서     론

   비용은 이비인후과 영역에서 흔히 볼 수 있는 질환으로 사골동과 중비갑개 호흡기 점막의 염증 반응에 의해 발생된다. 그러나 이 질환의 발병기전에 대해서는 여러 가지 논란이 있으며 부비동염, 알레르기성 비염, 기관지 천식, 낭성섬유종 등의 만성 염증성 질환이 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾ 비용은 조직학적으로 호흡상피를 가지며 기질의 부종과 각종 염증세포의 침윤이 있다. 특히 호산구와 호염기구가 많이 증가하는데 이러한 소견들은 비용이 비강점막의 염증반응에 의해 형성된다는 것을 뒷받침한다.
   호산구는 알레르기성 비염, 기관지 천식 같은 알레르기성 질환과 기생충 감염시 증가되는 염증세포로 Eosinophil peroxidase(EPO), Major basic protein(MBP), Eosi-nophil cationic protein(ECP), eosinophil derived neurotoxin(EDN) 같은 단백물질을 분비하여 조직을 손상시키고 각종 사이토카인을 분비하여 국소 염증반응을 지속, 촉진 시켜준다.³⁾⁴⁾ 조직 호산구의 수가 증가하기 위해서는 혈중에 있는 호산구가 표적기관으로 많이 이동하거나 조직의 호산구 생존능력이 길어지는 경우 등으로 설명할 수 있을 것이다.
   Chemokine(chemoattractant cytokines)은 특정 부위에 백혈구를 동원시키는 화학주성과 백혈구를 활성화시키는 기능을 가진 물질로서 8 kDa에서 10 kDa의 분자량을 가진 단백질로 구성되어 있으며, 서로 20~90%정도의 유사한 아미노산 서열을 가지고 있다.⁵⁾ Chemokine은 단백질의 구조상 cysteine residue의 위치에 따라서 4가지 계열로 나누어진다. 처음 두 개의 cysteine residue가 연결되어있으면 CC계, 이 사이에 다른 1개의 아미노산이 끼어있을 때는 CXC계, 그리고 3개 이상의 아미노산이 존재하면 CX 3C계, 1개의 cysteine residue로 끝난 경우를 C계열이라고 명명하였다. 지금까지 40여종이 확인되었으며 그중 CXC계는 호중구에 주로 작용하고 CC계는 단핵구, 호산구, 호염구, 림프구의 화학주성물질로 알려져 있다.⁶⁾ 호산구 화학주성인자로는 regulated on activation, normal T expressed and secreted(RANTES), eotaxin, mono-cyte chemoattractant protein(MCP), IL-16 등이 있다. RANTES는 7.8 kDa의 분자량을 가진 70개의 아미노산으로 구성되어있으며 T-림프구, 호산구의 화학주성과 활성화에 관여하며, eotaxin은 8.4 kDa의 분자량을 가진 74개의 아미노산으로 구성되어 호산구에 특이적으로 작용하는 화학주성인자로 알려져 있다.⁷⁾ 호산구의 화학주성은 eota-xin과 RANTES가 유사한 역가를 가지고 있으며, 호산구의 활성화는 eotaxin이 월등히 강하게 작용하는 것으로 알려져 있다.⁸⁾
   본 연구에서는 비용의 중요한 염증세포인 호산구의 조직 침착에 중요한 역할을 하는 CC chemokine인 RANTES와 eotaxin의 발현을 조사하고 이들 chemokine이 조직 호산구의 출현과 활성화에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

대  상

   양측성 비용으로 진단 받은 35명의 환자(남자 21명, 여자 14명, 평균연령 39.7세)에서 부비동 내시경수술시 조직을 얻었으며, 알레르기성 비용 17예, 비알레르기성 비용 18예를 대상으로 하였으며, 대조군으로 정상 하비갑개 8예를 사용하였다. 모든 대상자들에게 피부단자검사, MAST CLA allergy system(MAST Immunosystem, CA, USA), 비강 및 혈중 호산구, 혈중 총 IgE검사를 시행하여 알레르기 유무를 판단하였다. 환자는 조직을 얻기 전 최소 4주간 항생제, 항히스타민제, 국소 및 경구용 스테로이드제재의 사용을 금지시켰다. 얻어진 조직은 분자생물학적검사와 면역조직화학적검사를 위해 ­70°C에 보관하였다.

