| Expression of p16 Protein and Cyclin D1 Protein in Head and Neck Squamous Cell Carcinomas. |
| Sang Hyun Kim, Suk Ah Park, Young Suk Oh |
| Department of Otolaryngology, National Medical Center, Seoul, Korea. skimnmc@chollian.net |
| 두경부 편평세포암에서 p16, Cyclin D1 단백의 발현양상 |
| 김상현 · 박숙아 · 오영석 |
| 국립의료원 이비인후과 |
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| 주제어:
p16ㆍcyclin D1ㆍ두경부 편평세포암. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
The p16, cyclin D1, their partners Cdk4/Cdk6, and pRb constitute a G1 regulatory pathway commomly targeted in tumorigenesis. Genetical, immunochemical, and functional analyses show abnormalities of this pathway in various tumors including head and neck squmaous cell carcinoma. To investigate the clinicopathologic meanings of p16 protein and the relationship between p16 and cyclin D1 in head and neck squmous cell carcinoma.
MATERIAL AND METHOD: Formalin-fixed paraffin-embeded tumor materials that were obtained from 37 patient with head and neck squmaous cell carcinoma were analyzed by immunohistochemical staining method using antiserum that were directed against p16 and cyclin D1.
RESULTS:
1) Deletion of p16 was found in 67.6% (25/37) of the patients with head and neck squamous cell carcinoma. The deletion was not associated with the clinicopathologic parameters (eg. T and N stages, cell differentiation). 2) Deletion of p16 protein and overexpression of cyclin D1 were identified in 76% (28/37) of the patients with head and neck squmaous cell carcinoma. But deletion of p16 was not affected by the overexpression of cyclin D1 in head and neck squmaous cell carcinoma.
CONCLUSION:
Deletion of p16 and overexpression of cyclin D1 were identified in head and neck squmaous cell carcinoma.
These may abrogate the G1 regulatory pathway. These data suggested that combination of these abnormalities may be important in head and neck turmorigenesis. |
| Keywords:
p16ㆍCyclin D1ㆍHead and neck squmaous cell carcinoma |
서론
정상세포의 세포주기는 양성조절인자(cyclin members, Cdks)와 음성조절인자(cyclin kinase inhibitors)의 균형에 의해 유지되며 이들 조절인자들간의 불균형 발생시, 즉 음성조절인자의 기능 상실이나 양성조절인자의 과발현에 의해 암종을 유발하게 된다. 세포주기 중 G1기는 가장 결정적인 시기로서 G1 초기에 세포가 증식을 계속할 것인가 혹은 휴지기에 머물 것인가가 결정되며 세포가 G1 말기의 restriction point를 지나게 되면 다른 외부요소(성장인자)의 자극이 없어도 세포는 증식을 지속하게 된다. 세포의 증식은 G1기에서 종양억제유전자로 알려진 pRb가 활성화된 cyclin dependent kinase에 의해 인산화되어 그 기능을 상실하므로써 유도되며, 이 과정은 또한 세포주기의 음성조절인자인 p16 단백에 의해 조절된다.1)2) 이는 p16 단백이 Cdk4에 cyclin D1과 경쟁적으로 작용하여 Cdk4의 활성화를 억제시켜 pRb의 인산화를 방해해 세포의 G1기에서 S기로의 이행을 차단하므로써 세포증식을 억제하는 것이다.
p16의 발현은 H-ras암유전자의 암유발 효과와 H-ras, C-myc암유전자를 보이는 세포에서 점돌연변이 형성을 억제한다고 연구되었고3) 이미 급성 백혈병, 흑색종, 폐암 등에서 이 유전자의 소실이 밝혀졌다.
