The Effect of All-trans-retinoic Acid on the Cell Cycle of Head and Neck Squamous Cell Carcinomas.

Park, Seon Tae; Lee, Hyuck Soo; Yu, Hwa Kyung; Kim, Sang Yoon

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(4); 1999 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(4): 471-477.

The Effect of All-trans-retinoic Acid on the Cell Cycle of Head and Neck Squamous Cell Carcinomas.

Seon Tae Park, Hyuck Soo Lee, Hwa Kyung Yu, Sang Yoon Kim

Department of Otolaryngology, Asan Medical Center, University of Ulsan College of Medicine, Seoul, Korea. sykim2@www.amc.seoul.kr

All-<i>trans</i>-retinoic Acid가 두경부편평세포암종의 세포 주기에 미치는 영향

박선태 · 이혁수 · 유화경 · 김상윤

울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실

주제어: 레티노이드ㆍ세포 주기ㆍ두경부 편평세포암종.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVE: Retinoids, including vitamin A and its synthetic analogs, are known to suppress carcinogenesis in various epithelial tissues and also to inhibit the cell growth of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). However, the exact mechanism of retinoids is not yet known. The aim of this study is to investigate the effect of all-trans-retinoic acid (RA) on the cell cycle in HNSCCs and to see if the inhibition of cell growth by RA is due to the arrest of cell cycle.
MATERIALS AND METHODS:
For in vitro study, AMC-HN-4 and AMC-HN-6 (HNSCC cell lines) were treated with 1 nM of RA and cultured for 6 days. CellTiter 96(TM) AQ(ueous) Non-Reactive Cell Proliferation Assay kit was used to analyze the inhibition of cell growth. Flow cytometric analysis was performed for cell cycle analysis. For in vivo study, AMC-HN-4 and AMC-HN-6 were injected subcutaneously into athymic nude mice and RA (20 mg/kg) was orally administered once a day for 30 days. Tumor volumes were measured with digimatic caliper and the cell cycle was analyzed using frozen specimens.
RESULTS:
The growth of AMC-HN-4 and AMC-HN-6 were inhibited by RA in vitro and in vivo. The inhibitory effect of RA was more significant in AMC-HN-4 than in AMC-HN-6. RA had no significant effect on the cell cycle in the medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), but there was a mild increase in the G1 phase in the medium containing 0.5% FBS in vitro. In vivo, the increase in G1 phase was observed in both AMC-HN-4 and AMC-HN-6. Also, G1 arrest was more significant in AMC-HN-4 than in AMC-HN-6.
CONCLUSION:
This study suggests that RA may induce G1 arrest, which might be associated with the inhibition of cell growth in HNSCCs.

Keywords: All-trans-retinoic acidㆍCell cycleㆍHead and neck squamous cell carcinoma

