교신저자：송병호, 431-070 경기도 안양시 동안구 평촌동 896번지 한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   Cisplatin은 두경부의 악성종양을 포함한 여러 악성종양의 치료를 위하여 사용되고 있는 효과적인 항암제이다. 그러나, 신독성, 이독성, 신경염 등의 잘 알려진 부작용으로 용량에 비례하는 치료효과에도 불구하고 사용이 제한되어 왔다. Cisplatin에 의한 급성 또는 만성의 이독성에서 와우의 다양한 세포들의 변성이 관찰되어 왔다. 이독성 효과로 와우의 코르티기관과 혈관조에 형태학적 그리고 기능적인 변화를 일으킨다.¹⁾²⁾ 외유모세포가 우선적으로 손상을 받으며, 내유모세포, 지주세포, Deiter 세포와 같은 지지세포, Hensen 세포, Claudius 세포, 혈관조 그리고 나선신경절에서의 세포손상이 보고되어 있다.
   Cisplatin에 의한 이독성반응에서 생화학적으로 먼저 일어나는 반응은 단백합성의 억제이다.³⁾ 그 외 세포막의 과산화,⁴⁾ 미토콘드리아의 기능장애,⁵⁾ DNA의 손상⁶⁾ 등의 기전이 제안되어 있다. 또한, 항산화효소의 활성도의 변화, malonialdehyde의 증가, 와우의 glutathione의 감소 등은 cisplatin 이독성에서 반응성 산소의 역할을 시사한다고 할 수 있다.⁷⁾ 항산화효소의 활성도를 변화시키는 cisplatin은 종양세포,⁸⁾ 신장⁹⁾ 그리고 와우¹⁰⁾에서 apoptosis를 유발하는 것으로 보고되고 있다. Apoptosis는 형태학적으로 핵의 농축과 분절을 보이고 생화학적으로도 DNA가 180 base pair 배수의 nucleosome으로 분절되는 특성을 보이는 세포사멸의 기전으로서, Alam 등은 cisplatin이 와우에서 산화 스트레스와 그로 인해 발생하는 세포질의 Ca^2＋에 의해서 apoptosis를 유발한다고 제안하였다.¹⁰⁾
   전암유전자(proto-oncogene) 중에서 Bcl-2 family는 세포사멸을 조절하는 특이 단백들을 encode한다. Bax 단백은 apoptosis를 항진시키는 반면, Bcl-2 단백은 여러 조건 속에서 다양한 세포들의 apoptosis를 억제한다. 두 단백의 발현과 발현비율이 세포사멸의 조절 역할을 하게 된다. 그러나, cisplatin에 의한 와우의 급성 이독성에서는 Bcl-2 단백의 발현에 대한 연구가 거의 없는 실정이다.
   본 연구에서는 cisplatin에 의한 급성 이독성에 있어서 Bax 및 Bcl-2 단백의 발현이 apoptosis를 조절하는 기전을 밝혀 보고자 하였다. 이를 위하여 백서에 고용량의 cisplatin을 복강내주사하고, 와우에서 apoptosis가 일어남을 확인하고, 시간경과에 따른 Bax와 Bcl-2 단백의 발현을 면역조직화학염색과 단백면역전기영동으로써 관찰하였다.

재료 및 방법

실험동물 및 cisplatin 주사
   Preyer 반사 양성인 수컷 Sprague-Dawley 백서(200~250 g) 28마리를 사용하였다. Cisplatin의 용량은 20 mg/kg으로 하였다. 실험군은 복강내 주사후 경과한 시간에 따라 6시간(6마리), 12시간(6마리), 그리고 24시간(6마리)의 3군으로 나누었다. 대조군(6마리)은 같은 양의 생리식염수를 주사하고 12시간 후에 조직을 채취하였다. 실험동물은 미국의 Institute of Laboratory Animal Resources와 Commission on Life Sciences and National Research Council의 실험동물관리지침에 따라 관리하였고, 서울대학교병원 임상의학연구소의 동물실험지침에 따라 실험을 진행하였다.

