| Clinical Significance of Expression of Epidermal Growth Factor, Epidermal Growth Factor Receptor, Transforming Growth Factor-alpha in Aural Cholesteatoma. |
| Jin Hwan Kim, Hyung Jong Kim, Hyung Sik Shin, Hyoun Chan Cho |
1Department of Otorhinolaryngology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. hjk1000@www.hallym.or.kr
2Department of Anatomic Pathology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea.
3Department of Clinical Pathology, College of Medicine, Hallym University, Seoul, Korea. |
| 중이진주종에서 상피성장인자, 상피성장인자수용체 및 변환성장인자-알파 발현의 임상적 의의 |
| 김진환1 · 김형종1 · 신형식2 · 조현찬3 |
| 한림대학교 의과대학 이비인후과학교실1;해부병리과학교실2;임상병리과학교실3; |
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| 주제어:
중이진주종ㆍ상피성장인자ㆍ상피성장인자수용체ㆍ변환성장인자 알파ㆍ임상적 의의. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Aural cholesteatoma is characterized by hyperproliferation of keratinizing squamous epithelium in the middle ear cleft. Although the exact mechanism of bone destruction in aural cholesteatoma is still not clear, it was recently reported that a variety of cytokines, including epidermal growth factor (EGF), epidermal growth factor receptor (EGFR) and transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) were over-expressed in aural cholesteatoma. The aim of this study is to demonstrate that there is over-expression of EGF, EGFR, and TGF-alpha in cholesteatoma and to evaluate the relationships between their expressions and clinical severity of the disease.
MATERIALS AND METHODS:
Expressions of EGF, EGFR, TGF-alpha were evaluated by immunohistochemical staining of cholesteatoma tissue and normal external auditory canal skin. The degree of expression were measured either by subjective observation and semi-quantitative image analysis.
Both subjective scores and density scores were compared with clinical variables, such as the presence of preoperative otorrhea, complication, ossicular destruction, and the stage of cholesteatoma.
RESULTS:
The expression of EGF and TGF-alpha were more increased, particularly in the suprabasal layer of cholesteatoma epithelium than the normal skin. When the ossicular destruction and more extended cholesteatomas were present, the expressions if EGF and TGF-alpha were increased in the cholesteatoma tissues.
CONCLUSION:
The degree of expression of EGF and TGF-alpha in cholesteatoma may represent the clinical severity of the disease. |
| Keywords:
CholesteatomaㆍEGFㆍEGFRㆍTGF-alphaㆍImmunohistochemistryㆍClinical severity |
서론
중이진주종은 과증식된 상피세포와 상피하 염증세포의 상호작용에 의하여 골조직을 파괴하는 병리조직학적 성질로 잘 알려져 있다.1) 중이진주종의 발생에 관해서는 고막천공이나 함몰을 통해 표피 기저세포의 침습(invasion) 또는 이동(migration)이 원인이라는 설2)과 중이점막의 화생(metaplasia)에 의하여 진주종의 중층 각화성 상피세포가 형성된다는 설3)등 각각 다른 기전으로 설명하고 있다. 그러나 이들 모두 중이내에서 각질상피가 성장특성의 변화를 일으키고 과증식함으로써 진주종을 형성한다는 점에서는 일치하고 있다.
최근 들어 진주종 상피의 증식능 발현 양상에 대한 연구가 활발히 진행되어 진주종 각질상피의 과증식 상태와 여러 성장인자 및 그 수용체와의 관계가 보고되고 있다. 그 중 상피성장인자(epidermal growth factor, 이하 EGF)는 53개의 아미노산으로 이루어진 polypeptide로 세포막에 존재하는 수용체와 결합하여 모든 종류의 세포 증식과 분화에 관여하며 세포의 생존에 필수적인 성장인자로 알려져 있다.4) 상피성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, 이하 EGFR로 약함)는 분자량 170 kDa(kilodalton)의 당단백으로 EGF와 결합함으로써 세포의 분화와 호르몬 분비에 관여하며, 변환성장인자-알파(transforming growth factor-α, 이하 TGF-α로 약함)의 수용체로서도 작용하고 있다.5)TGF-α는 5.6 kDa의 분자량을 갖는 폴리펩타이드로 정상세포는 물론 형질전환된 암세포 및 태반세포에서도 관찰되며 EGF와 구조적 및 기능적으로 유사한 점을 갖고 있다.6) 이들 성장인자 및 수용체는 중이진주종에서 각질상피의 과증식에 중요한 조절인자로서의 역할을 하는 것과 동시에 진주종 각질상피가 EGF, EGFR, TGF-α의 생성을 촉진하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.7)8)
본 연구에서는 정상 외이도와 중이진주종에서 얻은 각질상피에서 면역조직화학적 염색을 시행하여 이미 알려진 중이진주종에서의 EGF, EGFR, TGF-α의 발현 양상을 영상분석법(image analysis)을 이용한 반정량적 판정을 통하여 비교하고 여러 임상적 소견을 바탕으로 한 진주종 병변의 심한 정도와 EGF, EGFR, TGF-α의 발현과의 상관관계도 함께 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
재료
한림대학교 의과대학부속 강동성심병원 이비인후과에서 수술시 채취한 중이 진주종 조직중 표본상태가 좋은 30례와 대조군으로서 정상 외이도 피부조직 5례 및 그 환자들의 임상기록을 대상으로 하였다.
