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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(7): 811-815. |
| Distribution of Lysozyme- and Lactoferrin-Secreting Cells in Eustachian Tube of Normal BALB/c Mouse. |
| Kee Hyun Park, Hong Joon park, Yun Hoon Choung, Jung Whan Song |
| Department of Otolaryngology, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea. parkkh@madang.ajou.ac.kr |
| Mouse 이관에서 라이소자임과 락토페린 분비세포의 정상분포 |
| 박기현 · 박홍준 · 정연훈 · 송정환 |
| 아주대학교 의과대학 이비인후과학교실 |
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| 주제어:
Mouseㆍ라이소자임ㆍ락토페린ㆍ이관. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Mucosal surfaces in the middle ear and eustachian tube are protected by several complex defense mechanisms, namely mucociliary clearance, immunoglobulins, cellular components, and antibacterial secretory enzymes. The secretory enzymes such as lysozyme and lactoferrin are found in various mucosal tissues and most of body secretions which cover the human mucosal surfaces. Because of their bactericidal activity, it has been suggested that these enzymes contribute to the defense against local mucosal infections. It has been known that lysozyme- and lactoferrin-secreting cells in tubotympanum were various in species such as human, chinchilla, guinea pig and Mongolian gerbil. The purpose of this study is to identify and localize the lysozyme- and lactoferrin-secreting cells in the eustachian tube of normal mice using histochemical and immunohistochemical techniques.
MATERIALS AND METHODS:
Normal mice (BALB/c, 60-120 days old, 10 heads) were used for staining of tubotympanum with hematoxylin-eosin stain, Alcian blue-periodic acid-Schiff (AB-PAS) stain and immunohistochemical stain (antihuman lysozyme, and antihuman lactoferrin antibodies).
RESULTS:
1) Secretory cells in the epithelium and subepithelial glands are observed more in the pharyngeal portion than in the tympanic portion of eustachian tube.
Subepithelial glands are also noted more in lower part than in upper part of eustachian tube. 2) Lysozyme was observed in the secreting cells of mucosal epithelium and the serous cells of subepithelial glands. 3) Lactoferrin was observed in the serous cells of subepithelial glands, but not in the epithelium.
CONCLUSION:
In the eustachian tube of BALB/c mouse, lysozyme and lactoferrin were detected in the serous cells in subepithelial glands and only lysozyme is observed in the secretory cells in the eustachian tube epithelium. |
| Keywords:
MouseㆍLysozymeㆍLactoferrinㆍEustachian tube |
서론
라이소자임(lysozyme)과 락토페린(lactoferrin)은 살균효과를 갖는 효소로서 점막의 국소감염에 대한 방어작용에 기여한다고 알려져 있다.1)2) 이러한 효소분비기능은 중이와 이관에서 점막섬모작용, 면역작용과 더불어 중요한 방어기전의 하나로 되어 있다.
라이소자임과 락토페린은 인체의 여러 점막조직과 점막조직에서 분비되는 분비액에서 발견된다. 눈물,3) 기관지,4) 침샘,5) 위점막6) 등에 두 효소가 모두 분포하고 있고, 비점막,7) 소장점막,8) 자궁경부내막9) 등에는 라이소자임만이 분포하고 있다. 아울러 각 동물에 따라 그 분포 형태와 분비세포가 다른 것으로 되어있다. 지금까지의 이관에 대한 라이소자임과 락토페린에 관한 연구는 주로 사람,10) chinchilla,11) guinea pig,12) Mongolian gerbil13) 등에서 이루어져 왔으나, 비교적 중이 및 이관 연구에 많이 사용되고 있으며 우리가 쉽게 구할 수 있는 mouse에 대한 연구보고는 없는 것으로 알려져 있다. Mouse는 임신기간이 짧고(3주), 성장이 빠르며 쉽게 사육할 수 있는 설치류이다. Mouse 중이에 해당하는 bulla는 해부학적으로 두개골 후외측에 존재하여 그 접근이 용이하고, bulla 내의 와우와 청신경 및 내이 구조물까지 접근도 아주 용이하여 해부학적 또는 신경생리학적 실험에 아주 유용한 동물이다. 특히 중이와 이관 전장을 한 표본으로 쉽게 얻을 수 있으므로 중이실험에 적합한 실험동물이라 할 수 있다.
