOn slide(Fisher Scientific, PA, USA)에 부착시켰다. 면역조직화학적 염색 정상군의 와우와 이독성군 중에서 청성뇌간유발반응검사상 역치가 상승된 와우의 파라핀 절편 조직을 labelled streptavidin biotin법으로 Fisher Biotech Microprobe slide staining system(Fisher Scientific, PA, USA)을 이용하여 염색하였다. 양성 대조 염색을 위해서는 흰쥐의 뇌간 조직을 이용하였고 음성 대조 염색은 와우에서 일차 항체대신 희석액만을 첨가하였다. Slide에 부착된 조직을 xylene으로 파라핀을 제거하고 100% 알콜로 탈수시킨 후 증류수로 세척하였다. 상온에서 3% 과산화수소 용액에 10분간 처리한 후 세척하고 희석된 정상 염소 혈청과 40℃에서 20분간 항온반응시킨 다음 4 μg/ml 농도로 희석된 일차항체와 40℃에서 1시간 30분동안 항온반응시켰다. Tris-HCl 완충액으로 5분씩 3회 세척하고 이차항체(biotinylated anti-rabbit IgG)와 40℃에서 30분 항온반응시키고 세척 후 1：100으로 희석한 horseradish peroxidase-labelled streptavidin 용액에 40℃에서 30분간 반응시킨 다음 세척하였다. 발색 반응을 증폭시키기 위하여 1：50으로 희석한 Biotinyl Tyramide 용액에 실온에서 10분간 반응시키고 3회 세척후 1：100으로 희석한 horseradish peroxidase-labelled streptavidin 용액에 다시 30분간 반응시키고 세척하였다. AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)로 10분간 발색시키고 hematoxylin으로 대조염색을 한 후 봉입하고 광학 현미경으로 관찰하였다. 결과 청성뇌간유발반응(ABR) Amikacin 투여후 청성뇌간유발반응 역치가 30 dB HL이상으로 상승된 귀는 7일군에서 5귀, 14일군에서 5귀, 21일군에서 5귀, 28일군에서 7귀였으며 이독성군 16마리중 희생당시에 30 dB HL이상의 역치가 양측귀에 생긴 경우는 8마리, 단측귀에 생긴 경우는 6마리였다(Table 1). 면역조직화학적 염색 소견 TrkB 수용체 와우의 파라핀 절편조직에서 trkB 수용체에 대한 면역반응은 정상군과 이독성군의 나선신경절세포에서 모두 양성으로 나타났으며 특히 1형 나선신경절세포의 세포질에서 주로 양성 반응을 보였다. 청력 역치에 따르는 면역반응의 정도 차이는 뚜렷하게 관찰되지 않았다(Fig. 1). TrkC 수용체 와우의 파라핀 절편조직에서 trkC 수용체에 대한 면역반응은 정상군과 이독성군 모두에서 1형 나선신경절세포의 세포질에서 양성으로 나타났으며 청력 역치에 따르는 차이는 뚜렷하게 관찰되지 않았다(Fig. 2). 고찰 신경영양인자군에서 BDNF는 전정신경절세포, NT-3는 나선신경절세포의 주된 생존 인자라고 보고된 바 있으며16) 나선신경절세포를 생체외이식 배양했을때 BDNF와 NT-3가 세포의 생존과 신경돌기 성장을 촉진하였고,4) 생후 초기의 나선신경절세포를 분리 배양하면 BDNF는 신경돌기생성의 강한 자극제이고 NT-3는 세포 생존을 지지하는 것으로 나타났다.6)9) 또한 Staecker 들은 쥐 와우의 기관상 배양실험에서 BDNF는 생후 초기, NT-3는 후기의 중요한 생존인자라고 하였다.10) 생후 초기 유모세포의 신경지배 성숙 과정에서 신경영양인자의 발현 감소는 신경세포 사멸과 함께 외유모세포로부터 구심성 섬유의 퇴축을 일으켜 신경지배 양상의 광범위한 변화를 초래하고8) 성숙한 와우에서 유모세포 파괴로 인한 신경영양인자의 결핍은 나선신경절세포의 변성을 일으킨다. 청각 유모세포는 aminoglycoside 이독성이나 음향성 외상 등의 원인으로 소실될 수 있다. Beaubien 들은 실험 동물에서 amikacin으로 유도된 청력소실이 지연성으로서 약물을 중단한 후 7일이 되어야 나타나기 시작하여 더 오랜 기간이 지나야 청력 소실이 심해진다고 하였는데17) 본 실험에서도 동물들이 3주까지는 40 dB HL을 넘는 청력 소실을 보이지 않았고 4주가 되어서야 50 dB과 90 dB HL로 역치가 상승한 귀가 나타났다. 