교신저자：강성호, 380-704 충북 충주시 교현동 620-5  건국대학교 의과대학 충주병원 이비인후과학교실
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서     론

   기도 점막은 항상 대기중의 여러 세균이나 오염물질 등에 노출되어 있음으로 점막섬모 운동에 의한 기계적 방어 작용, 면역글로블린 A와 같은 항체 단백질에 대한 면역 방어 작용, 염증세포의 식균작용, 라이소자임, 락토페린 등과 같은 항세균 분비효소에 의한 생물학적인 방어 작용 등 점막의 국소 감염에 대한 다양한 방어 기전을 가지고 있는 것으로 알려지고 있다.¹⁾
   기관에서의 정화작용은 주로 섬모운동에 의해 이루어진다고 알려졌으며 선천면역(innate immunity)의 중요 구성 요소인 라이소자임이 기관에서 발견되었다고 보고 되고 있다.²⁾³⁾⁴⁾
   라이소자임의 분포를 확인하는 방법으로는 라이소자임에 의해 잘 살균되는 것으로 알려진 Micrococcus lysodeikticus을 부착시킴 후 살균을 확인하는 법과 chitin(poly-N-acetylglucosamine)을 부착시킴 후 Alcian Blue 염색으로 라이소자임의 chitinase효과를 확인하는 법, 염기 단백질을 염색시키는 Biebrich scarlet 염색으로 chitin hydrolysate에 의한 라이소자임 억제를 확인하는 법, 라이소자임에 대한 형광항체를 사용하는 면역형광법등이 있으나 최근에는 immunoglobulin peroxidase bridge technique을 이용한 면역염색이 많이 사용되고 있다.³⁾⁵⁾ 
   본 연구에서는 백서의 기관에서의 라이소자임 mRNA의 발현과 분포를 Reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR)과 면역조직화학적 분석을 통해 관찰하고 Western blot을 사용하여 라이소자임의 발현을 확인하고자 한다.

재료 및 방법

조직채취
   체중이 200내지 300 g 정도 되는 Wistar-Kyoto계의 백서 15마리를 ketamine과 xylozine을 복강내로 주사하여 마취시킨 후 기관과 폐의 조직을 채취하여 RT-PCR, immunohistochemistry, western blot 실험에 각각 5마리씩을 사용하였다. RT-PCR, Western blot 실험은 한 마리당 추출 할 수 있는 검체양이 적어 이를 모아서 실험에 사용하였다.

RT-PCR
   세포내의 RNA는 TRIzol(Life Techlologies, USA)을 이용한 acid guanidine thyocyanate-phenol-chloriform 추출방법으로 분리하고 superScript II(Lifetechnologoes, USA)를 사용하여 complementary DNA(cDNA)를 역전사하였다.
   PCR은 MJ PTC-200 Pelter cycler 내에서 각각 95℃에서 15분간, 94℃에서 30초간 35회, 60℃에서 30초간, 그리고 72℃에서 1분간 시행하였다.
   사용한 시동체(primer)의 순서(sequence)는 rat lysozyme forward, GGTGTAATGACGGCAAAACC, reverse, AGACTCCGCAGTTCCGAATA 이였다. House keeping gene으로는 rat 18S-rRNA을 사용하였으며 forward, GTGGAGCGATTTGTCTGGTT, reverse, CGCTGAGCCAGTCAGTGTAG 이였다. PCR 산물은 1.5% 우무겔(agarose gel)을 이용해 분리하였고 ethidium bromide를 이용하여 염색한 후 촬영하였다.

