교신저자：이병돈, 140-743 서울 용산구 한남동 657-58  순천향대학교 의과대학 부속병원 이비인후과학교실
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서     론

   호르몬, 신경전달물질, 항원, 성장인자 및 생물학적 활성 물질 등과 같은 세포외 자극이 세포내로 이동하여 생리적 반응을 일으키는 과정 중의 하나인 transmembrane signalling에는 inositol-1,4,5-triphosphate(IP₃), diacylglycerol(DG) 및 cAMP 등과 같은 second messenger에 의해 조절되는 protein kinase가 중요한 역할을 담당하고 있다.¹⁾
   Protein kinase C(이하 PKC)는 세포의 신호전달(cellular signal transduction)에 참여하여 내분비, 외분비, 신경전달물질의 분비, 이온전도(ionic conductance)의 조정, 세포외 유출, 유전자 발현 및 세포 증식 등의 다양한 세포 기능을 나타내는데,¹⁾ 와우 유모세포에서는 Na⁺-H⁺ exchange(NHE)와 Ca²⁺ channel에 의한 'slow motility'를 일으키고,²⁾ 지지세포에서는 기계적 반응과 세포 증식 및 분열에,³⁾ 그리고 외측벽(혈관선조 및 나선인대)에서는 KCNE1,⁴⁾ Na⁺/K⁺-ATPase와 작용하여 내림프액을 생성할 것으로 생각되나¹⁾ 명확한 기전에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.
   저자들은 백색 기니픽 와우에서 면역조직화학염색을 통해 PKC 아형의 발현과 분포를 통해 신호전달체계의 관계를 알아보고자 하였다. 

재료 및 방법

   Preyer 양성 반응과 고막 및 중이가 정상인 300~400 gm의 백색 기니픽 10마리의 와우를 사용하였다. pentothal sodium 8 ml로 복강내 마취를 한 후 흉곽을 열고 0.1 M phosphate buffered saline(이하 PBS)과 4% paraformaldehyde를 좌심실을 통해 관류 고정시킨 뒤 단두 후 골포를 열고 등골을 적출하였다. 난원창과 정원창을 통해 4% paraformaldehyde 1 ml를 천천히 주입하고 24시간 동안 동일 고정액으로 와우를 재고정하였다.
   통상적인 파라핀 포매 후, 6 μm 두께로 종단하여 aminoprophyl coated APS slide에 부착시켰다. 또한 surface preparation 기법을 이용하기 위해 재고정한 와우를 실체 줌 현미경 하에서 미세수술기구와 drill을 사용하여 와우 조직이 손상되지 않도록 외측 골벽과 외측벽을 조심스럽게 제거하였다.
   면역조직화학 염색은 ABC 법을 이용하였으며, PKC α(mouse anti-PKC α, Santa Cruz Bio., USA), β(mouse anti-PKC β, Zymed, CA, USA), γ(mouse anti-PKC γ, Zymed, CA, USA)와 δ(mouse anti-PKC δ, Transduction Lab., Lexington, KY, USA)를 각각 1：75, 1：25 및 1：300으로 희석하여 4℃에서 16시간 처리한 후에, 그에 맞는 2차 항체(multi-species reagent, biotinylated anti-mouse and rabbit immunoglobulin, Signet laboratories, Dedham, MA, USA)를 사용하여 30분간 배양하였다. DAB(3,3-diaminobenzidine-tetra-hydrochloride)용액으로 현미경하에서 발색을 확인한 후 봉합하였다. 
   Surface preparation 기법을 이용하여 감각상피의 표면을 관찰하기 위해 상기와 같은 방법으로 면역조직화학적 염색을 시행한 후, 개막을 분리하고 와우 감각상피를 한 회전씩 잘라낸 후 현미경 하에서 관찰하였다. 음성 대조 염색은 1차 항체를 생략하였다. 

