| Expression of HSP72 in Nasal Mucosa of Patients with Allergic Rhinitis. |
| Heung Man Lee, U Seob Lee, Choong Sik Choi, Sang Hag Lee |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea. hmlee91@hotmail.com |
| 알레르기성 비염환자의 비점막에서 HSP72의 발현 |
| 이흥만 · 이우섭 · 최충식 · 이상학 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| 주제어:
Heat shock protein 72ㆍ알레르기성 비염. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Heat shock protein (HSP) is to be involved in inflammation. HSP may be expressed in allergic rhinitis which is an inflammation disease. The purpose of this study was to investigate whether overexpression of HSP72 is specific for allergic rhinitis and is correlated with clinical severity of disease.
MATERIALS AND METHODS:
We studied expression of HSP72 by immunohistochemistry using ABC technique on nasal mucosa from 20 patients with allergic rhinitis, 10 patients with chronic hypertrophic rhinitis and 10 patients with normal turbinates.
RESULTS:
In biopsies from patients with allergic rhinitis, immunopositive cells were observed on epithelium, basement membrane, submucous gland cells, and inflammatory cells.
Expression of HSP72 in patients with allergic rhinitis was significantly increased in nasal mucosa (p<0.01) and was significantly correlated with clinical severity of the disease (p<0.01) and eosinophil count (p<0.01).
CONCLUSION:
Inflammation of nasal mucosa in patients with allergic rhinitis may be linked to production of HSP72. |
| Keywords:
Heat shock protein 72ㆍAllergic rhinitis |
서론
Heat shock protein(이하 HSP로 약함)은 Ritosa1)에 의하여 처음 기술된 이래로 세포에 가해지는 아미노산 유도체, 에탄올, 변성된 단백질, 바이러스 감염, 칼슘이온촉진 등에 의하여 세포내에서 발현되어 세포 방어작용에 관여하며 스트레스 단백질으로도 알려져 있다.2-5) 염증 반응에서 HSP은 IL-1, TNFα 등의 사이토카인, 면역매개체, 산소 자유기 등에 의하여 생성이 조절되고,4) 생성된 HSP은 항원 처리(processing)와 항원 제시 등6)의 기전을 통하여 면역학적인 반응을 조절한다. HSP은 분자량에 따라 HSP65, HSP70, HSP83-90, 고분자량 HSP과 metallothionein, ubiquitin 등으로 분류되며, 이 중에서 HSP60과 HSP70 은 염증 반응과 면역 반응에 중요하다고 알려져 있다.4)7)8) HSP70은 세포에 자극 없어도 존재하는 HSP73(구성형)과 자극후에 관찰되는 HSP72(유발형)으로 분류한다. 알레르기성 비염은 면역 반응의 기전을 통하여 비점막에 염증 반응을 일으켜 증상을 유발하는데 면역학적인 관점에 기인한 HSP과의 관계는 알려져 있지 않다.
저자들은 알레르기성 비염 환자의 비점막에서 HSP의 발현여부를 면역조직화학적인 방법으로 연구하였고, HSP72 발현 정도와 알레르기성 비염에 있어서 중요한 역활을 하는 호산구수 및 증상 정도와의 상관관계를 관찰하고자 하였다.
대상 및 방법
대상
알레르기 코증상이 있으면서, 비즙 도말검사, 피부 단자검사, 혈액중 호산구 수, RAST에서 집먼지 진드기(D.p., D.f.)에 양성을 보이고 최소한 1개월 이상 약물투여를 받지 않은 알레르기성 비염환자 20예(남자 8예, 여자 12 예, 평균연령 35.3세)을 연구 대상으로 하였다. 대조군은 비중격 교정술을 시행한 환자에서 채취한 편측의 정상 하비갑개 점막 10예(남자 5예, 여자 5예, 평균연령 38.3세)와 만성 비후성 비염 환자의 하비갑개 점막 10예(남자 5예, 여자 5예, 평균연령 37.2세)를 사용하였으며 상기의 알레르기 검사상 음성을 보였다.
방법
코증상의 분류
설문지를 통하여 환자가 호소하는 코증상 정도를 분류하였다(Table 1).
검체의 채취 및 처리
국소 마취하에 하비갑개 전단으로부터 1 cm 뒤에서 비점막을 겸자를 이용하여 채취한 후 10% formaldehyde 용액(pH 7.6)으로 고정한 후 파라핀으로 포매하여 4 μl 두께의 절편을 만들었다.