Eotaxin의 정량적 역전사 중합효소연쇄반응 
   -70°C에서 보관된 비용 조직을 SV total RNA isolation 시약(Promega Co, Madison, USA)으로 RNA를 추출하였다. 먼저 절제된 조직의 무게를 측정한 다음 1 mg당 5.83 μl의 비율로 SV RNA 용해 완충액을 1.5 ml 시험관에 주입한 다음 분쇄기로 조직을 덩어리가 보이지 않을 때까지 분쇄하였다. 이 용액 175 μl를 취하여 총 RNA를 추출하였으며 잔 여분은 ­70°C에 보관하였다.
   추출한 RNA를 대상으로 reverse transcription system(Promega Co, Madison, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 역전사 중합효소연쇄반응의 조건은 다음과 같다. 5 mM MgCl₂, 10 mM Tris-HCl(pH 9.0, 25°C), 50 mM KCl, 0.1% triton X-100, 각각의 dNTP 1 mM, 1 U/μl Ribonuclease inhibitor, 20 U AMV reverse transcriptase, 0.5 μg oligo(dT)₁₅ primer로 구성된 중합효소연쇄반응 시약에 총 RNA 9.5 μl를 주입하여 총 20 μl를 DNA thermal cycler 480(PE Applied Biosystems, Foster, USA)으로 증폭하였다. 25°C에서 10분간 반응시킨 뒤 42°C에서 60분간 방치하고 99°C에서 5분간 방치하여 역전사효소를 무력화시킨 뒤 5°C로 냉장시켰다.
   합성된 cDNA를 대상으로 GAPDH(glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase)과 eotaxin의 정량적 중합효소연쇄반응을 PE5700(PE Applied Biosystems, Foster, USA)으로 한 개의 96well 시험판내에서 실시하였다. 중합효소연쇄반응에 사용되는 시약은 SYBR^® green PCR core시약(PE Applied Biosystems, Foster, USA)을 사용하였는데, 중합효소연쇄반응시 50 μl에 사용한 1회 사용량은 다음과 같다.
 

  
   DNA가 증폭되면 SYBR^® green이 결합하여 형광을 발생하는 데, PE5700은 중합효소연쇄반응의 각 주기마다 닫혀져 있는 시험관의 마개를 통하여 형광의 세기를 측정함으로서, 중합효소연쇄반응 산물을 정량적으로 나타내어 준다. 즉 주입한 DNA 양이 많을수록 형광이 처음으로 검출되는 연쇄반응 주기의 시점이 빨라지고 이를 threshold cycle 수(이하 C T치)로 나타낸다.
   중합효소연쇄반응의 위양성을 배제하기 위하여 uracil-N-glycosylase 효소를 사용하였고 이를 활성화하기 위하여 연쇄반응 혼합물을 50°C에서 2분간 방치하였으며, AmpliTaq^® Gold DNA polymerase의 활성화를 위해 95°C에서 10분간 반응시킨 다음, 변성 95°C 15초, 결합 60°C 1분간의 2주기를 사용하여 40회 동안 증폭하였다.
   GAPDH와 eotaxin의 증폭을 위하여 사용한 시발체의 염기서열과 증폭되는 핵산의 크기는 아래와 같다.

   GAPDH F：5'-GTC AAC GGA TTT GGT CTG TAT T-3'
   GAPDH R：5'-AGT CTT CTG GGT GGC AGT GAT-3'
                                                                           560 bp
   Eotaxin F：5'-TTA TGG CTT TGG AGT TGG AGA-3'
   Eotaxin R：5'-AGA GGT TGA GGT TTC GGT ATT-3'
                                                                           297 bp

   증폭된 중합효소연쇄반응 산물의 정량화를 위하여, 농도를 알고있는 결핵균핵산을 함께 증폭하여, PE5700에서 측정된 증폭산물의 C T치를 얻었고 이를 기준으로 결핵균핵산의 주입량을 산출하는 공식을 산출한 뒤, GAPDH와 eotaxin을 정량화 하는 상대적 정량법을 사용하였다.
   먼저 결핵균 핵산의 농도를 TKO 100 fluorometer(Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, USA)로 측정하여, 10 pg, 1 pg, 500 fg, 250 fg, 125 fg, 62.5 fg, 31.3 fg 및 7.8 fg의 DNA 표준물질을 제조하였다. 이 핵산을 96 well 중합효소연쇄반응판에 GAPDH와 eotaxin 측정을 위한 검체와 동일한 판의 다른 well에 각각 주입한 뒤 동일한 중합효소연쇄반응조건으로 증폭하였다. PE5700에서 측정된 C T치를 구하여 표준검량선을 작성한 뒤, 이 검량선의 수식에 의하여 GAPDH와 eotaxin의 상대적 농도를 산출하였다. Eotaxin의 농도는 GAPDH의 농도로 나누어 정상화된 eotaxin의 농도를 구하고, 이 값은 다시 정상화된 대조군들의 평균 eotaxin 수치로 나누어 정상인에 비하여 mRNA 발현의 상대적 증감을 정량화 하였다.

