교신저자：이병돈, 140-210 서울 용산구 한남동 657-58 순천향대학교 의과대학 부속병원 이비인후과학교실
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서     론

   혈관선조, 나선인대 및 나선융기 등을 포함하는 와우 외측벽의 기능은 외림프와 비교하여 내림프에 고농도의 K＋ 농도를 유지케 하여 auditory transduction과 와우의 항상성에 필요한 중심적 역할을 한다. 내림프액과 내림프의 양성 직류 전위의 생성과 유지에 대한 이해는 내이의 분비세포, 특히 외측벽에서 일어나는 일련의 이온 수송기전의 연구가 가장 기본적인 요소라 할 수 있다.
   와우 외측벽의 이온 수송에 대해서는 Na^＋, K^＋-ATPase,¹⁾ carbonic anhydrase²⁾ 및 I_sk channel³⁾ 등 많은 효소들에 관한 연구 보고가 있고, 와우의 회전 부위에 따라서도 이온의 수송 및 생성에 작용하는 여러 효소들의 반응 역시 다르다고 알려져 있다. 또한 와우의 이온과 수분 평형에 있어서 중심적인 역할을 하는 K^＋은 Na^＋과 함께 ATP의 가수분해, cotransport 혹은 exchange 등에 의해 이동되어 내림프 전위 유지에 참여하지만,⁴⁾ 아직 와우의 이온 수송 기전에 대해서는 명확하게 밝혀지지 않고 있다.
   세포막의 전기적 흥분과 이온 수송에 관여하는 전압 의존성(voltage-dependent 혹은 voltage-gated) Na^＋ channel은 전압 의존성 K^＋ channel과 더불어 와우에서 역할과 기능이 있을 것으로 생각되나, 그의 존재와 생리적 특성에 대해서는 아직 알려진 바가 없다.
   따라서 본 연구는 백색 기니픽 와우에서 western blot과 면역조직화학법을 통해 전압 의존성 Na^＋ channel의 그의 발현과 분포를 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

재  료
   실험 동물은 Preyer 양성 반사인 300~350 g의 백색 기니픽을 대상으로, 일차 항체는 다클론성 IgG rabbit anti-Na^＋ channel I형과 II형(Upstate Biotechnology. Inc., NY, USA)을 사용하였다.

Western blot
   15마리의 실험 동물에 30% chloral hydrate(2 mg/kg)를 복강내 주사하여 마취한 후, 측두골을 분리한 후 골포를 얻었다. 실체 줌 현미경(Olympus SZH-10, Japan)하에서 0.1 M PBS(phosphate buffered saline, 10 mM sodium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.5)에 담근 상태에서 와우 감각상피(내·외 유모세포, 지주세포)와 와우 외측벽(나선인대, 혈관선조)을 분리하였고, 양성 대조군을 위해 심장도 같이 채취하였다. 3군으로 나눈 각각의 조직을 10 mM HEPE buffered solution(sodium N-2-Hydroxye-thylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid, pH 7.4)과 함께 균질화하였다. 균질화된 조직들의 상층액을 BSA(Bovine serum albumin, Sigma, USA)를 이용한 dye binding protein assay를 통해 단백질의 농도를 측정하여 각각의 조직에 대한 단백질의 농도를 동일화하였다. 동일 농도의 각 조직 20 μg에 sample buffer(62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% sodium dodecyl sulfate, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0.003% bromophenol blue)를 10 μl 첨가한 뒤, 100°C에서 5분간 가열하고 원심 분리한 후, 각 조직을 10% Tris-HCl(READY GEL, Precast Gel for Polyacrylamide Electrophoresis, Bio-Rad Labaratories, CA, USA)의 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 걸어 전기영동조에서(Mini PROTEAN^® 3 System, Bio-Rad Labaratories, CA, USA) 200 V로 2시간동안 단백질을 분리하였다. 전기영동된 겔을 전사용액에 30분간 충분히 적신 nitrocellulose 막(0.45 μm, Bio-Rad Labaratories, CA, USA)에 전기이동장치(Mini Trans-Blot^® Electrophoretic Transfer Cell, Bio-Rad Labaratories, CA, USA)를 사용하여 1시간 30분 동안 전사하였다. 전사된 nitrocellulose 막의 비특이적 반응을 제거하기 위해 실온에서 PBS로 희석된 5% skim milk로 안구형 진탕기 위에서 12시간동안 반응을 시킨 후, 3% skim milk로 희석된 일차 항체들을 실온에서 3시간 처리하였다. 일차 항체는 1：500으로 희석하였고, 이차 항체는 일차 항체에 상응하는 biotin이 부착된 anti-rabbit IgG(H＋L)용액(Vector Labaratories, Inc., CA, USA)을 1：200으로 희석하여 30분씩 실온 반응시킨 후, 발색은 VECTOR STAIN^® Elite ABC kit(Vector Labaratories, Inc., CA, USA)로 30분 반응시키고 DAB(3,3'-diaminobenzidine in chromogen solution, Imidazole-HCl buffer pH 7.5 containing hydrogen peroxidase, DAKO Laboratories, Denmark)로 약 10초간 반응시켰다. 전사 후 각 단계 사이는 PBS로 15분씩 3회 세척하였다. 분자량 표지자는 광역대의 염색된 단백질 복합물질(Bio-Rad Labaratories, CA, USA)을 사용하였다.

