| Expression of Mutant p53 in Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck. |
| Hee Young Kim, Yong Rho Lee, Chun Gil Kim, Hoon Shik Yang, Jae Hyung Yoo |
1Department of Otolaryngology, Chung Goo Sung Sim Hospital, Seoul, Department of Otolaryngology, College of Medicine, Chung Ang University, Seoul, Korea.
2Department of Pathology, College of Medicine, Chung Ang University, Seoul, Korea. |
| 두경부 표피암종에서의 변이형 p53 발현 |
| 김희영1 · 이용로1 · 김춘길1 · 양훈식1 · 유재형2 |
| 청구성심병원 이비인후과, 중앙대학교 의과대학 이비인후과학교실1;중앙대학교 의과대학 병리학교실2; |
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| ABSTRACT |
BACKGROUND:
Expression of mutant p53 has been observed in a variety of human cancers, including head and neck squamous cell carcinoma and carcinoma of breast, colon, esophagus, lung, stomach, liver, thyroid, etc.
OBJECTIVES:
To establish expression frequency of p53 and correlation between p53 expression and clinicopathologic data in squamous cell carcinoma of head and neck.
MATERIALS AND METHODS:
Fresh tissue samples were obtained from 66 patients with squamous cell carcinoma of head and neck undergoing biopsy or surgery. Expression of mutant p53 was evaluated by immunohistochemical staining with anti-p53 monoclonal antibody in 66 paraffin-embedded tissues of squamous cell carcinoma in head and neck. The studies consisted of 13 cases of oral carcinoma including tongue, 10 cases of pharyngeal carcinoma and 43 cases of laryngeal carcinoma.
RESULTS:
1) The frequency of p53 expression in squamous cell carcinoma of head and neck was 48.5%((31/66). 2) The frequency of p53 expression by tumor site was 42.6%(6/13) in oral cavity, 60%(6/10) in pharynx and 44.2%(19/43) in larynx. 3) A positive relationship was seen between p53 expression and lymphnode metastasis, representing 69.2% p53 expression in metastasis group and 16.7% p53 in non-metastasis group.
CONCLUSION:
Author was suggested that p53 expression in squamous cell carcinoma of head and neck was related to tumor progression and metastasis. |
| Keywords:
Head and neckㆍSquamous cell carcinomaㆍMutant p53 expression |
서론
정상세포와 암세포의 결정적인 차이점은 세포의 증식과 조직의 항상성을 조절하는 유전자의 변화에 의한다는 것이 분자생물학의 발달로 점차 밝혀지고 있다.1)2) 즉 정상세포가 여러가지 환경적 요인에 의해 정상세포가 비정상적인 자극을 받아 암세포로 형질변형이 되기까지는 다단계 암발생과정(multistep carcinogenesis)을 거치게 되는데, 이 과정중에는 지금까지 알려진 100여종의 여러 종양유전자들이 상호관련성을 가지고 각 단계에 영향을 미친다는 것이 밝혀지고 있다.3)4) 이러한 유전자는 종양유전자(oncogene)와 항종양유전자(anti-oncogene)로 크게 분류할 수 있다. 항종양유전자중 대표적인 유전자가 p53이다.
p53은 tumor suppressor gene으로 알려져 있으며 야생형(wild type)과 변이형(mutant type)이 있는데 야생형의 p53은 17번 염색체의 단완에 위치하여 세포의 apoptosis를 유발하는 기전으로 정상세포의 발육과 분화에 관여하지만5)6), 여러가지 환경적인 요인에 의해 전환된 변이형 p53은 대부분의 인체암에서 과발현되므로 이 유전자의 이상은 인체암의 발생기전, 진단, 예후, 치료및 치료효과의 평가에 응용되고 있다.7)8) 그러므로 p53유전자의 발현도를 연구하는 것은 암환자에 있어서 중요한 의미가 있다고 하겠다. 그러나 야생형의 p53은 그 양이 매우 적고 반감기가 상당히 짧아 암조직에서 발현도를 관찰하기 어려운 점이 있지만9), 변이형의 p53이 되면 반감기가 길어지고 암을 억제하는 기능이 소실되며 각종 암에서 과발현되므로 악성종양의 발생과 진행에 관여하고 있을 것이라는 추정하에 많은 연구가 되고있다.10)11)12) 여러가지 악성종양중 유선암13), 대장암종14), 식도암종15)에서는 p53양성군이 음성군보다 예후가 불량한 것으로 알려져 있으며, 위암종16), 폐암종17), 전립선암종18), 갑상선암19), 흑색종20)등에서도 p53의 발현도는 종양의 악성도, 임파절전이. 원격전이등의 중요한 예후인자와 밀접한 연관성이 있다고 발표되고 있다.