서론 비타민 A와 그의 유도체인 레티노이드는 상피세포의 정상적인 성장 및 분화에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있다.1) 비타민 A가 결핍되면 상피세포에서 편평화생(squamous metaplasia)이 유발되며 이는 비타민 A나 레티노이드에 의해서 가역적으로 회복될 수 있고, 반대로 비타민 A가 지나치게 많을 때에는 각질화(keratinization)가 억제되며 여러 상피세포에서 점액화생(mucous metaplasia)이 생길 수 있다는 보고가 있다.2) 여러 동물 실험을 통해서 레티노이드가 피부, 기관, 폐 및 구강점막 등의 여러 상피세포의 암발생을 억제한다고 밝혀졌다.3) 또한 레티노이드의 작용으로 구강내의 전암성 병변(oral premalignant lesion), 두경부종양이나 폐종양 환자에서 2차 원발성 종양(second primary tumor), 색소성 건피증(xeroderma pigmentosum) 환자의 피부암이 억제되는 것도 알려져 있다.4) 정상 상피세포 뿐만 아니라 여러 두경부의 편평세포암종도 레티노이드에 의해 영향을 받아 그 성장과 분화가 억제되는 것은 여러 연구자들에 의해 보고되었으며,5)6) 레티노이드의 두경부 편평세포암종의 치료에 있어서의 역할 및 임상적 적용에 대해 많은 연구가 진행되고 있다.7) 세포 주기의 조절은 세포의 성장에 관여하는 중요한 기전으로 세포 주기가 G1기에서 멈추게 되면 세포의 성장은 멈추고 일부 세포들은 분화하거나 세포자사(apoptosis)가 일어난다. 마찬가지로 레티노이드에 의한 두경부 편평세포암종의 성장 억제도 세포 주기에 영향을 주어 발생할 가능성이 많으며 일부 보고에서는 G1기 정지(G1 arrest)를 일으킨다는 보고가 있으나8) 아직까지는 논란이 있는 실정이다. 또한 지금까지 보고된 많은 실험은 in vitro에서만 시행하여 in vitro의 결과가 in vivo와 일치하는지 알 수 없다. 본 연구에서는 2종류의 두경부 편평세포암종 세포주(AMC-HN-4와 AMC-HN-6)를 이용하여 레티노이드의 성장 억제 효과의 확인 및 레티노이드에 의한 세포 주기의 변화를 관찰함으로써 세포 주기의 변화와 세포 성장 억제의 연관성에 대해 알아보고자 하였다. 대상 및 방법 세포배양 두경부 편평세포암종으로부터 유래한 AMC-HN-4, AMC-HN-6 세포주 9)의 배양은 Eagle's minimum essential medium(MEM)에 L-glutamine(2 mM)과 56 ℃에서 30분간 불활성시킨 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY, USA), penicillin(100 units/ml), streptomycin(100 μg/ml), fungizone(0.25 μg/ml)이 첨가된 배지에서 5% 이산화탄소와 습기가 유지되는 37℃의 항온, 항습 배양기에서 배양하였다. 시험관 내 세포 성장 분석 1×10 5 세포를 0.05% trypsin-EDTA로 처리하여 단일 부유 세포로 만든 후, 10% FBS가 함유된 MEM 배지로 3회 세척하고 한 well당 100 μl의 배양액에 1×10 4세포를 부유하여 microplate(Nunc)에 분주한 후, 5% 이산화탄소와 습기가 유지되는 37℃의 항온, 항습 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 1 μM all-trans-RA(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 각 well에 첨가하였다. 대조군의 well에는 동량의 dimethylsulfoxide(DMSO)를 첨가하고 3일 후 배양액을 교환해 주었다. 