면역조직화학염색
   10마리의 실험 동물에 30% chloral hydrate(2 mg/kg)를 복강내 주사로 마취한 뒤, 흉강을 열고 PBS와 4% paraformaldehyde를 각각 100 ml씩 좌심실을 통해 관류 고정하였다. 단두 후 측두골의 골포를 열고 실체 줌 현미경하에서 등골을 제거한 뒤, 와우 첨단의 외부 골편을 제거하고 난원창과 정원창으로 1 ml의 4% paraformaldehyde로 천천히 재관류한 다음, 24시간 동안 후고정하였다. 10% EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)로 1주일간 탈회하였으며 용액은 매일 교환하였다. 통상적인 파라핀 포매 후, 6 μm 두께로 잘라 gelatin-coated slide에 부착시켰다. 조직의 처리는 100% xylene으로 5분씩 3회 탈파라핀화 및 100%, 95%, 85%, 75% ethanol에 5분씩 함수한 뒤 흐르는 물에 10분 동안 세정하였다. 0.03% TRITON X-100으로 희석한 8% goat serum으로 상온에서 1시간 blocking한 후, 일차 항체를 1% goat serum albumin으로 각각 1：10으로 희석하여 상온에서 3시간 처리하였다. 발색반응은 빛이 차단된 상태에서 1：30의 FITC goat anti-rabbit IgG (H＋L)(ZYMED^® LABARATORIES INC., CA, USA)를 1시간 30분 동안 반응시켜 암실에서 각각의 slide를 cover glass로 봉합한 후, 형광 현미경(Nikon ECLIPSE TE300, Japan)으로 관찰하였고, 필름 노출시간은 1분이었다. 양성 대조군은 나선신경절세포로 하였고, 와우의 구조를 확인하기 위해 통상적인 H & E 염색을 하였다.

결     과

Western blot
   Na^＋ channel의 I형과 II형에 해당하는 단백질의 띠(230 kDa, ≒220~270 kDa)가 동일한 위치에 존재함을 관찰하였다(Fig. 1).

면역조직화학염색
   Preyer 양성 반응을 가진 백색 기니픽의 와우를 면역조직화학적 염색을 통해 Na^＋ channel I형과 II형의 항체를 관찰하였다. Na^＋ channel I형과 II형 항체 모두에서 중간세포에서는 강양성을, 중간세포를 제외한 혈관선조에서는 약양성 반응이 관찰되었다(Figs. 3 and 4). 양성 대조군의 나선신경절세포 역시 I형과 II형 항체 모두에서 강하게 염색됨을 보였다(Fig. 5).