본 연구에 이용될 두경부의 표피세포암종은 전 세계의 발병암중 6번째로 빈발하는 암종21)으로 알려져 있으며 흡연등 다양한 공해문제로 증가일로에 있는 종양으로 19∼43% 정도에서 p53유전자가 발현되는 것으로 알려져 있는데22), p53의 과발현의 임상적 의의에 대해서는 아직 확립되어 있지 않다.
이러한 점에 착안하여 한국인에 발생한 두경부의 여러 곳에 발생한 표피상피암종에서 p53의 발현도의 비교, 그리고 임상 및 병리학적 소견과 p53발현의 상관성을 알아보고자 본 연구를 시행하였다.
연구재료및 방법
1. 연구재료
중앙대학교 의과대학 부속병원에서 생검이나 근치수술을 시행하여 확진된 두경부 표피상피암종 66례를 대상으로 면역조직화학적 방법을 시행하여 변이형 p53유전자의 발현을 관찰하였다. 두경부 표피세포암종을 부위별로 분석한 결과, 구강에 발생한 예가 13례, 인두에 발생한 것이 10례, 그리고 후두에 발생한 것이 43례이었다(Table 1).
2. 연구방법
파라핀포매된 조직절편을 항온기(58∼60℃)에서 30분간 가온 후 실온에서 탈파라핀화와 탈수를 시킨 후 조직의 내인성 과산화수소의 활성을 억제하기위해 3%과산화수소를 사용하여 20분간 처리한 후 tris-buffered saline(TBS, 0.05M, pH 7.6)에서 5분간 3회 세척하였다.
그 다음에 조직절편을 citrate buffer(0.01M, pH6.0)에 옮긴 후 10분간 microwave처리후 10분간 실온에 노출시키는 과정을 2회 반복하였다. TBS로 5분간 3회 세척후 비특이적 항체의 결합을 억제하기 위해 protein bolcking agent(Zymed Co)를 가한 후 실온에서 1시간동안 반응시켰다.
일차항체인 항인체 p53 단크론항체(Zymed Co)를 1：50으로 회석하여 가한후 wet chamber에서 12시간동안 반응시키고 다시 TBS에 5분간 3회씩 세척하였다. 그 후 2차 항체인 항가토 IgG 항체(Zymed Co)에 30분간 반응시키고 TBS에 씻은 다음 peroxidase reagent(Zymed Co)를 가하여 30분간 처리후 TBS로 세척하고 AEC(3-amino-9-ethyl-carbazole in N, N-demethyl formide)를 가하여 발색되는 것을 확인 후, 증류수로 수세하고 glycerol gelatin으로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
3. 염색결과의 판정
항인체 p53항체를 이용하여 면역조직화학적 염색을 시행한 후 p53의 발현도는 핵이 갈색내지 연분홍색으로 발색되는 세포만 양성으로 처리하였으며, 염색정도의 판정은 암세포들중 양성반응을 보이는 세포들이 차지하는 범위에 대한 백분율이 10%이하인 경우에는(-), 10∼25% 양성을 보이면(＋), 25∼50% 양성을 보이면(＋＋), 50∼75% 양성을 보이면(＋＋＋), 그리고 75%이상일때는(＋＋＋＋)로 표기하여 양성범위를 구분하였다.
결과
1. 두경부 표피상피암종의 부위에 따른 p53발현도
두경부 표피세포암종에서 암의 부위별로 p53발현도를 관찰한 결과, 구강내에 발생한 혀, 연구개, 입의 저부에 발생한 암종 13례중 6례(46.2%)에서 양성반응이 관찰되었으며, 인두에 발생한 비인두, 구강인두. 하인두에 발생한 10례중에서는 6례(60%), 그리고 후두의 각 부위에 발생한 43례중 19례(44.2%)에서 양성반응이 관찰되었다(Table 2).
2. 임상및 병리학적자료와 p53발현의 관련성
본 연구에 사용된 두경부의 표피상피암종 66례중에서 임상및 병리학적 자료가 명확한 20례를 대상으로 p53의 양성도를 재 분석해 보았다(Table 3). 본 증례의 연령은 24세부터 69세까지 분포되어 있었으며, 평균연령은 54.5세였고, 남자가 18례, 여자가 2례였다.