호산구와 RANTES의 면역조직화학적검사

면역조직화학염색법
   호산구는 과립단백질인 major basic protein(MBP)에 대한 IgG1 subclass의 BMK13(Sanbio, Holland)을 이용하여 면역조직화학염색을 시행하였다. 각 조직에서 마지막 절편은 Wright-Giemsa 염색을 시행하여 호산구 염색여부를 확인하였다. RANTES는 polyclonal IgG 항 RAN-TES 항체(R&D system, Minneapolis, MN, USA)를 사용하였고, 대조 조직으로 정상인의 구개편도조직을 사용하였다.
   면역조직화학염색 과정을 간단히 살펴보면 냉동 보관된 조직을 6~8 μm의 절편으로 만들어 2시간동안 건조시킨 후, 실온에서 acetone에 10분간 고정한 후 0.05M Tris buffered saline(TBS)으로 3회 세척하였다. 비특이적 단백반응을 없애기 위해 1% bovine serum albumin을 pH7.4의 phosphate-buffered saline으로 습윤 chamber에서 5분간 반응시켰다. 호산구는 1：20으로 희석된 단클론항체로 10분간 실온에서 반응시키고 TBS로 세척하였으며, RA-NTES는 1：50으로 희석된 일차 항체로 실온에서 1시간 반응시켰다. 2차 항체는 같은 농도의 horseradish peroxidase-labeled conjugate IgG로 호산구는 10분간, RAN-TES는 45분간 반응시켰다. 발색제는 New Fuchsin(DAKO, U.S.A.)을 사용하였으며, 대조염색을 위해 2분간 hematoxylin과 반응시켰다.

광학현미경을 이용한 판독
   단클론항체에 의해 특이적으로 염색된 호산구를 400배 광학 현미경으로 3구역의 호흡상피 기저막부위에서 양성으로 염색된 세포의 수를 계측하여 평균값을 구하였다. 호산구의 활성화는 Bentley 등⁹⁾이 제시한 방법에 따라 세포외 공간으로 분비된 MBP가 차지하는 면적을 기준으로 0에서 4까지 등급을 나누었다. 0은 MBP의 분비가 없는 경우, 1은 면적의 10%에 못 미치는 경우, 2는 10~50%, 3은 50 ~75%, 4는 75%이상인 경우로 하였다(Fig. 1).
   RANTES 염색 또한 400배 배율에서 3구역을 검사하여 염색된 부위의 강도와 범위에 따라 0에서 3까지 등급을 나누었다. 0은 염색이 없는 경우, 1은 약하게 염색된 경우, 2는 중등도, 3은 많은 세포에서 강하게 염색된 경우로 하였다.
검사의 오차를 줄이기 위해 서로 다른 두명의 검사자로부터 얻은 결과의 평균값을 사용하였다.

연구자료 분석

   세 그룹간의 eotaxin, MBP 양성세포 값은 one way ANOVA법으로 사후검정은 Scheffe법을, RANTES와 호산구 활성화는 Kruskal-Wallis test법을 이용하여 분석하였으며, chemokine과 호산구와의 상관관계는 Pearson rank method를 이용하였고, 호산구 활성화는 Spearman rank method를 이용하여 알아보았다. 통계적 유의수준은 p<0.05로 하였다.

결     과

Eotaxin의 정량적 중합효소 연쇄반응

   주입한 결핵균 DNA의 농도에 따라 C_T치의 변화를 Fig. 2에 나타내었다. 10,000 fg에서 10 fg까지 직선성이 잘 유지되었다.
   위의 식을 기준으로 하여 얻어진 eotaxin mRNA의 발현은 알레르기성 비용은 정상 하비갑개에 비해 약 11.4배 많았다(p<0.05). 비알레르기성 비용은 약 6.4배 많았으나 통계학적 의의는 없었으며 비용종 군간의 차이도 없었다(Table 1).