방법
면역조직화학적 관찰
수술시 채취한 조직을 각각 10% 중성 포르말린 용액에 넣어 24시간동안 고정 시킨 후 연속알콜로 탈수하고 파라핀에 포매하였으며, 4 μm 두께의 연속절편을 만들어 사용하였다. Hematoxylin-Eosin 염색을 시행하여 광학현미경하에 관찰한 후 표본상태가 양호한 것을 선택하였고 이미 만들어진 연속 절편중 다른 절편으로 labelled streptoavidine biotin kit(DAKO LSAB Kit, DAKO Corp., Copenhagen, Denmark)를 사용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다.
항체 및 시약
항EGF 항체는 토끼에서 생성한 다크론성 항체(Ab-3, Oncogene Science, Inc.,Uniondale, NY, USA)를 1：10으로 희석하여 사용하였다. 항EGFR 항체는 사람의 EGFR 단백서열의 세포외영역(extracellular domain)의 12개의 합성 다당체를 항원으로 이용하여 토끼에서 생성한 다크론성 항체(Ab-4, Oncogene Science, Inc., Uniondale, NY, USA)를 1：10으로 희석하여 사용하였다. 항TGF-α 항체는 인간에서 추출한 TGF-α를 항원으로 BALB/c mouse에 면역시켜 얻은 단크론성항체(Ab-2, Oncogene Science, Inc.,Uniondale, NY, USA)를 1：20으로 희석하여 사용하였다.
면역조직화학적 염색
슬라이드에 부착시킨 파라핀 연속절편을 56℃에서 30분간 항온처리하고, xylene으로 10분간 4회 탈파라핀화한 후 연속알콜과 증류수로 함수시켰다. 조직내의 내인성 과산화 효소의 활성을 억제시키기 위하여 과산화수소와 무수알코올이 1：9의 비율로 혼합된 용액(autoblocker)에 10분간 반응시키고 phosphated buffer saline(10 mM, pH7.4, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA, 이하 PBS)으로 3회 세척한 후 정상 염소 혈청에 10분간 처리하였다. 4℃에서 16시간동안 1차 항체와 반응시키고 PBS로 씻어 낸 뒤 biotin과 결합된 2차 항체를 가하고 30분간 실온에서 반응시켰다. 다시 PBS로 씻은 후 streptavidin-peroxidase(Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA)를 10분간 실온에서 반응시키고 다시 PBS로 씻은 뒤 발색제인 AEC(3-amino-9-ethyl carbarzole, Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA)를 10분간 반응시켰으며 wet mounting을 하여 광학현미경으로 관찰하였다. 음성대조 염색으로서 1차 항체 대신 PBS만 도말시킨 표본을 비교하였다.
면역조직화학적 염색의 판정
면역조직화학적 방법으로 염색한 조직표본을 상피의 아래층을 형성하는 기저층(basal layer)과 그 윗 부분의 세포층인 기저층 상부(suprabasal layer)로 구분하여 관찰하였으며 세포질이나 세포막을 따라 적갈색 과립상으로 보이는 경우를 양성으로 판정하였다. 임상양상을 알지 못하는 병리전문의 1인에 의해서 1차항체 대신 PBS만 반응시킨 표본의 염색 강도를(-)으로, 약간 세포막 주위에만 미세한 연한 갈색으로 염색된 경우를 약양성(＋)으로, 400배 시야를 거의 채우는 정도로 염색된 경우를 중등도 양성(＋＋)으로, 그리고 400배 시야를 완전히 넘어서는 정도로 염색된 경우를 강양성(＋＋＋)으로 판정하였으며 우선 100배 현미경 시야에서 염색이 잘 된 부위를 확인한 후 400배 현미경 시야에서 10회 판독하여 평균치를 구하였다. 임상병변의 심한 정도와의 비교분석시는 약양성 이하(-/＋)군과 중등도 양성이상(＋＋, ＋＋＋)군으로 구분하였다. 또한 이외는 별개로 좀 더 정량적인 판정을 위해 영상분석법인 black and white densitometry를 이용하여 각각의 염색정도를 density score로 나타내었다. 영상분석법은 한 시야에서 가장 밝은 부위를 0, 가장 어두운 부위를 200으로 하여 100 배 현미경시야에서 진주종상피의 기저층과 기저층상부에서 염색이 잘된 다섯부위를 선정하여 400배 현미경 시야에서 10회 판독하여 평균치를 구하였다. 영상분석을 위해 Olympus사의 videomicrographs와 Imascan Chroma-P의 video-board 및 Image-Pro Plus(Version 1.3)의 soft-ware program을 사용하였다.