Cyclin D1은 세포주기내 중요한 양성조절인자로서 Cdk4 혹은 Cdk6와 결합하여 G1기에서 S기로의 이행을 조절한다. 식도암, 유방암 등 여러암종에서 이 유전자의 과발현이 보고되어 있는바4)5) 이는 cyclin D1의 과발현이 세포가 G1기에 머무는 시간을 짧게하여 G1기에서 S기로의 이행을 촉진하는 역할을 한다. 본 연구에서는 p16과 cyclin D1단백에 대한 단클론 항체로 면역화학적 염색을 시행하여 두경부 편평세포암에서 p16단백의 표현양상과 임상병기 및 조직분화도에 따른 표현양상의 차이를 알아보고 cyclin D1 단백표현과의 관계를 알아봄으로써 두경부 편평세포암에서 p16 단백과 cyclin D1 단백의 역할을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
재료
연구에 이용된 조직은 1986년 1월부터 1994년 10월까지 국립의료원 이비인후과에서 두경부 편평세포암으로 진단받은 37례의 파라핀 포매조직을 이용하였다.
발생부위별로 후두암이 23례, 하인두암이 6례, 설암이 8례였으며 성별은 남자 32명, 여자 5명, 평균연령은 58세였다.
방법
시약
실험에 이용한 cyclin D1 항체는 쥐 단클론 항체인 G124-326(BioGenex, USA), p16은 쥐 단클론 항체인 G175-405(PharMingen, USA)를 사용하였으며 염색은 DAKO LSAB Kit와 발색제로 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)를 사용하였다.
면역조직화학적 염색
파라핀 포매조직 슬라이드를 xylene으로 탈파라핀화시키고 100%, 90%, 80%, 70% 알콜로 함수과정을 거친 후 전자레인지로 15분간 처리 후 메탄올 과산화수소액으로 내인성 과산화효소를 억제시켰다. Cyclin D1은 1：30으로 희석하여 30분간, p16은 1：100으로 희석하여 실온에서 2시간 반응 시킨후 biotinylated anti-rabbit, anti-mouse immunoglobulin을 각각 10분, 30분간 반응시킨후 세척하고 streptavidin과 반응시킨후 발색제인 DAB로 반응시켜 세척후, Meyer-Hematoxylin으로 대조염색후 봉입하였다.
면역조직화학적 판정 및 통계분석
면역조직화학적 방법으로 염색한 조직표본의 현미경적 관찰은 조직편의 중심부에서 관찰하여 암세포의 핵의 황갈색의 과립이 p16의 경우 배경보다 강한 경우를 양성으로(Fig. 1),2) cyclin D1의 경우 암세포의 10%이상에서 관찰되는 경우를 양성으로 판정하였다(Fig. 2).6)
대상환자의 임상적 병기 및 Hematoxylin-Eosin 염색조직표본의 분화도의 분류는 미국 암학회 분류(Classification of American Joint Commitee on Cancer, 1988)을 사용하였으며 통계처리는 개인용 컴퓨터의 SAS progr-am(Fisher’s extract test, Chi-Square test)을 이용하였다.
결과
p16 단백과 cyclin D1단백의 표현률
총 37례중 p16 음성반응은 67.6%, cyclin D1 양성반응은 32.4%로 각 부위에 따른 통계학적 차이는 없었다(Table 1).
p16 단백 표현률에 대한 cyclin D1 단백의 표현률
Cyclin D1 단백의 과발현을 보이거나 p16 단백의 소실을 보인 례는 총 37례중 28례로 76%에서 관찰되었으며, cyclin D1 단백의 과발현과 동시에 p16 단백의 소실을 보인 례는 9례로 24.4%에서 관찰되었다(Table 2).
T 병기, 림프절 전이, 병리학적 분화도와 p16단백 음성표현과의 관계
T 병기에 따른 종양 증례수와 p16 단백의 음성률은 제1기는 4례중 50%, 제2기는 10례중 70%, 제3기는 13례중 69.3%, 제4기는 10례중 70%로 병기의 증가와 p16단백의 음성률 사이에서 통계학적 의의는 찾을 수 없었다.
림프절 전이가 있었던 21례중 p16 단백의 음성률은 61.9%, 림프절전이가 없었던 16례중 p16 단백의 음성률은 75 %로 림프절 전이여부와 p16단백의 음성률 사이에서 통계학적 의의는 찾을 수 없었다.