그러나, 유모세포가 완전히 파괴된 후에도 나선신경절세포의 후향성 변성은 서서히 진행되는 과정으로 2개월동안 급격히 감소하여 약 55%가 소실된 후 12개월에 최종 수준인 10%에 도달하며 2형 신경세포들이 더 서서히 변성된다고 하였다.18)19) 한편, 이독성 약제와 신경영양인자의 혼합 투여로 청각신경세포의 변성을 예방할 수 있었던 보고들11)-15)과 Van De Water 들이 성숙한 쥐의 나선신경절세포를 분리배양하여 NT-3와 BDNF는 생존인자, NGF는 신경돌기생성인자, Fibroblast growth factor-2 (FGF-2), transforming growth factor- β1(TGF- β1), ciliary neurotrophic factor(CNTF)는 청각계의 손상반응인자로서 작용하고 서로 다른 인자들의 조합은 신경세포 생존에 추가적인 효과가 있으며 NT-3와 CNTF의 조합이 가장 큰 생존률을 보였다는 보20)는 변성이 서서히 진행된다는 사실과 더불어 이독성 초기에 이들 인자가 치료 약제로서 사용될 수 있다는 가능성을 제시하였다. 신경영양인자 수용체인 trkB와 trkC의 유전자는 태생기, 생후 초기, 그리고 성숙한 쥐의 나선신경절세포에서 모두 전사된다.5)6)10) 본 실험에서 성숙한 쥐의 나선신경절세포에 trkB와 trkC 수용체들의 면역반응이 양성으로 나타난 것은 mRNA를 검출한 위의 보고들과 같은 결과이며 NT-3는 trkC와 가장 결합력이 강하지만 trkB와도 결합하는 것으로 알려져 있다. 또한 방사성표지 탐색자를 사용한 in situ hybridization 방법으로는 구별할 수 없었던 1형 나선신경절세포에 주로 표현된 것은 이들이 성숙한 쥐에서 NT-3를 분비한다고 보고된 내유모세포5)8)16)에 연접하는 세포들이라는 사실로 설명할 수 있고 Van De Water 들도 NT-3가 1형 나선신경절세포의 주된 생존인자라고 하였다.20) 본 실험에서 이독성을 유발시킨 후에도 나선신경절세포에 trkB와 trkC 수용체들이 정상군과 같은 양성 반응을 보인 것은 이독성 약제가 직접 신경세포를 손상시키는 것이 아니라 주로 표적에서 유래된 영양 효과의 소실로 인한 2차적 변성이기 때문이며, 시간이 경과되어 많은 신경세포가 소실되더라도 남아있는 세포에서는 계속 양성 반응을 보일 것으로 추측된다. 그러나 이에 관해서는 앞으로 장기적인 관찰도 필요할 것이다. 이독성시 나선신경절세포에 신경영양인자를 투여한 기존의 연구들과 그 수용체의 존재를 형태학적으로 확인한 본 실험 결과로 미루어볼때 이독성 초기에 trkB 또는 trkC 수용체와 결합할 수 있는 신경영양인자를 투여하면 청각신경세포의 생존 유지와 변성 방지를 위한 기전이 일어날 수 있을 것으로 생각되며 그외에 다른 성장 인자들과 그 수용체에 대한 연구 및 와우 유모세포의 재생과 관련된 인자들에 대한 연구도 필요할 것이다. 결론 청각신경세포의 생존 유지와 재생에 관여하는 신경영양인자 수용체인 trkB와 trkC의 와우에서의 형태학적 발현을 관찰하고자 정상 청력을 가진 흰쥐와 amikacin으로 이독성을 유발시켜 청성뇌간유발반응 역치가 상승된 흰쥐의 와우 파라핀 절편조직에서 trkB와 trkC 수용체들에 대한 일차항체를 사용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. TrkB와 trkC 수용체들에 대한 면역반응은 정상군과 이독성군의 1형 나선신경절세포의 세포질에서 양성을 보였으며 이독성의 정도에 따르는 차이는 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 이독성을 유발시킨 와우의 나선신경절세포에 trkB와 trkC 수용체들이 존재하는 것으로 보아 이독성 초기에 신경영양인자를 투여하면 이들이 수용체와 결합하여 청각신경세포의 변성을 방지할 수 있을 것이라고 생각된다.