Immunohistochemistry
   조직을 심관류법으로 고정시킨후 4℃하에서 다시 24시간을 재고정하였고, 4% paraformaldehyde(pH7.4)가 함유된 7% EDTA 용액에 담그고, 5일간 매 시간마다 신선한 용액으로 바꾸어가면서 하루에 5시간씩 microwave로 처리하여 탈석회화(decalcification) 하였다. 그 후 조직을 파라핀 속에 고정하여 6 μm간격으로 박편하여 파라핀을 제거 과정을 거친 후 항원복구(antigen retrieval)는 37℃에서 10분간 citrate buffer에서 시행하였다. 내인성 과산화효소(peroxidase)의 활동을 막기 위해 각 절편은 상온에서 1% H2O2용액에서 30분간 처리하였다. 이것을 다시 PBS로 세척하고 라이소자임에 대한 일차항체로 37℃에서 rabbit polyclonal anti-human lysozyme antibody(1：1000；DAKO, Carpinteria, CA)을 20분간 전처리한 후 4℃에서 10시간동안 처리하였다. 그 후 PBS로 다시 세척하고 상온에서 30분간 EnVision+(Dako, Carpinteria, CA, USA)의 이차항체와 ABC 처리 후 0.05% 3,3 P-diaminobenzidine으로 발색하고 Mayer's hematoxylin으로 대조염색한 후 관찰하였다. 이 실험에서는 각각의 장기에서 적어도 3개 이상의 표본을 채취하여 처리하였고, 음성 대조군으로 일차항체 대신 rabbit preimmune serum을 사용하였다.

Western blot
   조직을 완충용액(Cell Signaling Technology, Beverly, MA)으로 처리하고 전기 조직 분쇄기(electrical homogenizer)를 이용하여 조직을 분쇄한 후 Beckman J6-MI 원심분리기를 이용하여 4℃에서 30분간 4,000×g의 속도로 처리하였다. 상층액을 4℃에서 1시간동안 20,000×g의 속도로 원심분리한 후 다시 상층액만을 수집하여 단백질 농도를 Non-interfering Protein Assay kit(Bio-Rad, Hercu×les, CA)를 이용하여 측정하였다. 모든 세포막 단백질(20 ug/each lane)들을 Tricine sample buffer(200 mM Tris-HCl, pH 6.8, 40% glycerol, 2% SDS, 0.04% Coomassie Bleu G-250)에 용해시키고 5분간 열처리한 후 10% tricine gel(2.6% Bis-Acrylamide, pH8.3, Invitrogen)을 사용한 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(Miniprorean II apparatus；Biorad, Herculus, CA)를 하였다. 미리 냉장실에 보관하여 차게 만든 전기이동 완충액을 붓고 80 volts로 2시간동안 단백질을 polyvinylidene difuloride(PVDF) membrane(0.2 μm, Bio-Rad)에 이동 시킨 후 상온에서 1×Tris-buffered saline과 0.05% Tween20의 5% skin milk로 blocking 하였다. 이 후 상온에서 라이소자임에 대한 다클론 항체(DAKO, Carpinteria, CA)를 첨가하여 하룻밤을 두었고 TBST(50 mM Tris-HCl[pH 7.4], 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)과 0.5%의 차단액(blocking solution)으로 세척한 후 50 mU/ml anti-rabbit IgG horseradish peroxidase(HRP)-linked secondary antibody와 biotinlyated protein marker(Cell Signaling, USA)를 첨가하여 상온에서 1시간동안 배양(incubation)시킨 후 TBST로 4회 세척하였고 enhanced chemiluminescence(SuperSignal, Pierce)와 다양한 film exposure(Hyperfilm, Amersham Pharmacia biotech, England)를 사용하여 관찰하였다.

결     과

라이소자임 mRNA의 발현을 관찰하기 위한 RT-PCR
   RT-PCR을 이용하여 기관과 폐에서의 라이소자임 mRNA의 발현을 관찰하였다. 기관에서의 라이소자임 mRNA는 폐에 비해 약하게 발현되었다(Fig. 1).

라이소자임의 분포를 관찰하기 위한 면역조직화학적 분석
   5마리 중 4마리에서 상피세포와 점막하 장액선조직에서 면역조직화학적 염색에 양성을 보이는 세포들이 관찰되었다(Fig. 2).

라이소자임의 발현을 확인하기 위한 Western blot
   기관에서 검출된 라이소자임 단백질이 폐에서 검출된 것과 같이 14 KDa의 분자량으로 명확하게 관찰되었다(Fig. 3).