결     과

   파라핀 절편을 이용한 면역조직화학염색에서 와우 감각상피세포 중에서 내유모세포와 외유모세포에서 PKC α 항체에 강한 양성 면역반응을 보였으나(Fig. 1 Left), 그 이외에 PKC β, γ 및 δ의 항체에는 발현되지 않았다(Figs. 1 Right and 2). 또한 와우 중간 회전 부위 외측벽에서 II형 섬유세포와 suprastrial cells이 PKC δ 항체에 강한 양성 면역반응을 관찰하였으나(Fig. 2 Right), PKC α, β 및 γ 항체에는 발현되지 않았다(Figs. 1 and 2 Left).
   Surface preparation 기법을 이용한 면역조직화학염색에서는 내유모세포와 외유모세포의 세포질에서 각각의 세포막 내벽에 다수의 점들로 구성된 양성 반응을 보였다(Fig. 3).
   양성대조군의 면역조직화학염색에서 청신경 섬유 및 나선신경절에서 PKC α 항체의 강한 양성 반응을(Fig. 4), 청신경 섬유의 혈관벽에서 PKC δ 항체에 강한 양성 반응을 확인하였다(Fig. 5).

고     찰

   와우는 유모세포에서 sensory-mechanotransducer의 역할을 담당하고, 외측벽에서는 림프액을 생성하여 전기화학적 평형을 이룸과 동시에 유모세포에 산소와 에너지를 공급하여 내이의 양성 와우내 전압을 유지시킨다. 위의 생리적 청각신호를 전달하는 세포의 매개물질로는 Ca²⁺ 이온과 IP₃ 및 DG와 같이 second messengers에 조절되는 phospholipase C(PLC), PKC와 성장인자 등의 다양한 단백질군이 있다.⁵⁾
   PKC는 10개의 아형이 존재하는데 α, β, γ는 활성화하는데 DG가 필요한 classical enzyme이고 C₂ region이 없는 δ, ε, ζ은 효소작용에 Ca²⁺을 필요로 하지 않는다. PLC는 inositol phospholipids를 가수분해하여 세포막에서 DG를 증가시켜 PKC를 활성화시키는데, 이 같은 신호전달은 세포의 성장 조절에 중요한 역할을 담당한다. 특히 세포내로 호르몬과 신경전달물질을 이동시키거나 분비를 촉진시키고, Na⁺/K⁺-ATPase와 Na⁺-H⁺ exchange 등의 이온 전도를 매개하며, 세포내 대사물질의 분비와 유리, 부신피질호르몬의 대사과정, 유전자 발현 및 세포 증식에 참여한다.¹⁾⁶⁾ 복잡하고 다양한 PKC의 기능 중에서 positive forward action은 'short term response'로서 Na⁺/K⁺-ATPase와 Cl^--channel, KCNE1 등의 Ca²⁺ 이동과 K⁺ 이온 전도를 조절하고, negative feedback role은 'long term response'로 상피성장인자(epidermal growth factor)가 PKC에 의해 인산화되어 세포 증식과 분화를 일으킨다. 
   와우에서 PKC α는 내외유모세포에서, δ는 혈관선조에서, γ는 inner spiral bundle의 신경섬유에서 발현됨을 보았고, 외측벽의 변연세포에서 K⁺ channel을 억제하며, β와 δ는 발현되지 않았다고 보고하였다.⁷⁾⁸⁾
   저자들의 실험에서 PKC α는 내유모세포와 외유모세포의 세포질에서 양성 반응을 보여 Ueda 등⁸⁾의 보고와 일치함을 보였고, 특히 고배율에서 세포막의 내측벽에 다수의 점으로 구성된 양상이 관찰되어 PKC의 작용 부위가 세포 내측 막임을 확인할 수 있었다. 따라서 PKC가 ion channel의 조절로 pH를 변화시켜 외유모세포의 모양 변화에 의해 Ca²⁺-induced slow motile response를 일으킨다고 생각된다. 또한 cation(K⁺, Na⁺, Ca²⁺)의 이동에 영향을 미쳐 내유모세포의 기저외측막(basolateral surface)에서 synaptic depolarization을 증가시켜 neural transmission의 활동성이 증가된다는 보고⁹⁾와 일치한다고 생각된다. PKC δ가 II형 섬유세포와 suprastrial cells에서 양성 반응을 보이는 결과는 나선인대의 세포들에 Na⁺/K⁺-ATPase가 풍부하다는 사실¹⁰⁾에 기초를 두어 ionic gradient를 유지하기위해 내림프강으로부터 K⁺을 효과적으로 흡수하게 되는 fluid transport의 역할을 담당하리라 생각하며, spiral limbus나 혈관선조에서는 발현되지 않았음은 타 보고자의 결과와 일치하지 않아 앞으로 규명해야 될 것으로 생각한다. 기니픽의 지지세포에서 성장인자 수용체가 발현되었다는 보고³⁾에 의해 아마도 와우 감각상피가 손상된 후 지지세포가 감각상피세포의 기능을 대신하게 될 것이라는 추론에서 PKC가 지지세포에서 발현되지 않았다는 사실은 PKC의 positive forward action 중의 하나인 'long term response'가 와우 감각상피세포의 재생과 분화에는 참여하지 않는다고 생각된다. 또한 δ는 PKC의 고유 기능인 C₂ region이 없으므로 second messenger와 같은 효소작용을 필요로 하지 않아 와우에서 와우 전도와 Ca²⁺의 이동과는 관계없으리라 보이며, β는 다른 보고자의 보고에서도 발현되지 않아 본 결과와 동일함을 알 수 있었다. 그러나 γ와 δ의 결과가 다른 보고자와 서로 상이한 것은 앞으로 연구해야 할 과제라고 생각된다. 