세포 증식은 CellTiter 96 TM AQ ueous Non-Reactive Cell Proliferation assay(Promega Corp., Madison, WI)를 이용하여 측정하였다. MTS/PMS(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazo-lium/phenazine methosulfate) 용액 20 μL를 각 well에 넣은 후 습도와 5%의 이산화탄소가 유지되는 37℃의 항온, 항습 배양기에서 2시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 microplate는 ELISA plate reader(Molecular Divices)를 이용하여 490 nm 파장에서 판독한 실험군의 색소흡수율(absorbance, optical density)을 대조군의 색소흡수율과 비교하여 아래의 공식으로 생존율을 구하였다. 시험관 내 세포 주기 분석 1×10 5세포를 T25 flask에 부유하고, 10% FBS가 포함된 기본 배지에 24시간 배양한 후, 각각 10% FBS와 0.5% FBS가 포함된 배지로 교환하였다. 각각에 대해서 실험군으로는 1 μM all-trans-RA(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 첨가하고 대조군으로는 동량의 DMSO를 첨가하였다. 3일 후 배양액을 교환해 주었고, 3일간 추가 배양을 하였다. 배양된 세포에 0.05% trypsin/EDTA 처리를 하고 cold phosphate buffered solution(PBS)으로 세척한 후 cold 70% ethanol로 하룻밤 동안 고정하였다. 고정된 세포를 50 μg/ml RNase A, 50 μg/ml propidium iodide, 0.1% triton X-100, 0.1 mM EDTA in PBS로 1 시간동안 처리하였다. 염색된 세포의 flow cytometric analysis는 Becton-Dickinson FACScan(Becton-Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 시행하였다. 결과 분석은 Becton-Dickinson cell FIT cell-cycle analysis를 이용하여 세포 주기의 G1기, S기, G2＋M기의 분율을 계산하였다. 생체 내 세포 성장 분석 AMC-HN-4, AMC-HN-6 세포를 배양액에 1×10 7 cells/ml의 농도로 부유시켰다. 종양 세포를 이식(implantation)하기 전에 RA를 경구로 위내급식관(intragastric feeding tube)를 통해 20 mg/kg의 양을 0.1 ml의 참기름(sesame oil)(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 녹여서 주입하였다. 종양 세포(5×10 6)를 생후 6∼8주 정도 된 무흉선(athymic) nude mice(Asan Institute for Life Science, Seoul, Korea)의 배부 양측에 피하 주사하였다. RA는 하루에 한 번씩 경구 투여하였다. 종양의 크기는 digimatic caliper(Mitutoyo Corp., Japan)를 이용하여 길이, 너비, 및 두께의 곱으로 계산하였고, 각 실험군별로 네 마리의 실험 동물에서 얻은 여덟 개의 종양 조직의 값을 평균하였다. 실험 동물은 종양을 이식한 지 30일 후에 조직을 얻기 위해 희생시켰다. 생체 내 세포 주기 분석 이식한 지 30일 후 얻은 종양 조직의 동결 절편을 만들고, 30 μm로 잘라 10 조각의 절편을 얻은 후, PBS 안에서 녹인 다음 잘게 썰어 시험관에 옮기고 4℃, 2,000 rpm으로 10분간 원심분리하였다. 상층액은 버리고 남은 침전물에 0.5% pepsin solution(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)을 넣어 37℃에서 1시간 반응시키고 55 μm nylon mesh로 여과하여 세포부유액(cell suspension)을 얻었다. 다시 4℃, 1,500 rpm에서 원심분리하여 얻은 cell pellet으로 세포 주기를 분석하였다. 이 후의 세포 주기 분석은 시험관 내(in vitro)에서와 동일한 방법으로 시행하였다. 