교신저자：윤주헌, 120-749 서울 서대문구 신촌동 134 연세대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비용은 점액과분비를 유발하는 대표적 질환으로, 비강 및 부비동의 만성염증에 의해 나타나며 미국에서는 전 인구의 약 4%에서 발생하는 것으로 알려져 있다.¹⁾ 비용에서의 점액과분비는 비용 상피세포 자체가 직접 점액 과분비에 참여하기도 하며, 이차적으로 부비동의 배설구를 막음으로써 부비동염에 의하여 점액 과분비가 유발되기도 한다. 또한 이러한 점액과분비는 염증성 반응을 촉진한다.
   따라서 비용이 동반된 만성 부비동염에서 중요한 역할을 하는 주요 점액 유전자의 조절을 이해하는 것은 만성 부비동염의 병태 생리의 이해와 치료에 새로운 장을 열 수 있다는 점에서 매우 중요하지만 아직 그에 대한 연구는 미흡한 실정이다.
   지금까지 점액유전자는 12개가 밝혀져 있는데, 이중 MU-C1, MUC3, MUC4, MUC11, MUC12 등은 막성 점액이며, 만성 염증시 나타나는 점액 과분비에는 MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6,7,8,9 등의 분비 점액이 더 중요한 것으로 알려져 있다.^2)3)4)5)6) 이 중 MUC5AC는 하기도에서의 가장 중요한 분비 점액유전자로 밝혀져 있다.⁷⁾ 그러나 또한 비용에서 역전사 중합반응을 통해 다른 점액유전자는 큰 변화가 없었으나 MUC8 mRNA가 현저하게 증가되어 있어⁸⁾ 점액과분비 혹은 비용의 형성에 관여하는 주요 점액유전자일 가능성을 제시하였다.
   현재까지 MUC5AC는 호흡상피의 배세포에서 발현되는 주요 점액으로 보고되고 있으나⁹⁾ MUC8 mRNA는에 대하여서는 어느 세포의 어느 위치에 발현되는지 밝혀진 바가 없다.
   따라서 본 연구에서는, 비용에서 MUC5AC mRNA와 MUC8 mRNA의 발현위치를 알아보고자 한다.

대상 및 방법

대  상
   비용은 알레르기의 병력이 없고 수술 전 약물치료를 받지 않은 비용을 동반한 만성부비동염 환자 6명(평균나이：32.5세)을 수술시 채취하였다. 대조군으로는 역시 알레르기의 병력이 없고 수술 전 약물치료를 받지 않은 만성부비동염 환자 중 컴퓨터 단층촬영과 수술시 육안상, 후사골동 점막에 염증이 없는 6명에서(평균나이：35.7세) 수술시 후사골동 점막을 채취하였다.

방  법

Tissues preparation
   조직들은 채취한 즉시 PBS/DEPC 완충액으로 만든 4% 파라포름알데히드 고정액에 4°C에서 24시간 이상 고정후 12%와 18% sucrose 용액으로 처리하였다. Sterile conditions하에서 10 μm의 두께로 절편후 poly-L-lysine이 코팅된 슬라이드에 올려놓았다.

PAS staining
   점액분비세포 즉 배세포임을 확인하기 위하여 Periodic acid Schiff(PAS) 염색을 시행하였고 연속절편에서 MUC5 AC와 MUC8 mRNA의 in situ hybridization을 시행하였다.

In Situ Hybridization
   Preparation of riboprobe：제작자의 방법에 따라 20 μl의 반응 혼합물내에서 digoxigenin(DIG)이 연결된 UTP하에서 Sp6와 T7 RNA polymerases를 사용하여 in vitro transcription을 통해 MUC8의 antisense probe와 sense RNA probe를 각각 제작하였다.
   Preparation of oligoprobe：MUC5AC 유전자에서 디자인한 oligonucleotide를 37°C에서 15분간 terminal transf-erase tailing reaction을 시켜 dATP를 표지하였다.
   In Situ Hybridization：다음과 같은 probes를 이용하였다. MUC8(riboprobe)：forward-ACA GGG TTT CTC CTC ATT G, reverse-CGT TTA TTC CAG CAC TGT TC(EMBL Accession number U14383) MUC5AC(oligoprobe)：5'-AGG GGC AGA AGT TGT GCT GGT TGT GGG AGC AGA GGT TGT GCT GGT TGT3'(EMBL Accession number Z34277). 조직을 4% PFA에서 30분간 고정후 1 μg/ml DIG-labelled cRNA가 포함된 hybridization buffer를 이용하여 56°C에서 반응시켰다. 이때 Buffer의 구성은 50% formamide, 5×SSC 그리고 40 μg/ml ssDNA를 포함시켰다. Hybridization 후에 조직절편을 2×SSC와 0.1×SSC에 1시간 세척하였다. 이후 조직절편을 항DIG Fab 항체에 2시간 반응시킨후 nitroblue tetrazolium chloride(NBT)와 5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate(BCIP)로 발색을 확인하였다.