면역조직화학적 염색 및 관찰
염색은 universal LSAB kit(DAKO, Copenhagen, Denmark)를 이용하여 avidin-biotin peroxidase comlpex(ABC)법으로 하였다. 파라핀 조직 슬라이드를 탈파라핀시킨 후 내인성 페록시다아제 활성을 억제시키기 위하여 0.3% H2O2로 15분간 처리하고 인산완충용액(pH 7.6)으로 세척하였다. 비특이적 항원 항체반응을 억제하기 위하여 30 분간 정상 소혈청으로 처리한 후 단크론성 HSP72 항체(1：1000, StressGen, Glanford, Canada)로 4℃에서 하루밤 동안 처리하였다. 이차항체로 biotinylated anti-mouse immunoglobulin을 사용하여 30분간 반응시켰다. 인산완충용액으로 세척 후 avidin conjugated horse-radish peroxidase에 30분, diaminobenzidine(Sigma, St. Louis, MO)으로 5분간 반응시켜 발색시켰다. 대조염색은 Meyer's hematoxylin으로 5분간 반응시켰고 음성 대조군은 위 과정 중 일차항체만을 반응시키지 않고 발색시켜 관찰하였다. 염색된 슬라이드는 400배 광학 현미경으로 관찰하여 전체 세포수에 대한 면역양성 세포수의 비율(percentage)로 표시하였으며 한 슬라이드당 10시야에서 관찰하여 평균을 구하였다.
호산구 염색 및 관찰
Hansel 염색(Lide Laboratories, Japan)을 시행하여 광학현미경하에서 400배 광학현미경으로 염색된 호산구수를 계산하였으며 연속된 10개 시야에서 관찰하여 평균을 구하였다.
통계학적 처리
모든 통계자료는 Macintosh용 통계 프로그램인 StatView Ⅱ(Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA)를 이용하여 환자군과 대조군 사이의 HSP 면역양성 세포수의 비교는 Mann-Whitney test를 이용하였고, 조직내 호산구 수와 HSP 면역양성 세포수의 비교는 Spearman rank test를, 알레르기성 비염 증상 정도와 HSP 면역양성 세포수의 비교는 Kendall's tau test를 이용하였다.
결과
HSP72 면역양성 세포의 분포
HSP72 면역양성 세포는 상피세포, 기저막 및 점막하 선조직 세포와 염증세포에서 관찰되었다(Fig. 1). 그러나 음성 대조군에서는 HSP72 면역양성 세포는 관찰되지 않았다.
알레르기성 비염군과 대조군에서 HSP72 면역양성 세포 비율
알레르기성 비염 환자군은 만성 비후성 비염 환자군 및 정상 대조군에 비하여 상피세포, 기저막, 점막하 선조직 세포 및 염증세포 모두에서 HSP72 면역양성 세포 비율이 유의하게 많았다(p<0.01, Fig. 2). 그러나 만성 비후성 비염 환자군과 정상 대조군 사이에는 유의한 차이가 없었다(p>0.05, Fig. 2).
HSP72 면역양성 세포와 호산구수
알레르기성 비염 환자군에서 비점막 조직내 호산구수가 많을수록 상피세포, 기저막, 점막하 선조직 세포 및 염증세포에서 HSP72 면역양성세포가 유의하게 많았다(p<0.01, Rho=0.606, Fig. 3).
HSP72 면역양성 세포와 비증상 정도
알레르기성 비염 환자군에서는 재채기, 비폐색과 비루가 심할수록 HSP72 면역양성 세포비율이 유의하게 많았다(p<0.01, Figs. 4, 5 and 6).
고찰
본 실험은 HSP70의 발현을 관찰하기 위하여 알레르기성 비염 환자군, 만성 비후성 비염군과 정상 대조군의 비점막에서 단크론성 HSP72 항체를 이용하여 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 알레르기성 비염 환자의 비점막 조직에서 HSP72 면역양성 세포는 염증세포, 점막하 선세포 조직에 존재하였고 상피세포 즉, 섬모세포와 기저세포 및 배세포에도 관찰되었다. 일부 알레르기성 비염환자의 기저막에서 양성면역 반응이 관찰되었는데 이것은 세포에서 분비된 HSP72 혹은 세포가 파괴되면서 기저막에 HSP72가 침착된 것으로 생각된다.9) 그러나 알레르기성 비염 환자의 비점막에서는 만성 비후성 비염 환자군과 정상 대조군 보다 염증세포, 점막하 선세포 조직과 상피세포에서 양성세포수가 대조군에서보다 유의하게 증가하였기에 증가된 염증세포(호산구) 뿐만 아니라 모든 양성세포가 의미있을 것으로 생각되며, 이러한 결과는 대조군과는 다른 알레르기성 비염의 염증반응이 갖고 있는 세포 동원 및 활성화, 매개체 분비 등의 면역학적인 특징으로 생각된다.