결과 RA에 의한 시험관 내 두경부 편평세포암종의 성장 억제 두 종양 세포주 모두 RA에 의해서 성장이 억제되었으나, AMC-HN-4 세포는 배양 6일째 대조군에 비해 47%의 성장 억제를 보였으나, AMC-HN-6 세포는 배양 6일째 대조군에 비해 8%의 성장 억제를 보여 RA에 의한 성장 억제는 AMC-HN-4 세포에서 더 두드러진 양상을 보였다. 두 종양 세포주의 RA에 의한 성장 억제 정도는 배양 기간에 따라서 차이가 많이 나는데, 첫3일 동안에는 RA에 대한 반응이 AMC-HN-4과 AMC-HN-6 세포주에서 별 차이를 보이지 않았으나 6일 동안 배양을 한 뒤에는 AMC-HN-4의 세포 성장의 억제는 지속되는 반면 AMC-HN-6에 대한 세포 성장 억제 효과는 3일째보다 약간 감소되었다(Fig. 1). RA에 의한 시험관 내 두경부 편평세포암종의 세포 주기의 변화 AMC-HN-4와 AMC-HN-6 세포주 모두 10% FBS가 포함된 배양액에서 3일째, 6일째의 G1기 세포의 비율이 대조군과 별 차이를 보이지 않았다(Figs. 2 and 3). 하지만 0.5% FBS가 포함된 배양액에서 배양을 시켰을 때에는 AMC-HN-4 세포에서는 배양 6일째 대조군 G1기 세포의 비율이 89.7%, 실험군 G1기 세포의 비율이 94.1%로 RA에 의해 약간 G1기가 증가하는 경향을 보였다(Fig. 4). AMC-HN-6 세포는 0.5% FBS가 포함된 배양액에서 배양을 시켰을 때에도 G1기의 변화가 없었다(Fig. 5). RA에 의한 생체 내 두경부 편평세포암종의 성장 억제 AMC-HN-4 세포는 종양 세포 이식 후 30일 동안 RA를 경구 투여했을 때 60%의 성장 억제를 보였다(p<0.05；n＝8)(Fig. 6). AMC-HN-6 세포도 AMC-HN-4 세포에 비해서 성장 억제의 정도가 적지만 종양 세포 이식후 30일 동안 RA를 경구 투여했을 때 48%의 성장 억제를 보였다(p>0.05；n＝8)(Fig. 7). RA에 의한 생체 내 두경부 편평세포암종의 세포 주기의 변화 시험관 내 실험과는 달리 생체 내의 실험에서는 RA에 의한 두경부 편평세포암종의 세포 주기 변화가 두드러지게 나타났다. AMC-HN-4 세포주는 30일 간의 RA 경구 투여 후 G1기가 대조군의 47.7%에 비하여 80.3%로 G1기 정지(G1 arrest)가 유도되었다(Fig. 8). 또 AMC-HN-6 세포주도 RA 투여에 의하여 G1기가 대조군의 67.7%에 비해 73.6%로 약간 늘어났다(Fig. 9). 고찰 비타민 A의 결핍과 암 발생과의 관련성은 항암 작용에 관여하는 레티노이드의 신호 전달 체계의 가능성에 대해 시사해 주고 있다. 레티노이드는 대부분의 두경부 편평세포암종의 성장을 억제하고,5)6) 한천(agar)에서의 군락(colony) 형성을 억제하는 작용을 한다.5) 세포의 성장은 편평상피의 분화와 밀접한 관계를 갖고 있는데 레티노이드는 또한 두경부 편평세포암종의 분화에도 억제 작용을 하는 것으로 알려져 있으며,6) 이는 레티노이드에 의해서 편평분화(squamous differentiation)의 표지자인 transglutaminase type I (TGase-I), involucrin, keratin K1등에 대한 mRNA와 단백질이 감소되는 것으로 증명되었다. 4) 따라서 보다 효과적인 레티노이드의 임상 적용을 위해서는 정상 및 악성 상피세포에 대한 레티노이드의 작용을 잘 이해하는 것이 필요하다. 레티노이드에 의한 악성세포의 성장 및 분화 억제와 전암성 병변의 암으로의 진행 억제에 관여하는 기전으로는 유전자 발현의 조절이 가장 널리 받아들여지고 있다.10) 유전자 발현을 조절하기 위해서 레티노이드는 세포핵에 신호를 전달해야 하는데, 여기에 핵내의 레티노이드 수용체가 작용하게 된다. 레티노이드 수용체는 스테로이드/갑상선 호르몬/비타민 A 수용체군의 일원으로 배위자(ligand)에 결합하여 작용하는 전사 요소(transcription factor)다. 