임상적 소견의 구분
중이진주종의 임상병변의 심한 정도는 (1) 술전 이루(유 21례, 무 9례), (2) 안면신경마비, 미로누공을 포함하는 골파괴합병증(유 6례, 무 24례), (3) 이소골 연쇄의 파괴(유 25례, 무 5례) 및 (4) 진주종의 범위(상고실내 국한 6례, 유양동 16례, 유돌부 8례)로 구분하였다.
통계학적 검증
염색 정도의 주관적 판정 결과 및 image analysis 판정 결과 및 임상병변의 심한 정도와의 관계를 비교하기 위한 통계학적 검증은 SPSS PC Plus program(SPSS PC plus for windows, Release 6.0 beta 1, SPSS Inc.)의 χ2-test, t-test 및 one way ANOVA법을 사용하여 각각 분석하였고, 통계학적 유의 수준은 p<0.05로 하였다.
결과
정상 외이도와 진주종 각질상피에서 EGF, EGFR, TGF-α의 발현
정상 외이도와 진주종 각질상피에서 EGF, EGFR, TGF-α의 발현을 기저층과 기저층 상부로 구분하여 관찰한 결과(Fig. 1) 기저층에서는 EGF, EGFR, TGF-α 모두 약양성으로 염색되는 경우가 가장 많았으며 염색정도의 주관적 판정 및 영상분석법을 통한 판정 모두에서 정상 외이도와 진주종 각질상피간에 통계학적인 차이가 관찰되지 않았다(Fig. 2A). 기저층 상부에서는 EGF, TGF-α가 정상 외이도와 진주종 각질상피 모두에서 중등도 양성 이상으로 염색되는 경우가 많았으며 염색정도의 주관적 판정 및 영상분석법을 통한 판정 모두에서 EGF와 TGF-α의 발현이 정상 외이도보다 진주종 각질상피에서 통계학적으로 유의하게 증가되었다(p<0.05)(Fig. 2B). EGFR도 정상 외이도보다 진주종 각질상피에서 발현이 증가되었으나 통계학적인 의미는 없었다(Table 1).
진주종 각질상피에서 임상병변의 심한 정도에 따른 EGF, EGFR, TGF-α의 발현
임상병변의 심한 정도로서 술전 이루, 술전 합병증의 유무, 이소골 연쇄의 파괴, 진주종의 범위에 따라 군을 분류하여 EGF, EGFR, TGF-α 발현을 관찰한 결과 기저층은 각군 모두에서 EGF, EGFR, TGF-α 발현의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(p>0.05)(Table 2). 그러나 기저층 상부에서는 EGF가 술전 합병증이 있었던 군, 이소골 연쇄가 파괴된 군, 그리고 진주종의 범위가 유양동을 넘어선 군에서 발현이 의미있게 증가되었으며(p<0.05), TGF-α는 이소골 연쇄가 파괴된 군, 진주종의 범위가 유양동을 넘어선 군에서의 발현이 통계학적으로 의미있게 증가되었다(p<0.05). EGFR은 각 군 모두에서 발현의 유의한 차이가 관찰되지 않았다(Table 3).