REFERENCES
1) Barbacid M. The trk family of neurotrophic receptors. J Neurobiol 1994;25:1386-403. 2) Chao MV. The p75 neurotrophin receptor. J Neurobiol 1994;25:1373-85. 3) Davies AM. The role of neurotrophins in the developing nervous system. J Neurobiol 1994;25:1334-48. 4) Pirvola U, Ylikoski J, Palgi J, Lehtonen E, Arumae U, Saarma M. Brainderived neurotrophic factor and neurotrophin-3 mRNAs in the peripheral target fields of developing inner ear ganglia. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89:9915-19. 5) Ylikoski J, Pirvola U, Moshnyakov M, Palgi J, Arumae U, Saarma M. Expression patterns of neurotrophin and their receptor mRNAs in the rat inner ear. Hear Res 1993;65:69-78. 6) Pirvola U, Arumae U, Moshnyakov M, Palgi J, Saarma M, Ylikoski J. Coordinated expression and function of neurotrophins and their receptors in the rat inner ear during target innervation. Hear Res 1994;75:131-44. 7) Schecterson LC, Bothwell M. Neurotrophin and neurotrophin receptor mRNA expression in developing inner ear. Hear Res 1994;73:92-100. 8) Wheeler EF, Bothwell M, Schecterson LC, Von Bartheld CS. Expression of BDNF and NT-3 mRNA in hair cells of the organ of Corti: Quantitative analysis in developing rats. Hear Res 1994;73:46-56. 9) Malgrange B, Lefebvre P, Van de Water TR, Staecker H, Moonen G. Effects of neurotrophins on early auditory neurons in cell culture. Neuroreport 1996;7:913-17. 10) Staecker H, Galinovic-Schwartz V, Liu W, Lefebvre P, Kopke R, Malgrange B, et al. The role of the neurtrophins in maturation and maintenance of postnatal auditory innervation. Am J Otol 1996;17:486-92. 11) Schindler RA, Gladstone HB, Scott N, Hradek GT, Williams H, Shah SB. Enhanced preservation of the auditory nerve following cochlear perfu-sion with nerve growth factor. Am J Otol 1995;16:304-9. 12) Shah SB, Gladstone HB, Williams H, Hradek GT, Schindler RA. An extended study: Protective effects of nerve growth factor in neomycin-induced auditory neural degeneration. Am J Otol 1995;16:310-14. 13) Zheng JL, Stewart RR, Gao WQ. Neurotrophin-4/5 enhances survival of cultured spiral ganglion neurons and protects them from cisplatin neurotoxicity. J Neurosci 1995;15:5079-87. 14) Ernfors P, Duan ML, ElShamy W, Canlon B. Protection of auditory neurons from aminoglycoside toxicity by neurotrophin-3. Nature medicine 1996;2:463-67.15) Zheng JL, Gao WQ. Differential damage to auditory neurons and hair cells by ototoxins and neuroprotection by specific neurotrophins in rat cochlear organotypic cultures. Eur J Neurosci 1996;8:1897-905. 16) Ernfors P, Van De Water T, Loring J, Jaenisch R. Complementary roles of BDNF and NT-3 in vestibular and auditory development. Neuron 1995;14:1153-64. 17) Beaubien AR, Desjardins S, Ormsby E, Bayne A, Carrier K, Cauchy MJ, et al. Delay in hearing loss following drug administration: A consistent feature of amikacin ototoxicity. Acta Otolaryngol (Stockh) 1990;109:345-52. 18) Koitchev K, Guilhaume A, Cazals Y, Aran JM. Spiral ganglion changes after massive aminoglycoside treatment in the guinea pig. Acta Otolaryngol 1982;94:431-8. 19) Bichler E, Spoendlin H, Rauchegger H. Degeneration of cochlear neurons after amikacin intoxication in the rat. Arch Otorhinolaryngol 1983;237:201-8. 20) Van De Water TR, Staecker H, Ernfors P, Moonen G, Lefebvre PP. Neurotrophic factors as pharmacological agents for the treatment of injured auditory neurons. Ciba Foundation Symposium 1996;196:149-62.