조직의 분화도가 좋은 18례중 61.1%, 중등도 15례중 73.3%, 분화도가 나쁜 4례중 75%에서 p16 단백이 음성률을 보였다. 즉 p16단백의 음성률과 조직분화도 사이에서 통계학적 의의를 찾을 수 없었다(Table 3).
p16 단백과 cyclin D1 단백의 발현여부와 임상병기와의 관계
p16 단백의 소실과 동시에 cyclin D1 단백의 과발현을 보인 예나, p16단백의 소실을 보이거나 cyclin D1 단백의 과발현을 보인 예 모두 임상병기와의 관계에서 통계학적 의의를 찾을 수 없었다(Table 4).
고찰
p16은 염색체 9p21에 위치는 세포주기 G1기에 작용하는 중요한 종양억제유전자로서 Cdk4에 cyclin D1과 경쟁적으로 작용하여 pRb 단백의 인산화를 막아 G1기에서 S기로의 이행을 억제한다. 여러 종류의 종양에서 9p21부위의 재배열, 동형접합성 상실, 이형접합성 상실, 점돌연변이 등이 보고된 바 있으며1) 이로 인한 그 기능의 소실이 암종유발에 관여하는 것으로 생각된다. 최근 연구결과에 의하면 p16유전자의 이상메틸화 혹은 유전자소실에 의한 p16 단백의 불활성화를 두경부 편평세포암 발생기전중의 하나로 설명하기도 하였다.7) p16 단백은 p53 단백과는 달리 그 기능의 소실이 p16유전자의 돌연변이보다는 소실에 의한 것으로 여겨져 암세포에서의 그 발현여부를 관찰하는데 있어 비교적 면역조직화학적 염색법이 믿을 만한 것으로,8) 본 연구에서도 면역조직화학염색을 시행하여 p16 단백의 발현여부를 관찰하였다. 두경부 편평세포암의 70%, 유방암의 65% 그외 악성 흑색종, 백혈병 등에서 이 유전자의 소실을 보고하고 있는 바,2)9) 본 연구에서도 두경부 편평세포암으로 진단받은 37례중 25례(67.7%)에서 p16단백의 소실을 증명할 수 있었다. 그러나 원발부위의 진행여부, 임파절 전이여부, 암세포의 분화도 등에 따른 p16 단백표현률의 차이는 발견할 수 없었다. 이는 두경부 편평세포암의 발생과 진행에 관한 유전자분석을 통한 연구에서 p16 단백소실이 암종 유발과는 관계가 있으나, 진행에는 관여하지 않는 것으로 밝혀진 것과 관계가 있는 것으로 사료된다.10)
Cyclin D1은 염색체 11q13에 위치하는 유전자로 두경부, 폐, 식도 편평세포암의 10∼50%에서 이 유전자의 증폭이 관찰되며, 이로써 암종의 유발과 진행에 이 유전자가 중요한 역할을 할 것이라고 생각된다. 4)5) Cyclin D1은 cyclin dependent kinase 4 혹은 cyclin dependent kinase 6와 복합체를 형성하여 유핵세포 세포주기에 작용하여 pRb의 인산화를 유도하여 G1기에서 S기로의 전환을 촉진하는데 이는 암세포에서 필수적인 과정으로 생각된다. 배양된 세포를 이용한 연구결과에서 cyclin D1 단백의 과발현이 G1기를 짧게하고 세포의 외부성장인자에 대한 의존도를 줄여 주는 것으로 보고된 바 있다. 11)12) 두경부 편평세포암에서 Cyclin D1 단백 과발현에 대한 임상적 의미는 아직 명확히 규명되어 있지는 않으나 후두 편평세포암을 이용한 여러 연구에서 cyclin D1 유전자의 증폭과 단백의 과발현을 보고하여 cyclin D1 단백의 과발현과 임상병기와의 관계를 주장하였다. 6) 본 연구에서도 cyclin D1단백의 과발현은 관찰할 수 있었으나 임상병기에 따른 cyclin D1 단백의 발현률의 차이는 증명할 수 없었다. 이는 본 연구의 대상수가 적어 충분한 결론을 내릴 수 없는 것으로 사료된다.