알레르기성 비염은 외부 항원에 대한 1형 과민반응으로 비점막에 염증반응이 일어나 비증상을 일으키는 질환으로 활성화된 호산구와 비만세포 침윤이 특징인 염증반응이다.10)11) 특히 호산구는 major basic protein, eosinophilic cationic protein, eosinophil derived neurotoxin과 산소 자유기를 분비하여 조직을 파괴하고, HSP의 합성을 유발하는 TNFα를 분비한다.12)13) 본 연구의 결과 조직내 호산구수는 알레르기성 비염환자에서 대조군에 비하여 유의하게 많아 Igarashi등11)의 결과와 일치하였고, 조직내 호산구수가 증가할수록 HSP72 면역양성 세포수는 유의하게 증가하였다. 단핵세포와 대식세포는 염증 반응에서 중요한 역할을 하며 알레르기성 비염 같은 만성 염증에서 IL-1, TNFα, 산소 자유기의 중요한 공급원이다.4) 또한 단핵세포와 대식세포를 호산구로부터 추출한 단백질과 함께 노출시키면 대식세포로부터 HSP의 생산을 유도한다.4) 따라서 알레르기성 비염 환자의 비점막 조직에서 호산구가 증가할수록 여러 세포로부터 HSP 생산을 유도, 촉진하여 HSP의 발현이 증가되는 것으로 생각된다.
알레르기성 비염의 임상양상 즉, 재채기, 비폐색, 비루 증상이 HSP72 면역양성 세포수와 유의한 상관관계가 있는 것은 알레르기성 비염의 임상 증상이 심할수록 호산구의 수가 증가하고 이에 동반한 cytokine등의 여러가지의 염증 매개체가 증가에 기인하는 것으로 생각한다. HSP60과 HSP70은 IL-1과 TNFα 등의 cytokine에 의하여 유도되고, 이러한 cytokine은 여러 세포를 자극하여 HSP을 생산하는 것으로 알려져 있다.8) 그러나, HSP가 상피세포에서 유도되는 기전에 관하여는 알려져 있지 않다.
HSP70의 중요한 기능의 한가지는 방어기능으로서 세포가 환경 스트레스에 잘 적응하여 생존할 수 있게 한다. 특히, HSP70은 reactive oxygen species와 TNFα를 포함한 여러 가지의 염증 매개체의 나쁜 영향으로부터 세포와 조직을 보호한다.14) 생체 실험에 있어서 heat shock 반응의 유도는 폐 염증으로부터 폐를 보호해준다.15) 그러나 이러한 스트레스 반응에 대한 항염증 효과는 HSP 자체보다는 염증반응에 중심 역할을 하는 전사인자인 NFκB의 활성 억제와 관련이 깊으며 HSP는 염증 반응의 여러 단계와 관련이 있다.16) 여러가지 HSP는 자가 항원으로 작용하여 면역 반응을 증강시키며 HSP70은 polypeptides에 결합하여 항원 처리 및 제시와 연관되어 면역 및 알레르기 반응을 증강시키는데, 이것은 방어적 면역 반응에 대하여는 방어적 역할은 하지만, 반대로 알레르기 혹은 자가면역의 경우에는 신체에 악영향을 끼친다.17) 또한 HSP70은 염증 치유과정의 중요한 일부분인 세포고사(apoptosis)에 의한 염증세포의 생리적인 제거를 억제하여 염증의 치유또는 관해보다는 염증 반응을 지속시시켜 만성화시킨다.18) Bertorelli등19)에 의하면 스테로이드 흡입은 천식 증상을 개선시키지만 HSP70과 HLA-DR의 발현을 감소시킨다고 보고하였다. 따라서 HSP70은 증상이 호전됨에 따라 발현이 감소하므로 방어 기전으로 생각하기는 어렵고, 경증의 천식에서는 HSP70이 발현되지 않아 질병의 심한 정도(severity)의 특이한 표식자로서 역할을 한다. 마찬가지로 알레르기성 비염 환자에서 임상 증상이 증가함에 따라 HSP72 발현이 증가한 것은 증가된 스트레스에 대한 반응으로 생각되며, 임상 증상의 심한 정도를 알 수 있는 중요한 표식자(marker)로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
결론
알레르기성 비염의 염증반응은 HSP72의 과발현과 연관이 있는 것으로 생각되며, 비점막에서의 HSP72 발현 기전에 대하여는 추후 연구가 필요할 것으로 생각된다.