고찰
EGF는 정상세포의 증식과 분화에 관여하는 분자량 6045 dalton의 폴리펩타이드 단백으로 특이수용체인 EGFR에 결합하여 protein kinase의 activity를 증강시키고 auto-phosphorylation에 의하여 다른 cellular substrate를 생성시킨다.8) EGFR은 EGF의 특이수용체로 170,000 dalton의 인당단백으로 세포막내외에 걸쳐있으며 구조는 성장인자와 결합하는 extracellular domain, 세포막을 관통하는 짧은 hydrophobic domain, 그리고 수용체와 결합된 신호를 세포내로의 전달을 맡는 intracellular domain으로 구성되어 있다.9) EGF가 EGFR의 extracellular domain에 결합하게 되면 tyrosin specific kinase가 활성화되고 protein kinase C, phospholipase C, G protein, adenylcyclase가 활성화되어 이온교환, 세포내 pH의 변화, 세포골격의 재배열, 단백합성 능력의 변화 등 일련의 생화학 반응이 일어나 결과적으로 DNA 생성과 세포의 증식이 일어나게 된다.10) 한편 EGFR sequencing data와 complementary DNA analysis에 따르면 EGFR의 cytoplasmic portion과 v-erb-B transforming oncogene 사이에 sequencing homology가 있어 EGFR이 정상 및 비정상 세포의 성장을 조절하는데 중요한 역할을 하리라 생각되고 있다.9) TGF-α는 50개의 아미노산 펩타이드로 구성된 분자량 5600 dalton의 단일사슬 단백질로 구조상 EGF와 35%의 동등한 염기서열을 가진다. EGF와 마찬가지로 EGFR에 부착되어 작용하지만 EGF보다 더욱 강력한 생물학적 활동성을 가지는 것으로 알려져 있다.11) TGF-α는 주로 암종(carcinoma), 태반, 태생기 신장등에서 생성되며 정상피부의 각질세포와 면역학적으로 활성화된 대식세포에서도 생성되어 다시 각질세포의 분화 및 증식을 촉진시키며 상피세포의 성장 및 창상치유 및 재생기전에 관여하는 것으로 생각된다.12)
본 연구에서는 우선 정상 외이도와 중이진주종 각질상피에서 면역조직화학적 염색을 통해 EGF, EGFR, TGF-α의 발현 부위와 발현 정도를 비교하였다. 발현 정도의 비교에 있어 기존의 병리전문의 1인이 시행한 주관적 판정에 의한 측정과 함께 영상분석법을 사용한 반정량적 측정의 두가지 방법을 병행하였다. 그 결과 기저층에서는 EGF, EGFR, TGF-α의 발현에 있어 염색정도의 주관적 판정 및 영상분석법을 통한 판정 모두에서 정상외이도와 진주종 각질상피간에 통계학적인 차이가 관찰되지 않았다. 그러나 기저층 상부에서는 EGF와 TGF-α의 발현이 정상 외이도보다 진주종 각질상피에서 통계학적으로 유의하게 증가되었다. 이 결과는 많은 악성종양, 건선(psoriasis)과 같은 다른 과다증식상피질환에서 연구된 결과와 일치된 소견13)으로 중이진주종 각질상피의 과증식에 EGF, TGF-α등의 성장인자들이 관여하고 있다는 사실을 뒷받침 하고 있다. 또한 본 연구에서 염색정도의 주관적 판정 및 영상분석법을 통한 판정 모두에서 EGF, TGF-α가 진주종의 기저층 상부에서 발현이 증가된 일치된 결과를 보여 영상분석법이 정량적 연구의 한 방법론으로 사용될 수 있다는 근거를 제시할 수 있었으며 본 연구는 주관적 판정에 의존한 이전에 발표된 연구결과보다 좀더 정량적인 방법에 의해 발현의 증가를 증명할 수 있었다는데에 그 의의가 있다.