조직 호산구와 RANTES 발현 및 호산군 활성화와 chemokine의 상관관계
   400배 시야에서 BMK13 양성세포는 알레르기성 비용의 경우 평균 39.8개로 비알레르기성 비용의 18.2개, 정상 하비갑개의 5.8개에 비해 유의하게 많았다(p<0.05). 호산구의 활성화도 알레르기성 비용이 평균 2.59, 비알레르기성 비용이 2.11로 정상 하비갑개의 0.63에 비해 유의하게 높게 나타났으나(p<0.05) 비용군 사이에는 차이가 없었다(Table 1). RANTES 양성세포는 알레르기성 비용이 0.88, 비알레르기성 비용 0.94, 정상 하비갑개 0.50으로 세군간에 통계적 의의는 없었다(p>0.05)(Table 1).
   Eotaxin의 경우 호산구의 출현과의 상관관계는 γ＝0.55(p<0.01)이었고, 호산구 활성화와는 γ＝0.60(p<0.01)으로 높은 상관관계를 보였으나(Fig. 3), RANTES의 경우는 호산구의 출현과는 γ＝0.05(p＝0.74), 호산구 활성화와 γ＝0.01(p＝0.72)로 통계적 의의가 없었다.

고     찰

   비용은 부비동 및 비강 점막의 만성 염증반응에 의해 발생되는 질환으로 염증성 면역반응이 중요한 발생기전으로 생각되고 있다. 이들 염증반응에는 각종 화학 매개물질에 의한 염증세포의 동원과 세포 상호간의 작용이 중요한 역할을 담당하는데 그 중 호산구는 비용 조직에서 특징적으로 증가되는 염증세포이다. 혈중 호산구의 조직내 동원을 위해서는 우선 vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1), very late activation antigen-4(VLA-4) 등에 의해 호산구가 운반되어 포획되고 접착된 호산구가 화학주성물질에 의해 활성화되어 혈관내피와의 결합성이 강해지면서 누출현상이 일어나고 CD31의 도움을 받아 조직 내로 이동하게 된다.¹⁰⁾ 비용 조직으로 호산구, 비만세포, 호중구 등의 염증세포가 이동하기 위해서 화학주성물질인 chemokine의 역할이 필요하며, 특히 호산구의 증가와 활성화를 위해서는 호산구에 특이적으로 작용하는 CC계 chemokine인 RANTES와 eotaxin 등의 화학매개물질이 필요하다.
   RANTES는 T-림프구, 혈소판, 단핵구, 섬유아세포에서 주로 분비되어, 호산구, 단핵구나 기억세포에 화학주성을 가지며, 특히 후기 알레르기 반응에서 백혈구를 유입시키는 중요한 화학물질로 알려져 있다.⁶⁾ 호산구에 대해서는 활성화와 동원에 관여하는 biphasic effect를 나타낸다. 즉 호산구가 내피세포를 통해 이주할 수 있게 하는 강력한 유도체로 작용하며 특히 IL-5로 전처치한 경우 그 효과는 더욱 강력해진다.¹¹⁾ 호산구의 활성화에 미치는 영향은 PAF만큼 강력하며, CD11b/CD18의 발현을 증가시키고, ECP분비를 촉진시킨다. 그러나 RANTES가 호산구의 생존에 직접적인 영향을 미치지는 않는 것으로 알려져 있다.¹²⁾ 비용에서 RANTES의 발현은 60~97%로 보고되어있으며 비용종이 없는 만성 부비동염에서의 발현율과는 차이는 없으며, RANTES가 호산구의 침윤과 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다.¹³⁾¹⁴⁾ 저자의 경우 비용의 면역조직화학검사시 48.6 %에서 RANTES의 발현을 볼 수 있었으며 이들 대부분이 상피하층과 분비선 주위에서 관찰되었다. 조직 호산구의 출현 및 활성화와는 낮은 상관관계를 보여 지금까지의 보고와는 다른 결과를 보였다. 본 연구의 결과로 비용의 호산구 침착과 활성화에 RANTES가 영향을 미치지 않는다고 단정하기는 어려우나 RANTES외에 다른 중요한 화학매개물질이 관여하고 있음을 시사 하고있다. RANTES가 비용과 정상대조군간에 큰 차이를 보이지 않은 것은 Terada 등¹⁵⁾이 보고한 것처럼 비용의 형성시기에 RANTES가 발현되어 호산구의 침착이 이루어진 후 negative feedback으로 RANTES를 억제할 수 있다는 가정도 상정할 수 있으며, MacLean 등¹⁶⁾의 보고처럼 RANTES가 조직 호산구 증가에 결정적인 역할을 담당하지는 않는 것으로 생각할 수도 있겠다.
   Eotaxin은 RANTES와 34.2% 일치하는 아미노산 서열을 가진 호산구에 특이적으로 작용하는 화학주성인자로 상피세포, 내피세포 및 호산구 등에서 분비되며, 알레르기성 및 비알레르기성 염증반응에서 IL-3, IL-4, IL-5, INF-γ, TNF-α 등에 의해 상승효과를 나타낸다.¹⁷⁾ 저자의 경우 알레르기성 비용에서 정상 하비갑개보다 약 11.4배 많은 eotaxin의 발현을 보였으나 비알레르기성 비용과는 통계학적 차이를 보이지 않았다. 또한 eotaxin이 조직 호산구의 증가와 활성화에 직접적인 영향을 미침을 알 수 있었으나 비용군간에는 차이를 보이지 않아 알레르기 반응 외에 다른 염증성 반응이 비용 형성에 관여함을 알 수 있었다. 이는 부비동염에서 사이토카인의 발현이 알레르기 반응이 관여하는 경우 GM-CSF, IL-3, IL-4, IL-5가, 비알레르기성인 경우는 GM-CSF, IL-3, INF-γ, TNF-α 등이 관여하는 서로 다른 경로를 통해 eotaxin의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다.¹⁸⁾ 알레르기 유발검사 후 급성 호산구성 염증반응시 비강점막에서는 염증세포의 증가와 eotaxin과는 연관성이 없었는데 이는 RANTES와 MCP-3가 중요한 역할을 담당하며, eotaxin은 후기반응에 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각하고 있다.¹⁹⁾ 저자의 경우 비용에서 eotaxin의 발현이 유의하게 많았으나 RANTES는 정상 대조군과 차이를 보이지 않아 비용에서 RANTES의 발현이 많다는 타보고¹³⁾¹⁴⁾와 다른 결과를 보인 것은 본 연구가 부비동 내시경 수술을 시행한 성숙된 비용종을 대상으로 한 것에 기인하는 것으로 생각되며 이는 성숙된 비용에서 eotaxin이 조직 내 호산구 증가 및 활성화에 중요하게 작용함을 추측할 수 있다. Eotaxin은 다른 chemokine과 함께 알레르기성 질환의 중요한 매개물질로 생각되나, 호산구가 많은 위장관 뿐 아니라 호산구를 거의 볼 수 없는 정상 심장과 폐에서도 eotaxin이 많이 존재하는데 이는 eotaxin 단독으로 호산구를 동원하지는 않음을 알 수 있다.⁸⁾ 즉 조직으로 호산구를 동원하기 위해서는 chemokine이 혈중 IL-5같은 조혈성 인자의 자극을 받아 활성화가 이루어져야 가능한 것이다.²⁰⁾