본 연구는 이러한 mouse 이관의 라이소자임과 락토페린 분비세포의 존재 및 분포를 면역조직화학적 방법을 통하여 관찰함으로써, 중이 및 이관 연구실험으로 많이 사용하는 mouse를 대상으로 하는 동물실험에 형태학적 기초 자료를 제공하는데 그 목적이 있다.
재료 및 방법
재료
생후 60일에서 120일 되는 건강한 BALB/c mouse 10마리를 대상으로 하였으며, 특히 중이염증이 없는 것을 확인하였다.
방법
Mouse를 에테르로 적신 솜으로 흡입마취 시킨 후, 흉부를 절개하여 심장을 노출시키고 좌심실에 카데터를 삽입하여 생리 식염수 30cc를 관류한 후, 10% 중성 포르말린을 관류 시켜 고정(perfusion fixation)을 시행하였다. 머리부위를 절단한 후 하악을 떼어내고, 구개천정부위를 정중절개하여 이관의 전장부를 박리 하였다. 이 표본을 10% 중성 포르말린액에 48시간 고정한 후, 10% EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid in 0.1 M Tris buffer, pH6.95)액에 2주간 담그어 두어 탈석회화 시켰다. 0.1M phosphate buffer액(이하 PBS)으로 세척한 후 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올의 순서로 약 10분간 씩 담그어 탈수시키고, xylene 액에 3분간 담근 후 파라핀에 포매시켰다. 이를 약 12시간 냉동 보관한 뒤 3 μm 간격으로 세절한 후 hematoxylin-eosin 염색을 시행하였다. 그리고 점액분비세포와 장액분비세포를 구분하기 위해 alcian blue 및 periodic acid-Schiff(pH2.5)를 이용한 조직화학적 염색을 시행하였다. 또 다른 인접절편을 이용하여 일차항체로 라이소자임 항체(rabbit antihuman lysozyme；DAKO, Denmark, lot. #048) 및 락토페린 항체(rabbit antihuman lactoferrin; DAKO, Denmark, lot. #089)를 사용한 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 방법은 3 μm 길이로 세절한 조직표본을 Probeon (r) 슬라이드에 얹고, xylene용액에 약 5분간 3차례 담가두어 탈파라핀시킨 후 100%, 90%, 80%, 70% 알코올 용액에 5분간씩 담그어 수화시켰다. 이 조직들을 microprobe Ⅲ kit의 plate에 준비된 내인성 peroxidase 억제제에 반응시킨 후 2분간 40℃에 처치하고 PBS에 한차례 세척 한 다음 microprobe plate에서 일차항체로 라이소자임(농도 1：50) 및 락토페린 항체(농도 1：100)에 반응시켜 9분간 40℃에서 처치하였다. 이를 한차례에 걸쳐 상온의 PBS에 세척하였다. 이 조직을 microprobe plate에서 이차항체(biotinylated goat anti-rabbit antibodies)와 반응시켜 40℃에서 4분간 처치한 후 한차례에 걸쳐 PBS에 세척하였다. 다음으로 이 조직을 microprobe plate에서 peroxidase reagent와 반응시켜 40℃에서 4분간 처치한 후 한차례에 걸쳐 PBS에 세척하였다. 이를 enhancer reagent에 한차례 세척후 aminoethylcarbazole 성분의 발색제에 10분간 반응시킨 후 증류수에 세척하고 라이소자임의 발색도를 현미경으로 관찰한 후 갈색으로 반응하는 정도에 따라 발색제에 추가반응 여부를 결정하였다. 충분히 발색된 조직을 hematoxylin 액에 10초간 담그어 대조 염색한 후 다시 세척하고 이를 crystal mount로 덮어 잘 말린 후 관찰하였다. 양성대조군으로 mouse의 기관점막에 일차항체(rabbit antihuman lysozyme, rabbit antihuman lactoferrin)를 가한 반응과 음성대조군으로 조직에 일차항체 대신에 정상 goat serum을 가한 것을 참고하였다.