결     과

MUC5AC mRNA의 발현
   MUC5AC mRNA는 비용조직에서는 상피세포에서 주로 배세포의 세포질에서 강하게 발현이 되었으며 점막하 선조직에서는 거의 발현이 되지 않았다(Fig. 1A-D). 알러젠이나 유해성가스 등 외부로부터 거의 영향을 받지 않는 후사골동 점막에서는 상피세포나 점막하 선조직에서 거의 발현이 되지를 않았다(Fig. 1E-H). Sense probe을 이용한 음성대조군에서는 전혀 발현되지 않았다.

MUC8 mRNA의 발현
   MUC8 mRNA는 비용 상피에서 배세포, 일부 섬모세포와 기저세포에서 발현되었다. 특히 배세포의 경우 핵에 강하게, 배세포의 세포질에 약하게 발현되었고 점막하 선조직에서도 주로 핵에서 약하게 발현이 되었다(Fig. 2A-D). 반면 후사골동 점막에서는 상피세포와 점막하 선조직에서 거의 발현이 되지 않았다(Fig. 2E-H). Sense probe을 이용한 음성대조군에서는 전혀 발현되지 않았다.

고     찰

   지금까지 밝혀진 주요 점액유전자의 발현위치는 MUC2, MUC5AC mRNA가 주로 배세포에서,⁹⁾ MUC5B, MUC7 mRNA는 점막하 선세포에서 발현된다고 보고되고 있으나,¹⁰⁾ MUC8 m-RNA는 폐에서 그 발현되는 위치를 알아내고자 하였으나 실패하였다.¹¹⁾
   MUC5AC는 그 동안 호흡기계에서는 주로 하기도에서 발현의 위치가 연구되었는데, 인체 태아에서는 상피세포와 함께 일부 점막하 선조직의 선 입구와(neck of submucosal gland) 관(duct)에서 발현된다는 보고는 있었으나⁹⁾¹¹⁾ 어른에서는 모두 상피세포에 국한되어 발현된다고 하였다.¹²⁾¹³⁾ 한편 Buisine 등⁹⁾은 하기도 상피의 모든 배세포에서 MUC5AC가 발현된다고 하였다. 상기도에서의 발현위치에 대한 보고는 하비갑개의 상피세포에 국한되어 MUC5AC가 발현된다는 보고가 유일하며¹⁴⁾ 어떤 세포의 어느부위에 구체적으로 발현되는지는 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 비용조직에서 MUC5AC의 발현이 점막하 선조직보다는 상피세포에 국한되어 발현되어 기존의 연구¹²⁾¹³⁾와 일치하였으며 이는 상피세포 중 주로 배세포에 발현하였다.
   반면 MUC8은 지금까지 그 발현의 위치에 대하여 보고된 적은 없으며 Jung 등¹⁵⁾이 역전사중합반응을 통해 만성사골동염의 점막에서 MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC7, 그리고 MUC8 이 주로 발현된다고 보고하였다. 본 연구에서는 비용조직에서 MUC8 mRNA의 발현위치를 알아낼 수 있었다. 정상 후사골동 점막에서는 MUC8 mRNA의 발현을 관찰할 수 없었으나 비용 표면상피의 배세포, 일부 섬모세포, 및 기저세포와 점막하 선조직에서 발현이 되었으며 배세포의 경우 세포질보다는 핵에 더 강하게 발현되었다. 이는 폐의 점막상피에서 MUC8 mRNA가 발현되지 않고,¹¹⁾ MUC8 점액 단백질만이 인체의 기관 점막하 선조직에서 발현된다는 기존 연구결과와¹⁶⁾ 달랐다. 이러한 결과는 상기도와 하기도 점막의 점액유전자 발현양상이 다를 수 있다는 것을 암시한다. 이로써 MUC8 mRNA도 배세포에서 발현되는 중요한 점액유전자의 하나라는 것을 알 수 있었다.
   그러나 분비점액 자체를 만들어내는 세포질에서 MUC5AC mRNA가 주로 발현되는 것과는 달리 MUC8 mRNA가 왜 핵에서 세포질보다 강하게 나타나는 지는 현재로서는 명확하지 않다. 생각할 수 있는 기전으로는 첫째, 세포질에서 MUC8 mRNA의 안정성이 약하여 빨리 분해되거나 단백질로 번역(translation)되었을 가능성이 있고, 둘째, 핵에서 비효율적인 RNA splicing이나 mRNA의 세포질로의 이동장애가 원인이 될 수 있으리라 생각한다.

결     론

   MUC8 mRNA는 MUC5AC와 배세포의 세포질에서 동시 발현되며 비용상피의 배세포에서 발현되는 중요한 점액유전자의 하나일 것으로 생각한다.

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