고     찰

   1992년 Alexander Fleming은 자신의 비점액에서 특정 세균들을 살균 할 수 있는 물질을 발견하여 효소라는 것을 밝혀 내고 라이소자임이라 명명하였으며 자연계에 널리 분포하고 있음을 보고 하였다.⁶⁾ 라이소자임의 살균능력에 Fleming은 고무되어 있었으나 항생제의 발견으로 인해 라이소자임의 의미는 많이 퇴색되었다. 그러나 1960년 Jolles 등이 닭의 알에서 라이소자임을 분리하여 분자량이 14500의 비교적 저분자량의 물질이라는 것을 밝혀 내었으며 1963년 Jolles와 Canfiel가 각각 라이소자임의 구조가 129개의 아미노산으로 구성된 단사슬(single chain)이라는 것을 보고하며 그 연구가 활발해지고 있다.⁷⁾
   라이소자임의 살균 기전은 세균의 세포벽의 proteoglycans에 일반적으로 존재하는 N-acetyl muramic acid와 N-acetyl glucosamine 사이의 결합을 분해하여 균을 죽이게 되는데 점막 표면과 흉막액, 백혈구에서 중요한 방어 기전 요소로 알려지고 있다.⁸⁾⁹⁾ 또한 라이소자임과 같은 cationic antimicrobial protein을 억제시 기도 표피에서의 감염을 호발 시킨다는 최근의 보고는 점막표면에서의 방어기전으로서 라이소자임의 중요성을 강조하고 있다.¹⁰⁾ 저자들은 본 실험을 통해 라이소자임이 기관조직의 세포에 분포하고 유전자가 발현한다는 것을 확인하였는데, 이 결과들은 기관에서 역시 선천면역이 중요한 방어기전이라는 것을 알려준다. 특히 어떤 이유로든 점막섬모운동이 약해지는 경우 라이소자임 등의 선천면역의 역할이 더 커질 것이라 사료되며 이에 대한 연구를 더 진행할 예정이다.
   기관에서의 라이소자임의 분비세포는 동물마다 약간의 차이를 보이고 있어 면역조직검사상에서 백서(rat)에서는 점막하의 장액선과 섬모표피상피에서 발견되지만 hamster나 guinea pig, ferret 등에서는 점막하 장액선에서만 발견되며 섬모표피상피에서는 발견되지 않았다.³⁾¹¹⁾ 본 실험에서도 백서에서 관찰 했던 앞의 결과와 동일하게 상피세포와 점막하 장액선에서 라이소자임이 분포함을 확인 할 수 있었다. 인간의 표본에서는 Klockar와 Reitamo,⁵⁾ Mason과 Taylor,¹²⁾ Bowes와 Corrin¹³⁾가 각각 면역세포화학검사를 통해 점막하 장액선이 유일한 라이소자임 분비세포로 밝혔으나 Konstan 등¹⁴⁾은 생화학적으로 점막 상피에서 라이소자임을 증명하였다.
   라이소자임은 점막하선조직에서 장액선에서만 나타나지 점액선에서는 나타나지 않는 선택성을 보이는데 Dohrman 등은 인간의 기관지에서 이러한 선택성이 mRNA의 수준에서 조절됨을 밝혀 내었다.¹⁵⁾
   라이소자임의 분비는 아드레날린성, 콜린성 약물에 영향을 받아 bethanechol, phenylephrine, terbutalin에 의해 증가되고, atropin, propranolol, phentolamine은 위의 약제의 효과를 차단시키는 것으로 보고 되었다.¹¹⁾ 또한 substance P는 점막하선조직에 직접 작용하거나 중추신경계의 분비운동 신경을 자극하여 간접적으로 라이소자임의 분비를 촉진시킨다고 알려졌다.¹⁶⁾

결     론

   백서의 기관에서 RT-PCR, 면역조직학적 염색을 통해 라이소자임의 mRNA의 발현과 상피세포와 점막하 장액선조직에 분포함를 관찰하였으며 western blot을 통해 라이소자임 단백질을 확인할 수 있었다. 이 결과들은 기관에서의 방어기전이 점막섬모운동 뿐만이 아니라 라이소자임과 같은 선천면역 분자들에 의한 선천면역도 중요한 역할을 하는 것임을 시사한다고 볼 수 있다. 이라 사료되며 이에 대한 연구를 더 진행할 예정이다.

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