그러나 본 연구에서 EGFR의 경우 진주종 각질상피에서 과발현이 관찰되는 다른 연구결과8)14)들과는 달리 정상 외이도와 진주종간의 발현정도에 의미있는 차이를 보이지 않았다. 이는 예상했던 결과와는 다른 것으로 그 이유로는 첫째, 진주종 조직의 표본채취 부위를 일정하게 하는데 어려움이 있어 결과에 영향을 미쳤을 가능성이 있다. 중이진주종 조직은 사이토케라틴등의 발현15)으로 볼 때 활동기와 비활동기의 상태가 혼합되어 있는 불균질적 조직으로 조직채취 시기와 부위에 따라 EGFR등의 단백의 발현이 달라질 수 있기 때문이다. 둘째, 기존 문헌의 발현정도의 판정에 오류의 가능성을 들 수 있다. 예를 들어 중이진주종에서 CK10의 발현 정도에 관한 결과가 본 연구에서 사용한 영상분석으로 판정하였을 때 기존 문헌과 차이를 나타내었으며15) 이것은 보다 객관화된 판정법과 일정한 표본채취법을 통한 추가 연구에 의하여 확인되어야 할 부분이다. 셋째, EGF와 결합하는 EGFR의 세포막외 부분이 포르말린고정 및 파라핀 포매과정에서 변성을 일으킬 수도 있는 가능성16) 또한 생각해 볼 수 있지만 같은 방법으로 염색한 EGF나 TGF-α의 결과를 고려하면 가능성이 크지 않다. 저자들은 이러한 결과의 차이를 설명하기 위해서 면역조직화학적 염색외의 다른 방법, 효소면역법(enzyme linked immunosorvent assay, ELISA), 형광 항체를 부착시킨 후 유세포계측, 그리고 조직에서 m-RNA의 양을 측정하는 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction)을 이용하는 방법등의 병용이 필요하다고 생각되며 이미 유세표계측을 통해 중이진주종에서 EGFR의 발현의 증가를 보고한바 있다.14)
또한 본 연구 결과에서 EGF, EGFR, TGF-α의 발현은 진주종 각질상피의 기저층 및 기저층 상부에 따라 다르게 나타났으며 기저층 상부에서 더 강하게 염색되어 정상 외이도와 진주종간의 염색 강도의 차이가 주로 기저층 상부에서 일어났음을 알 수 있었다. 이와같은 원인은 정상 외이도 상피의 분화 및 증식이 주로 기저층에서 일어나는데 반해 진주종에서의 중요한 병리기전은 기저층 상부에서 일어나기 때문으로 생각할 수 있다.14)17) Bujia 등18)의 EGFR과 TGF-α에 대한 단클론성 항체를 이용한 면역조직화학적 연구결과에서도 진주종에서의 발현양상이 불균질적(heterogenesity)이라는 점이 확인되어 진주종에서 증식과 분화를 일으키는 세포층이 정상 피부상피와는 다를 것이라는 가능성을 시사하고 있다.
중이진주종에서 EGF, EGFR, TGF-α 발현의 임상적 의의를 알아보고자 여러 임상적 소견을 바탕으로 한 진주종 병변의 심한 정도와 EGF, EGFR, TGF-α의 발현과의 비교연구 결과에서는 기저층 상부에서 EGF가 술전 합병증이 있었던 군, 이소골 연쇄가 파괴된 군, 그리고 진주종의 범위가 상고실을 넘어선 군에서 발현이 증가되었으며 TGF-α는 이소골 연쇄가 파괴된 군, 진주종의 범위가 상고실을 넘어선 군에서의 발현이 증가되었음이 관찰되었다. 본 연구의 결과는 임상적 병변, 특히 이소골 연쇄의 파괴와 진주종 범위의 심한 정도가 EGF, TGF-α 발현의 증가와 연관이 있으며 이는 진주종 각질상피의 활발한 증식이 임상적으로 심한 증상을 일으킬 수 있다는 사실을 시사하고 있다. 그러나 실제로 제한된 임상 소견만을 가지고 중이진주종의 증식능을 정확히 파악 하는데는 한계가 있을 것으로 생각되며, 진주종은 흔히 비균질적인 조직상을 보이는 이유로 조직을 채취한 부위에 대한 고려도 필요하기 때문에 성급한 결론을 내리는 것은 무리가 있다. 앞으로 EGF, EGFR, TGF-α의 발현을 진주종의 진행 및 합병증의 발생 등의 임상적 예후를 판정하는 진단적 목적으로 이용하기 위해서는 좀더 많은 례를 포함한 실험군과 대조군을 통한 추가 연구가 필요할 것으로 생각된다.
결론
정상 외이도와 중이진주종에서 얻은 각질상피에서 면역조직화학적 염색을 시행하여 EGF, EGFR, TGF-α의 발현 부위와 양상을 주관적 판정 및 영상분석법을 통한 반정량적 판정을 통해 비교하고, 여러 임상적 소견을 바탕으로 한 진주종 병변의 심한 정도와 EGF, EGFR, TGF-α의 발현을 비교한 결과 정상 외이도에서보다 진주종 각질상피의 기저층 상부에서 EGF(p<0.05), TGF-α(p<0.05)의 발현이 증가되었고, 진주종병변의 임상적 소견 중 이소골 연쇄의 파괴가 있거나 진주종의 범위가 유양동을 넘어선 군에서 그렇지 않은 군에서보다 EGF, TGF-α의 발현이 증가된 결과를 얻었다.
이상의 결과로 진주종의 발생 및 증식에 EGF등 성장인자의 일정한 역할이 짐작되며 면역조직화학적 염색과 영상분석을 통한 발현정도를 이용하면 이소골 연쇄의 파괴 및 진주종의 범위 등 임상적 예후를 판정하는 목적으로 이용될 수 있는 가능성을 제시하였다.
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