결과
면역조직화학적 염색에 양성을 보이는 세포들은 세포내 함유된 라이소자임과 락토페린의 효소 농도 및 사용된 항체의 역가에 따라 연한 갈색 또는 진한 갈색으로 염색되었다.
이관점막의 상피세포 및 상피하분비선
Mouse 이관점막은 위중층섬모입방상피(pseudostratified ciliated columnar epithelium)의 전형적인 호흡기 상피세포로 이루어져 있으며, 상피하분비선(subepithelial gland)의 분포는 중이개구부 부위보다 인두개구부 부위에 더 많았고, 이관의 상부보다 하부에서 많이 관찰되었다(Fig. 1A and B).
이관에서 라이소자임의 분포
라이소자임은 주로 인두개구부 상피에서 잘 염색되었다. 이는 인접부위를 AB-PAS 염색하여 주로 심홍색으로 염색된 부위 및 염색되지 않은 부위와 일치하였다. 또한 상피하분비선에서도 잘 염색되었는데 AB-PAS의 청색 또는 보라색으로 염색된 점액성부위보다 심홍색으로 염색된 장액성 분비세포에 뚜렷이 염색되었다(Fig. 2A and B).
이관에서 락토페린의 분포
락토페린은 이관점막의 상피세포에서는 거의 염색되지 않았고, 상피하분비선에서 관찰되었다. 특히 AB-PAS 염색시 분비선 주위로 주로 염색되는 심홍색의 장액성 분비세포 부위에서 발현이 관찰되었다(Fig. 2A and C).
고찰
점막은 다양한 방어기전을 갖는 것으로 알려져 있다；1) 점막섬모 운동에 의한 기계적인 방어작용,2) immunoglobulin A와 같은 항체 단백질에 의한 면역 방어작용,14)3) 염증세포의 식균작용,4) 라이소자임, 락토페린 등과 같은 항세균 분비효소에 의한 생물학적인 방어작용이 있다.10)12) 기관지점막, 자궁경부내막, 비점막, 이관, 중이점막 등은 이러한 방어기전이 복합적으로 작용하면서 세균침입 등에 대처하고 있는 것이다. 특히 만성중이염 환자에서 중이저류액 내의 라이소자임과 락토페린의 농도가 높다는 보고는 잘 알려진 바이다.14) 이는 중이 및 이관의 상피세포와 중이 내 염증세포인 다형핵백혈구와 식균세포에서의 분비 증가에 의한 것으로 알려져 있다. 한편 Giebink 등은 라이소자임은 주로 다형핵백혈구와 상피세포에서, 락토페린은 다형핵백혈구에서 분비된다고 보고한 바 있다.15)
라이소자임은 박테리아의 세포벽의 proteoglycans에 일반적으로 존재하는 N-acetyl muramic acid와 N-acetyl glucosamine 사이의 결합을 분해하는 효소이다.4) 락토페린은 철결합 당단백질(iron-binding glycoprotein)로서 박테리아 성장에 필수적인 철성분과 결합하여 박테리아 성장을 저해하는 것으로 되어 있다.1) 그 외에 락토페린은 다형핵백혈구가 내피세포(endothelium)에 부착하는 것을 촉진시키며, 염증반응을 최대화하기 위하여 다형핵백혈구를 염증부위에 유지시켜 주는 역할을 한다.16) 아울러 사람의 눈물에서 추출된 락토페린은 classical C3 convertase 형성을 억제함으로써 보체체계(complement system)의 활성을 조절하여 항염증 기능을 갖고 있다는 보고도 있다.3) 하지만 중이점막의 방어기전으로서 효소단백의 생물학적 중요성은 아직 완전히 밝혀지지 않았다.