근치수술을 시행하여 임상및 병리학적 자료를 명확히 알 수 있었던 20례중, 혀암이 2례, 구인두암이 1례, 비인두암이 1례, 하인두암이 1례, 후두암이 15례였으며, 본 연구에 사용된 암조직은 고분화 또는 중등도분화된 진행성 표피상피암종으로 분화도에 따른 p53양성도의 의미있는 차이점은 없었고, 암세포의 p53에 대한 양성세포의 출현도도 25%이하에서 75%이상까지 다양하게 관찰되었다(Table 3, Fig. 1, 2).
그러나 분화도에 관계없이 암종의 임파절 전이와 p53의 양성도를 비교관찰한 결과 암의 위치에 관계 없이 임파절전이가 발견된 13례중 9례(69.2%)에서 양성반응이 관찰되었고, 임파절전이가 없었던 6례중에서는 1례(16.7%)에서만 양성반응이 나타난 점을 미루어 보아 두경부의 표피상피암종에서 p53의 발현은 암의 진행과 전이에 중요한 역할을 할 것으로 사료되었다.
고찰
분자생물학적 측면에서 암이 발생하게되는 기전은 크게 세가지 측면으로 분류하여 설명되어지고 있다.23)24) 첫째는 정상세포내에 존재하여 세포의 발육이나 성장에 관여하는 것으로 알려진 전암유전자(protooncogene)의 변화, 즉 증폭, 돌연변이 및 염색체의 치환등에 의한 전암유전자의 암유전자로의 전환에 의해 암이 발생하게 된다는 것이고, 둘째는 정상세포내에 세포의 성장과 분열을 억제조절하여 종양억제작용을 하는 암억제유전자의 변화, 즉 돌연변이나 염색체의 결손등에 의한 암억제유전자의 비활성화에 의해 암이 발생된다는 것, 세째는 활성화된 암유전자와 변이된 암억제유전자의 상호보완작용에 의해 암이 발생하게 된다는 것이다. 상기에 기술한 암의 발생과 관련이 있는 유전자중 종양억제유전자들에는 RB1(retinoblastoma, type 1), APC(adenomatosis polyposis coli), WT1(wilms tumor type 1), NF1(neurofibromatosis, type 1)등이 있으나 이들은 불과 몇가지 종양에 한정되어 나타나지만, p53은 인체암의 50%이상의 유형에서 발현되는 것으로 알려져 있으며25), 이 유전자의 이상에 대한 연구는 암의 발생기전과 진행과정을 규명하여 궁극적으로 암을 정복하는데 중요한 의미가 있다고 생각된다.
본 연구에 이용된 핵인단백의 일종인 p53은 처음에는 암유전자로만 알려졌으나 현재에는 두 유형으로 구분되는데, 야생형은 종양억제유전자로 작용하며 변이형은 암발생과정에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 야생형 p53의 기능에 대한 여러 연구자들의 연구결과에 의하면 세포주기의 DNA합성이 시작되기 전의 후기 G1 phase에 p53 mRNA와 단백이 증가하여 S phase로 들어가는 것을 억제함으로써 세포주기를 조절하는 것으로 알려져 있다.26)27) 이러한 p53억제유전자는 54kD의 핵인 단백질을 생성하여 인체 염색체의 17p의 부분적 손실이나 치환, 또는 유전자
의 재배열에 의해 종양억제유전자가 비활성화되며 또한 DNA를 손상시켜 악성세포의 clone을 선택적으로 복제시켜 이로 인해 악성종양이 유발되는 것으로 알려지고 있다.28) 야생형의 p53단백의 반감기는 6분으로 너무 짧아 암조직에서 면역조직화학적으로 증명되지 않으나, 변이형 p53은 아미노산을 대치시켜 p53분자의 형태를 변화시킴으로써 세포내 단백질의 안정성을 증가시켜 반감기가 길어져 종양조직을 이용한 면역조직화학적 기법에 의해 인체암의 50%에서 증명할 수 있으므로 암의 진단, 암의 진행과정추적, 치료방법 및 치료효과의 평가에 응용되어지고 있다.29)8) 인체의 대부분의 암에서 p53의 발현이 증명되었지만, p53의 발현빈도, 암의 발생및 진행과정에 미치는 영향과 임상및 병리학적 소견에 의거한 예후인자에 미치는 영향에 대해서는 연구결과가 다양하게 발표되고 있다. 두경부암종에 있어서 p53의 발현빈도는 부위에 따라 20∼80%까지 된다고 보고되고 있다.30)31)32) 본 연구증례에 있어서는 두경부 표피상피암 총66례중 31례(48.5%)에서 p53의 발현이 관찰되었으며, 부위별로 나누어 분석한 결과 구강내 암종에서는 13례중 6례(46.2%), 인두암종에서는 10례중 6례(60%), 후두암종에서는 43례중 19례(44.2%)에서 p53이 발현되어 다른 연구자들의 연구범위에 속하였다. 이렇게 연구자에 따라 다양한 양성율을 나타내는 이유는 연구재료의 처리상태, 사용한 일차항체의 종류, 시술한 염색방법의 다양성 및 연구재료의 수등의 차이때문이라고 생각되었다.