REFERENCES
1) Ritossa F. A new puffing pattern induced by temperature shock and DNP in Drosophila. Experientia 1962;18:571-3.
2) So AG, Davie EW. The effects of organic solvents on protein biosynthesis and their influence on the amino acid code. Biochemistry 1964;3:1165-9.
3) Ananthan J, Goldberg AL, Voellmy R. Abnormal proteins serve as eukaryotic stress signals and trigger the activation of heat shock genes. Science 1986;232:522-4.
4) Polla BS. A role for HSPs in inflammation? Immunol Today 1988;9:134-6.
5) Welch WJ, Garrels JI, Thomas GP, Lin JJ, Feramisco JR. Biochemical characterization of the mammalian stress proteins and identification of two stress proteins as glucose- and Ca2＋-ionophore-regulated proteins. J Biol Chem 1983;258:7102-11.
6) Manara GC, Sansoni P, Badiali-De Giorgi L, Gallinella G, Ferrari C, Brianti V, et al. New insights suggesting a possible role of a HSP 70 kD family related protein in antigen processing/presentation phenomenon in humans. Blood 1993;82:2865-71.
7) Denagel DC, Pierce SK. HSPs in immune response. Crit Rev Immunol 1993;13:71-81.
8) Polla BS, Kantengwa S. HSPs and inflammation. Curr Top Microbiol Immunol 1991;167:93-104.
9) Winfield JB, Jarjour WN. Stress proteins, autoimmunity, and autoimmune disease. Curr Top Microbiol Immunol 1991;167:161-89.
10) Bentley AM, Jacobson MR, Cumberworth V. Immunohistology of the nasal mucosa in seasonal allergic rhinitis: Increases in activated eosinophils and epithelial mast cells. J Allergy Clin Immunol 1992;89:877-83.
11) Igarashi Y, Goldrich MS, Kaliner MA, Irani AM, Schwartz LB, White MV. Quantification of inflammatory cells in the nasal mucosa of patients with allergic rhinitis and normal subject. J Allergy Clin Immunol 1995;95:716-25.
12) Finotto S, Ohno I, Marshall JS, Gauldie J, Denburg JA, Dolovich J, et al. TNFα production by eosinophils in upper airways inflammation (nasal polyposis). J Immunol 1994;153:278-89.
13) Polla BS, Kantengwa S, Gleich GJ, Kondo M, Reimert CM, Junod AF. Spontaneous heat shock protein synthesis by alveolar macrophages in interstitial lung disease associated with phagocytosis of eosinophils. Eur Respir J 1983;6:483-8.
14) Jacquier-Sarlin MR, Fuller K, Dinh-Xuan AT, Richard MJ, Polla BS. Protective effects of hsp70 in inflammation. Experientia 1994;50:1031-8.
15) Villars J, Edelson JD, Post M, Brendan J, Mullen M, Slutsky AS. Induction of heat shock proteins is associated with decreased mortality in an animal model of acute lung injury. Am Rev Res Dis 1993;147:177-81.
16) Wong HR, Ryan M, Wispe JR. Stress response decreases NF-κB nuclear translocation and increases I-Ba expression in A549 cells. J Clin Invst 1997;99:2423-8.
17) Polla BS, Bachelet M, Dall'ava J, Vignola AM. Heat shock proteins in inflammation and asthma: Dr Jekyll or Mr Hyde? Clin Exp Allergy 1998;28:527-9.
18) Samali A, Cotter TG. Heat shock proteins increase resistance to apoptosis. Exp Cell Res 1996;223:163-70.
19) Bertorelli G, Bocchino V, Zhuo X, Chetta A, Del Donno M, Foresi A, et al. Heat shock protein 70 upregulation is related to HLA-DR expression in bronchial asthma. Effects of inhaled glucocorticoids. Clin Exp Allergy 1998;28:551-60.
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