이 수용체가 레티노이드의 작용을 매개하여 유전자 발현의 조절을 통해 정상 및 암세포의 성장과 분화에 영향을 주게 된다. 핵내의 레티노이드 수용체는 RARs과 RXRs의 두 종류가 있으며, 이들은 각각 α, β, γ의 세 아형을 갖는다.11) 레티노이드 수용체 중에서 상피세포에 주로 존재하는 RAR β의 작용이 레티노이드의 작용에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. RAR β는 정상 상피세포에는 존재하지만 많은 상피세포 종양에서는 존재하지 않으며, 이는 RAR β 기능의 부재가 고형세포암의 생성에 중요한 역할을 할 것이라는 것을 시사한다. 본 연구에서 RA에 의한 두경부 편평세포암종의 성장 억제 효과에 대한 실험 결과를 보면, AMC-HN-4과 AMC-HN-6 세포주 모두 시험관 내와 생체 내의 실험에서 편평세포암종의 세포 성장을 억제하는 것으로 나타났다. 시험관 내의 실험에서는 3일째까지는 AMC-HN-4와 AMC-HN-6 세포주가 RA에 의해서 거의 비슷한 정도로 성장이 억제되었으나, 6일째로 가면 AMC-HN-4 세포주에서는 시간이 경과함에 따라 계속적인 암세포 성장의 억제가 관찰되지만 AMC-HN-6 세포주에서는 오히려 성장 억제 효과가 감소되어 3일째보다 세포의 생존율이 더 높아지는 것으로 나타났다. 이러한 경향은 생체 내의 실험에서도 관찰되는데 AMC-HN-4 세포주가 AMC-HN-6 세포주에 비해 이종이식 모델에서 RA에 대해 더 민감한 반응을 보였다. 이는 AMC-HN-6 세포주에서 RA에 의해 유도되는 microsomal P450에 의한 RA의 이화작용(catobolism)으로 설명할 수 있다.12) 시험관 내의 실험에서 보듯이 AMC-HN-6 세포주에서도 외부에서 투여된 RA에 의해 세포성장의 억제가 일어나 AMC-HN-4 세포주와 비슷한 양상의 암세포 성장 억제 효과를 보이지만, 시간이 더 경과하면 AMC-HN-6 세포주에서는 p450이 유도되어 RA의 이화작용이 일어나 암세포 성장 억제 효과가 약화되는 반면, P450이 유도되지 않는 AMC-HN-4 세포주에서는 시간이 경과해도 RA의 세포 성장 억제 효과가 여전히 지속되어 배양 6일 째에는 두 세포 사이의 RA에 의한 성장 억제에 차이를 보이게 된다. 30일 동안 RA를 경구 투여하며 RA의 암세포 성장 억제 효과를 보았던 생체 내 실험에서의 AMC-HN-4 세포주와 AMC-HN-6 세포주의 RA에 의한 성장 억제 효과의 차이도 같은 이유로 설명할 수 있다. 이는 두경부 편평세포암종들 중에서도 종양의 원발 부위, 종양의 분화도 등 개개 종양의 특성에 따라 RA에 대한 반응이 서로 다르다는 Lotan등13)의 보고와도 일치한다. RA에 의한 세포 성장의 억제는 세포독성(cytotoxicity)보다는 세포증식억제(cytostasis)와 더 관련이 있을 것으로 생각되며, 그 근거로 RA 처리 후에도 세포의 생활력(viability)이 유지되고 성장 억제가 가역적이라는 사실을 들고 있다.14) 세포 주기의 조절은 세포 성장에 있어서 중요한 조절 기전이다.15) Seewaldt 등8)은 RA와 RARβ가 유방암세포주에 어떻게 작용하는지 알아보고자 유방암세포주인 MCF-7과 MDA-MB-231에 유전자 전이를 통해 RAR β를 발현시킨 후에 RA를 처리했을 때 이 두 세포주에서 G1기 정지가 유도되는 것을 관찰했으며, G1기 정지는 암세포주에서 뿐만 아니라 정상 상피세포에서도 일어나는 것을 확인하였다. Zhu 등16) Mangiatotti 등17)도 RA에 의한 MCF-7 세포의 성장 억제에 관여하는 기전으로 G1기 정지와 세포자사의 유도에 대해서 언급하였다. 반면에 Sacks 등7)은 두경부 편평세포암종은 RA 처리에 의해 성장 억제가 유도되지만, 세포 주기의 진행은 영향을 받지 않고 DNA 합성도 지속되므로 RA와 항암제의 병합요법을 제안하고 있다. 