결     론

   Eotaxin의 발현이 비용군에서 정상 하비갑개에 비해 높게 나타났으며 특히 알레르기성 비용에서 유의하게 많이 발현되었다. 이는 알레르기성 염증반응뿐만 아니라 비알레르기성 염증반응으로 호산구가 증가되는 경우에도 eotaxin이 중요한 역할을 담당함을 나타내고 있다. RANTES는 비용군에서 많이 발현되었으나 정상 대조군에 비해 통계학적 의의는 없었으며, 이는 비용의 호산구 증가와 활성화에 RAN-TES의 역할이 크지 않음을 시사하고있다. 비용에서 호산구의 침착과 활성화에 eotaxin이 중요한 역할을 담당함을 알 수 있었으나 eotaxin이 호산구가 증가되지 않은 정상 하비갑개에서도 발현이 되는 것으로 보아 화학주성물질의 활성화로 조직내 호산구 침윤이 일어나기 위해서는 IL-5 등과 같은 조혈인자의 작용이 필요할 것이다.
   이상의 결과를 종합하면 비용 호산구의 침윤과 활성화는 eotaxin에 의해 조절됨을 알 수 있었으며, RANTES는 eotaxin에 비해 그 역할이 매우 약하게 나타남을 알 수 있었다. 그러나 호산구의 조직내 침윤에는 eotaxin 등의 chemokine 외에 다른 수많은 cytokine과 화학물질이 관여함으로 이들 화학물질의 상호작용에 대한 지속적인 관심과 연구가 필요할 것이다.

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