고     찰

   와우에서 기계적 자극을 신경으로 전달하는 기전은 내림프의 높은 K^＋과 낮은 Na^＋ 농도에 의존하며, 혈관선조에서의 Na^＋, K^＋, Cl^-와 여러 이온들의 이동은 주로 변연세포의 이온 수송능에 의해 좌우된다.⁵⁾
   와우 외측벽에서의 이온 수송과 내림프 전위에 대한 연구는 Kobayashi 등¹⁾이 Na^＋,K^＋-ATPase가 변연세포의 기저외측 세포막에 존재한다고 보고한 후, Na^＋,K^＋-ATPase와 adenylate cyclase 및 carbonic anhydrase에 의해 내림프에서 고농도의 K^＋이 유지되는 것으로 알려져 있다.⁶⁾ 이에 대한 기전으로는 ‘two-pump model’, ‘single-pump model’과 ‘two-cell model’ 등의 3가지 가설이 제기되며, 이는 모두 와우관과 접하고 있는 변연세포의 기저외측 세포막에 존재하는 Na^＋,K^＋-ATPase에 근거하고 있다.⁷⁾
   Na^＋은 Offner 등⁴⁾의 ‘single-cell model’에 기초를 두어 Na^＋,K^＋-ATPase에 의해 K^＋과 함께 양성 내림프 전위를 유지하는데, 와우관에서 변연세포 쪽으로 Na^＋의 수동적 흡수와 함께 변연세포에서 와우관 쪽으로 K^＋이 배출된다. 이는 변연세포의 와우관쪽에 존재하는 Na^＋ pump(혹은 Na＋-selective channels)를 통해 이루어 진다고 하였다. 그러나 변연세포에서 Cl- channel이 발견된 뒤,⁸⁾ ‘two-cell model’의 가설이 보고되어 기저세포의 K^＋ conductance와 중간세포에서 기능적 보완에 의해 직류전위가 생성됨을 보고하였다.⁹⁾
   나선인대의 섬유세포는 이온 수송 세포의 망상구조를 형성하여 내림프로부터 K^＋ 확산에 반하여 이온 농도차를 유지시키거나, 외림프에서 내림프로 K^＋의 재순환을 촉진하게 한다. 나선인대에 존재하는 5개의 섬유세포군들은 세포의 모양, 수송능력, 위치, 그리고 이온 수송효소의 종류에 따라 구별된다.⁵⁾ 혈관선조에서의 tight junction으로 연결된 기저세포 자체는 Na^＋,K^＋-ATPase를 포함하지는 않으나, 기저세포, 나선인대의 섬유세포와 중간세포 및 intrastrial space는 서로 gap junction으로 연결되어 있고, 외림프액과 같은 조성이어서 K＋의 농도차이에 의하여 이온 수송에 관여하고 있으며,⁷⁾ 이는 혈관선조 주변 구조간에 80~100 mV의 전압 차이를 유지 조절하는 기본적인 해부생리학적 근간을 이루고 있다.¹⁰⁾
   본 연구에서 전압 의존성 Na^＋ channels이 중간세포에서 강양성 반응을, 중간세포 이외의 혈관선조에서 약양성 반응을 보인 것은 섬유세포-intrastrial space-와우관 사이의 전압차이에 의한 자유 교통로로 중간세포가 주작용을 하는 것으로 보여지며, 변연세포와 기저세포가 각각의 channel을 통해 중간세포를 도와주는 기능을 한다고 생각된다.
   전기신호를 생성하는 ion channel은 크게 γ-aminobutyric acid(GABA) 수용체와 같은 ligand-gated ion channel과 Na^＋, K^＋ 등의 voltage-sensitive ion chanel로 나뉘어 지는데, 전자는 chemical synapse에서 ion conductance를 증가시키고, 후자는 흥분된 세포의 활동전위 도중에 이온 투과성을 변화시키게 된다.¹¹⁾ 흥분된 세포의 활동전위는 3기로 나뉘는데, 1기는 빠른 voltage-sensitive Na^＋ channel에 의해 Na^＋ 투과성의 증가로 Na^＋이 세포내로 유입되어 탈분극을 일으켜 활동전위가 발생하고, 2기는 활동전위 도중에 voltage-sensitive Ca^2＋ channel에 의해 second messenger로서의 Ca^2＋이 세포내로 유입되며, 3기는 voltage-sensitive K^＋ channel에 의해 K^＋이 세포외로 배출되는 과정으로 이루어진다. 또한 활성화와 불활성화는 millisecond time 동안에 이온 수송능이 조절된다.¹²⁾