따라서 여전히 RA에 의한 세포 성장의 억제가 G1기 정지에 의해서인지, 세포 주기에서 빠져나와 G0 휴지기(quiescent phase)로의 진입에 의해서인지, 세포자사에 의한 세포의 죽음에 의해서인지의 여부는 불명확한 상태다. 본 연구에서도 RA에 의한 암세포 성장 억제와 함께 암세포의 세포 주기의 변화를 관찰하여 둘 사이의 연관성에 대해 살펴보았다. 먼저 시험관 내에서의 세포 주기의 변화에 대한 실험 결과를 보면 10% FBS이 포함된 배양액을 사용했을 때는 AMC-HN-4 and AMC-HN-6 세포주 모두 3일 째와 6일 째에 대조군에 비해 G1기의 비율이 별 차이를 보이지 않았다. 혈청 내에 존재하는 RA 및 RA의 활성도에 영향을 미치는 알부민 등의 영향을 배제하기 위하여 0.5% FBS이 포함된 배양액을 사용했을 때는 AMC-HN-6 세포주에서는 역시 RA에 의해 G1기의 비율의 변화를 보이지 않았으나, AMC-HN-4 세포주에서는 6일 째에 대조군에 비해 G1기의 비율이 약간 증가하는 경향을 보였다. 이 차이는 0.5%에 비해서 10% FBS에는 내재된 RA의 양이 많고, 또 혈청 내에 있는 알부민이 RA와 결합하여 RA의 생체이용률을 저하시키기 때문에 상대적으로 외부에서 첨가된 RA의 효과가 실제보다 적게 나타났다고 설명할 수 있다.18) 따라서 시험관 내의 실험 결과로는 세포 주기의 유의한 변화가 일어나지 않아 RA에 의한 세포 성장 억제를 다른 원인으로 생각하여야겠지만, 0.5% FBS을 사용한 배양액에서는 AMC-HN-4 세포주 배양 6일 째 약간의 G1기 정지를 보여 RA가 G1기 정지를 통해서 세포 성장 억제 작용을 할 가능성을 배제할 수는 없다. 세포 주기의 변화를 보기 위한 생체내 실험에서는 시험관내 결과와 달리 30일 간의 RA 처리에 의해 G1기 정지가 뚜렷이 유도되는 것이 관찰되었으며, 이는 특히 AMC-HN-4 세포주에서 두드러지게 나타났다. 생체 내 결과와 시험관 내 결과가 차이를 보이는 것에 대해서는 여러 가지 이유를 생각해 볼 수 있다. 생체 내에서는 시험관 내에서와 달리 다른 인자들과의 상승 작용(synergism)이 있을 가능성이 있다. Glick 19)등은 쥐의 각질세포(murine keratinocyte)에 RA를 투여했을 때 세포 성장을 억제하는 효과가 있는 것으로 알려진 transforming growth factor-β(TGF-β)가 유도되며, TGF-β에 대한 항체를 이용하여 RA 투여에 의한 세포 성장 억제 효과의 30% 정도는 TGF-β에 의해서 매개된다고 하였다. 또 다른 이유로는 RA 투여 기간이 시험관 내에서는 6일인 반면 생체 내에서는 30일로 차이가 있다는 점, 생체 내와 시험관 내의 RA 투여 용량이 다르다는 점 등을 생각해 볼 수 있다. 이번 연구의 결과는 생체 내에서 RA에 의한 종양 성장의 억제는 G1기 정지에 의해 나타나며 AMC-HN-4 세포주와 달리 AMC-HN-6 세포주에서는 P450이 유도되어 RA의 이화작용이 일어나 RA의 효과를 감소시킨다는 사실을 시사한다. 결론 결론적으로 RA에 의한 두경부 편평세포암종 세포주의 성장 억제는 G1기 정지에 의해 발생하는 것으로 추정할 수 있다. RA에 의한 G1기 정지가 실험관 내 실험보다는 생체 내 실험에서 뚜렷이 나타나는 실험 결과는 생체 내 실험에서 시험관 내 실험보다 RA를 오랫동안 처치한 결과일 수 있다. 또한 RA는 생체 내에서 cytokine 등 많은 물질을 발생시키므로 RA의 작용이 생체 내에서는 복합적으로 작용할 수 있음을 시사하며 RA에 의한 생체 내 G1기의 정지도 RA 자체에 의한 직접적인 효과보다는 RA와 다른 물질의 상승작용일 가능성이 높다고 생각된다. 본 실험의 결과를 확인하기 위해서는 향후 세포 주기에 작용하는 여러 단백질 및 그 mRNA에 미치는 RA의 영향, 세포자사의 유도 여부 등을 살펴봄으로서, RA가 두경부 편평세포암종의 성장 억제에 미치는 영향에 대한 더 자세한 연구가 필요하리라 생각된다.
REFERENCES
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