암의 발생과정에 있어서 종양유전자가 다양한 환경적 요인에 의해 암이 발생하려면 초기단계인 부동화(immortalization), 중기단계인 anchorage independence과정을 거쳐 말기에는 침윤및 전이 단계를 거치게 되는데 p53은 초기의 세포 부동화과정에 관여하는 것으로 알려지기 시작하였다.23)33) Sundaresan34)등과 Nuorva35)등의 연구결과에서도 p53유전자의 변이가 폐의 기관지상피에서는 나타나지 않지만 표피상피화생시에는 아주 낮지만 발견되며 이형성, 상피내암종에서 침윤성 폐암종이 될수록 발현도가 높아지는 것으로 보아 폐암의 다단계 발생과정에 있어서 초기단계에 관여하게 된다고 연구결과를 발표하였다.
이러한 연구결과 뿐만아니라 p53의 변이와 진행성 암병기는 서로 관련성이 있다는 것이 자궁내막암종36), 난소암37), 간세포암38), 전립선암39), 방광암40), 위암41), 흑색종42)등에서 연구되어졌으며, 연구자들은 p53이 암의 진행에 관여하는 것으로 주장하였다.
이 외에 p53의 정상기능이 변이에 의해 소실되면 aneuploidy의 증가및 세포의 증식능이 증가되어 암의 진행이 가속화되며 결국에는 환자의 예후가 불량해진다는 보고도 있다.38)43) 본 연구의 대상이 된 두경부암종에서도 p53발현에 대한 의의에 대해서 의견이 분분하여 종양의 분화도와는 관련성이 없으나 조직학적 grading과는 상관성이 있다는 보고32), 임상및 병리학적 예후인자와 관련성이 없다는 보고31), 심지어는 혀암에서는 p53과 발현시에는 예후가 좋다는 등의 연구결과들이 발표되어 있다. 그러나 Boyle등22)은 p53의 변이가 이형성과정에서도 나타나나 침윤성암종에서는 2∼3배이상 증가한다는 점을 미루어 보아 두경부암의 진행에 관여한다고 주장하였다. 여러 연구자들의 연구성적을 종합해 보면 p53의 발현은 암발생초기 및 진행과정에 관여한다고 생각하는 것이 타당할 것으로 사료된다.
본 연구에서 총 66례중 임상및 병리학적 자료가 명확한 20례를 대상으로 p53의 발현도와 관련성을 분석해 본 결과, 부위에 관계없이 임파절전이가 발견된 13례중 9례(69.2%)에서 양성반응이 관찰되었고, 임파절 전이가 없었던 6례중 1례(16.7%)에서 양성반응을 보였으며, 이 결과는 Boyle등22)의 결과와 일치하였으며, 이 의미는 p53의 과발현이 두경부암의 진행및 전이에도 관여한다는 사실을 암시하는 소견이라고 생각되었다. 뿐만아니라, 앞으로 좀 더 많은 연구재료를 수집하여 두경부 표피암종에서 p53이 발현되는 암에서 변이의 유형, 항암제나 방사선치료후 치료효과의 추적과 p53발현의 상관성등에 대해 좀 더 심도깊게 연구해 보고자 한다.
결론
두경부 표피암종 66례를 대상으로 p53발현도의 빈도, 그리고 임상및 병리학적 자료와 p53발현의 관련성을 알아보고자 면역조직화학적 염색을 시행하여 다음과 같은 성적을 얻었다.
1) 두경부의 표피상피암종 66례를 대상으로 면역조직화학적 방법을 이용하여 p53발현 빈도를 관찰한 결과 31례(48.5%)에서 양성반응이 관찰되었다.
2) 두경부암종의 부위별 관찰한 p53발현도는 구강암종에서는 46.2%(6/13), 인후암종에서는 60%(6/10), 그리고 후두암종에서는 44.2%(19/43)의 빈도를 나타내었다.
3) 암종의 분화도에 관계없이 암종의 임파절 전이와 p53양성도를 비교관찰한 결과 임파절 전이가 발견된 예에서는 69.2%(9/13), 전이가 없었던 예에서는 16.7%(1/6)에서 p53에 대한 양성반응이 관찰되었다. 이러한 성적을 미루어보아 p53발현도의 증가는 두경부표피암종의 진행에 관여할 것으로 사료되었다.
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