   Voltage-gated ion channels은 세포막의 전기신호 발생에 기여하는 이온 통로로서 세포막이 탈분극되면 channel이 열리며, 그의 종류로는 Na^＋, K^＋, Ca^2＋ channel 등이 존재한다.¹³⁾¹⁴⁾ 이들은 구조적으로 서로 매우 유사하며, 전압의 변화를 감지하는 S4 α helices가 있고, H5 porelining sequences에 의하여 이동하는 이온의 종류가 결정된다. 이중 voltage-gated Na^＋ channel은 1,820개의 아미노산으로 구성된 단일형의 subunit로 구성되며, 이는 다시 4개의 domain으로 구성된다.¹³⁾ 각각의 domain은 세포막에서 pseudo-symmetrical 구조로 배열되어 있으며, 이 단일형의 α subunit는 다시 α과 α1의 아형으로 나뉘어지며, 이에 의하여 voltage-gated Na^＋ channel I형과 II형으로 분류한다.¹⁴⁾¹⁵⁾ 부속 subunit로 이온 통로의 여닫음과 전압을 감지하는 α subunit에 영향을 미치는 β1, β2 subunit가 있으며, α subunit는 분자량이 260 kDa이고, β subunit는 약 38 kDa에 이르며, 서로가 disulfide bond로 단단하게 연결되어 있다.¹⁶⁾¹⁷⁾
   선택적 Na^＋ channel은 상피세포 표면에 존재하는 형과 신경과 근조직에 존재하는 형으로 나뉘는데 후자가 voltage-gated type으로서,18) 이는 신경과 근육에서 활동전위 전파에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.¹⁰⁾ 본 연구에서 양성 대조군으로 사용한 나선신경절세포에서 강양성 반응을 보인 것은 Na^＋ channel의 활동전위막이 신경세포에서 존재하는 것으로 생각이 된다.
   상피세포에서 Na^＋ 수송을 담당하는 효소들은 amiloride-sensitive 한데, 대표적으로 Na^＋, K^＋-ATPase와 Na^＋-H^＋ exchanger 및 Na^＋-Ca^2＋ exchanger 등이 있으나, 전압 의존성 Na^＋ channel은 이와는 관계없는 생리적 기능을 가지고 있다.
   Witt 등¹⁹⁾은 포유류의 외유모세포에서 생리적 기능이 없는 Na^＋ channel의 존재를 보고하였고, Furness 등²⁰⁾은 와우 감각상피세포의 부동섬모에서 amiloride와 dihydrostreptomycin에 의해 차단되는 Na^＋ channel에 대한 보고가 있었으나, 기니픽의 와우에서 전압 의존성 Na^＋ channel의 존재여부에 대한 연구는 아직 보고된 바가 없었다.
   변연세포의 기저외측 세포막에 Na^＋,K^＋-ATPase가 풍부하게 존재한다고 알려져 있으나,⁷⁾ 본 연구에서는 Na^＋ channel I형과 II형에서 약양성반응을 보여 혈관선조에서의 선택적 Na＋ channel과 비선택적 channel 역시 동시에 존재함이 다른 보고¹⁸⁾의 결과를 뒷받침한다고 생각된다. 그러나 나선인대 섬유세포들에서의 Na^＋, K^＋-ATPase 발현과 Na^＋ channel 발현 사이의 연관성에 대해서는 서로의 기능이 달라 Na^＋,K^＋-ATPase의 아형에 따른 분포와 함께 세포생리학적 연구가 뒷받침되어야 할 것으로 생각된다.
   또한 Na^＋, K^＋-ATPase와 carbonic anhydrase가 양성 반응을 보인 나선연세포 역시 내림프계의 이온 수송과 항상성을 유지하는 기관으로 알려져 있지만 Na^＋ channel과 어떤 관련이 있는 지는 향후 지속적인 연구가 있어야 하겠다. 그리고 혈관선조 내의 모든 중간세포에서 강하게 발현되지 않은 이유는 전압 의존성 Na^＋ channel 자체의 양이 매우 적고, 세포내에서 존재하는 시간이 짧기 때문이라고 생각되며, 중간세포의 분리와 배양이 어렵지만 patch clamp 기법을 이용한 세포연구 결과가 뒷받침되어야 하겠다.
   또한 본 연구에서는 기저세포의 염색이 불분명한데, 이는 DAB 혹은 AEC를 이용한 통상적인 염색방법으로는 위음성과 위양성 반응이 서로 공존하여 결론에 이르지 못하였으나, 감수성이 높은 FITC를 사용하여 본 결과에 도달하였으므로, 향후 잘 정제된 단클론 일차 항체나 그에 상응하는 조합실험이 시도되어야 하겠다.

결     론

   정상 백색 기니픽의 와우를 Western blot과 면역조직화학적 염색을 통해 Na^＋ channel I형과 II형의 항체를 관찰한 결과, Na^＋ channel I형과 II형 항체는 와우 외측벽의 혈관선조에서 약양성 반응을, 중간세포에서 강양성 반응을 보였다. 이는 와우 외측벽에서는 전위차에 의한 Na^＋의 이동이 중간세포에서 가장 두드러지고, 변연세포 역시 적은 양이 이동됨을 추측케 한다.
   본 연구를 통해 앞으로는 중간세포에서 전압의존성 Na^＋ channel의 기능이 세포생리학적으로 증명되어야 하겠고, 기저세포에서의 전압 의존성 Na^＋ channel의 발현 유무와 함께 혈관선조 및 나선인대의 섬유세포들에 존재하는 선택적 및 비선택적 Na^＋ channel과 Na^＋,K^＋-ATPase 사이의 연관성에 대해서 보다 명확한 연구가 필요하겠다.

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