대표적인 종양억제 유전자 중의 하나로 알려진 pRb 또한 그 정상기능의 상실시 망막세포암종을 포함한 여러 종양발생에 관여하는 것으로 알려졌다.13)14) 이 유전자는 G1기에서 S기로의 전환을 억제하여 세포분화를 조절하게된다. pRb 단백의 기능상실은 cyclin D1·Cdk4 혹은 Cdk6 복합체에 의해 활성화된 cyclin dependent kinase 4 혹은 cyclin dependent kinase 6에 의한 인산화를 통해 이루어지며 이로서 pRb와 결합되어 있던 전사요소 E2F가 분리되어 활성화되므로써 S기에 필요한 유전자 발현을 증가시키게 된다.14) 따라서 cyclin D1의 과발현은 pRb에 의한 세포주기 억제기능을 극복하게 하므로써 암종유발에 관여하는 것으로 사료된다.
포유동물의 세포주기중 G1기에서 S기로의 이행은 전술한 p16, cyclin D1, pRb로 구성된 복잡한 경로에 의해 조절받는다.1)2) p16/cyclin D1·Cdk/pRb경로는 간략히 p16단백이 cyclin D1·Cdk복합체 형성을 억제하여 이에 의한 pRb의 인산화를 막아 G1기에서 S기로의 이행을 억제하여 세포성장을 조절하는 것으로 각 조절인자들의 비정상적 변화가 즉, p16 혹은 pRb의 불활성화나, cyclin D1의 과발현이 곧 이 경로를 망가뜨려 G1기에서 S기로의 이행을 비정상적으로 유도하게 된다.2)7) 이는 곧 p16/cyckin D1·Cdk/pRb경로에서 어느 한 조절인자의 이상도 결국은 전체 세포주기에 영향을 주어 암종을 유발할 수 있는 것으로 사료된다. 따라서 최근 여러 연구에 의해 G1기 조절에 중요한 p16/cyckin D1·Cdk/pRb경로가 암발생에 있어 흔히 표적이 될 수 있으며 또한 각 조절인자의 공동작용이 하나의 조절인자의 변화에서보다 더 효과적으로 암세포 유발을 자극할 수 있다고 밝혀졌다.1)2)7)
한 연구에서 p16이 소실된 T47D/D-D 3 세포에서 실험적으로 cyclin D1을 유도한 쥐의 유전자를 통한 생체실험에서 암세포 유발에 두 유전자의 공동작용을 증명하기도 하였다.1)7) 본 연구에서도 전체 37례중 9례에서 p16 단백의 소실과 cyclin D1 단백의 과발현을 관찰할 수 있었다. 그러나 두 유전자의 공동작용이 암종의 중증도의 증가나 나쁜예후와의 관련성은 아직 규명되어있지 않다.
본 연구에서 p16단백의 소실과 cyclin D1 단백의 과발현이 암세포 유발과 진행에 미치는 상호관련성은 밝힐 수 없었으나 p16 단백의 소실과 cyclin D1단백의 과발현은 관찰할 수 있었으며 이로써 이 두 단백이 공동작용하여 두경부 편평세포암 발생에 관여 할 것으로 사료된다.
결론
두경부 편평세포암에 대한 p16단백과 cyclin D1 단백의 역할을 알아보고자 시행하여 다음과 같은 결론를 얻었다.
1) p16 단백은 두경부 편평세포암 발생에 관여하는 중요한 유전자이나 임상병리적 예후를 결정하는 인자는 아닌 것으로 사료된다.
2) 두경부 편평세포암에서 p16 단백의 소실과 cyclin D1 단백의 과발현이 암세포의 세포주기조절에 공동작용하여 암종유발에 관여할 것으로 사료된다.
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