라이소자임과 락토페린은 동물에 따라 각각 그 분비세포가 다른 것으로 되어 있다. Chinchilla의 경우 라이소자임은 이관점막의 상피 배세포(epithelial goblet cells)와 상피하분비선의 점액성 분비세포에서 관찰되고, 락토페린은 주로 상피하분비선의 장액성 분비세포에서 분비되었다.11) Guinea pig의 경우에는 라이소자임은 이관점막의 상피세포와 상피하분비선의 장액성 분비세포에서, 락토페린은 상피하분비선의 장액성 분비세포에서 관찰되었다고 보고되었다.12) Mongolian gerbil의 경우에는 이관점막의 분비세포 및 상피하분비선의 장액성 세포에서 라이소자임이 분비된다고 하였다.13) 이처럼 각 실험동물에 따라 점액성 또는 장액성으로 그 분비세포가 다른 것은 종특이성(species difference)에 의한 것으로 여겨진다. 본 실험에서도 라이소자임의 경우 이관점막에 존재함을 알 수 있었고, 특히 인두개구부 부위의 상피세포에 주로 염색되었다. 아울러 상피하분비선에서도 잘 염색되었는데 AB-PAS 염색상 심홍색으로 염색되는 부위(중성점액성분) 또는 염색이 되지 않는 부위-장액성 분비세포의 존재부위-에서 관찰되었다. 이는 사람의 비점막 7)과 기관지점막 분비선4)의 장액성 분비세포에서 라이소자임이 발견되는 결과와 일치하지만, 사람 중이점막의 경우 점액성 분비세포에서 분비되는 것과는 차이가 있다.10)14) 락토페린은 이관점막의 상피세포에서는 거의 염색이 되지 않았고, 상피하분비선에서는 라이소자임과 같이 AB-PAS 염색상 심홍색 부위와 염색되지 않은 부위에서 관찰되었다. 따라서 동물에 따라 약간의 차이는 있지만 라이소자임은 이관점막의 상피세포에서 항상 발견할 수 있고 상피하분비선의 점액성 또는 장액성 분비세포에서 다양하게 생성되는 특징이 있으며, 락토페린은 이관점막의 상피세포에서는 거의 염색이 되지 않고 상피하분비선의 장액성 분비세포에 주로 염색이 되는 특징을 갖고 있는 것으로 사료된다.
본 실험에서 상피하분비선이 중이개구부보다 인두개구부 부위에 더 많이 분포하고 있고, 아울러 라이소자임과 락토페린에 염색되는 상피 및 상피하분비선의 분비세포도 인두개구부 부위가 더 많은 것으로 관찰되었다. 중이점막에 대한 관찰을 본 실험에서는 생략하였지만, Hanamure 등11)에 의하면 항세균 물질을 분비하는 분비세포는 중이점막보다 이관점막에 더 많은 것으로 보고되고 있다. 따라서 라이소자임과 락토페린이 주로 이관의 인두개구부에 위치함을 알 수 있다. 이는 이관이 중이에 대한 박테리아 등의 외부물질의 주 침입로 임을 감안할 때 감염방지에 대한 합리적인 배열이라 여겨진다. 아울러 실제 중이 감염시에는 두 효소의 분비가 증가함으로써 감염방지에 효과적임을 알 수 있다.14)
결론
조직화학적(AB-PAS) 그리고 면역조직화학적(antihuman lysozyme, antihuman lactoferrin) 염색을 통해 mouse 이관 점막의 상피내 분비세포와 상피하분비선이 중이개구부 부위보다 인두개구부 부위에 더 많이 분포하고 있으며, 상피하분비선은 이관상부보다는 하부에 많이 분포하고 있음을 관찰 하였다. 라이소자임은 이관점막의 상피세포에서 염색되었고, 상피하분비선의 장액성 분비세포에서도 관찰되었다. 락토페린은 이관점막의 상피세포에는 거의 염색되지 않았고, 상피하분비선의 장액성 분비세포에서 관찰되었다. 이러한 mouse 이관에서의 라이소자임과 락토페린의 분포양상은 종특이성의 하나로써, 중이 및 이관의 항세균 방어작용에 기여한다고 할 수 있고, 중이 및 이관 연구의 실험동물로 mouse를 사용하는데 있어 기초자료로 활용될 수 있으리라 보인다.
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