결     론

   정상 중이를 가진 백색 기니픽의 와우를 대상으로 파라핀 포매 조직과 surface preparation 기법을 이용하여 면역조직화학검사를 시행하여 protein kinase C 아형의(α, β, γ, δ) 발현을 관찰하였다.
   와우 감각상피에서는 내유모세포와 외유모세포에서 PKC α가 양성 반응이 발현됨을 확인하였다. 이러한 결과는 PKC α가 유모세포의 electromechanical transduction에 참여할 것으로 생각된다. PKC δ는 나선인대의 II형 섬유세포와 suprastrial cells에서 양성 반응을 보이는 것은 외림프의 흡수와 내림프의 생성에 중요한 역할이 있을 것으로 생각된다. 따라서 백색 기니픽의 와우에서 PKC의 아형은 각 세포에 따라 독립적이며, 기능 또한 다르다는 것을 암시하며, 아형 중 α와 δ가 신호전달계에 참여하는 것으로 보여 이에 대한 전향적인 세포생리학적 연구가 필요하겠다.

1. Nishizuka Y. Studies and perspectives of protein kinase C. Science 1986;33:305-12.

2. Pujol R, Zajic G, Dulon D, Raphael Y, Altschuler R, Schacht J. First appearance and development of motile properties in outer hair cells isolated from guinea-pig cochlea. Hear Res 1991;57:129-41.

3. Lee BD, Park YJ, Ahn HY, Chang HS, Kang JW. Expression of receptor tyrosine kinases in the guinea pig cochlea. Korean J Otolaryngol 1998;41:971-5.

4. Marcus DC, Sunose H, Liu J, Bennet T, Shen Z, Scofield M, et al. Protein kinase C mediates P2U purinergeic receptor inhibition of K+ channel in apical membrane of strial marginal cells. Hear Res 1998;115:82-92.

5. Dallos P, Popper AN, Fay RR. The cochlea. New York: Spiringer-Verlag New York, Inc;1996.

6. Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase C and its implications for cellular regulation. Nature 1988;334:661-5.

7. Agrup C, Bagger-Sjoback D, Fryckstedt J. Protein kinase and protein phosphatase presence in the stria vascularis. Pflugers Arch 1997;433:603-8.

8. Ueda N, Ikeda K, Oshima T, Adachi M, Furukawa M, Takasaka T. Subcellular distribution of protein kinase C in the living outer hair cell of the guinea pig cochlea. Hear Res 1996;94:24-30.

9. Howard J, Roberts WM, Hudspeth AJ. Mechanoelectrical transduction by hair cells. Annu Rev Biophysis Biochem 1988;17:99-124.

10. Spicer SS, Schulte BA. Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity. Hear Res 1991;56:53-64.