조직절편준비
   각 군에서 2마리의 백서로부터 4개의 와우를 채취하여 면역조직화학염색과 TUNEL 염색을 위한 절편을 만들었다. 실험군은 cisplatin을 주사하고 6, 12, 24시간후에 sodium pentobarbital(50 mg/kg)을 복강내주사하고, 4% paraformaldehyde를 심장관류하여 생체고정하였다. 분리한 측두골을 하루동안 4% paraformaldehyde에서 고정시켰다. 8% EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid)에서 7일간 탈석회화하고 와우축 중심부의 방향을 잘 알 수 있도록 위치를 정한 다음에 파라핀에 포매하였다. 각각의 와우에서 4 μm 두께의 절편들을 와우축 중심부에서 얻었다. 대조군에서도 같은 방법으로 와우축 중심부의 절편을 얻었다.

TUNEL 염색
   각 실험군과 대조군에서 와우축 중심부의 조직절편을 얻어 ApopTag Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit(Intergen, NY, USA)를 이용하여 TUNEL 염색을 하였다.
   슬라이드를 xylene으로 2회 세척하여 파라핀을 제거한 후에 100%, 95%, 90%, 80%, 70%의 ethanol에 순차적으로 3분씩 세척하였다. Phosphate buffered saline(PBS)으로 5분간 세척한 후 20 μg/ml의 proteinase K를 슬라이드 위에 떨어뜨리고 실온에서 15분간 배양하였다. 증류수로 4회 세척한 후 실온에서 3% 과산화수소에 5분간 배양하여 배경염색을 제거하였다. 다시 PBS에 2번 세척한 후 kit에 준비된 평형 완충액 75 μl를 절편에 가하고 실온에서 15초간 배양하였다. 절편주위의 수분을 제거한 후에 working strength TdT enzyme을 절편에 가하고 섭씨 37도에서 1시간동안 반응시켰다. Working strength stop/wash 완충액이 담긴 용기에 절편을 담구어 15초간 흔들었다. 실온에서 10분간 배양한 후, 항 digoxigenin peroxidase conjugate를 절편에 가한 후에 실온에서 30분간 반응시켰다. 다시 PBS로 세척하고 수분을 제거한 후에 3-3'diaminobenzidine(DAB)을 절편에 가하여 10분간 발색시켰다. 발색 반응 후에 증류수로 3회 세척하고 5분간 증류수에서 배양하였다. 0.5%(w/v) methyl green에 10분간 반응시켜 대조 염색하였다. 그 후 절편을 증류수에 담구어 3회 세척하고 다시 100% n-butanol에서 3회 세척하였다. Xylene에서 2분씩 3회 탈수한 다음 permount를 절편위에 조심스럽게 떨어뜨리고 cover glass로 덮은 후 현미경으로 관찰하였다.
   10 μg/ml의 DNAse 1(Sigma-Aldrich corporation, St. Louis, MO, USA)을 실온에서 15분간 반응시킨 절편을 양성대조염색의 절편으로 하였으며, 음성대조염색을 위해서 working strength TdT enzyme만을 빼고 같은 방법으로 염색하였다.

Bax, Bcl-2 면역조직화학염색
   일차 항체로는 1：1000으로 희석한 단클론성 Bax 항체(Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)와 단클론성 Bcl-2 항체(Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 이용하였고, LSAB(labelled streptavidin biotin) system(DAKO corporation, Carpinteria, CA, USA)을 이용하여 면역조직화학염색을 하였다.
   슬라이드를 xylene으로 2회 세척하여 파라핀을 제거한 후에 100%, 95%, 90%, 80%, 70%의 ethanol에 순차적으로 3분씩 세척하고, 30분간 trypsin을 가하였다. 5분간 0.3% 과산화수소에서 배양하여 배경염색을 제거한 후 실온에서 2시간 동안 1차 항체에 배양하였다. 절편을 PBS로 세척하고 biotinylated goat antimouse 항체(DAKO corporation, Carpinteria, CA, USA)와 30분간 반응시켰다. 다시 PBS로 세척하고 streptavidin peroxidase conjugate를 10분간 반응시킨 후에 1：1000 DAB 용액에서 30 분간 반응시켰다. 발색반응 완료 후 hematoxylin으로 대조 염색하였다. 1차 항체 없이 염색을 하여 음성대조염색을 확인하였다.

단백면역전기영동
   단백면역전기영동을 두 번 시행하기 위하여 각 군당 4마리에서 와우를 채취하였다. 면역조직화학염색에서 사용한 단클론성 Bax 항체(Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)와 단클론성 Bcl-2항체(Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 1차 항체로 사용하였다.
   동물을 ether로 마취하고 두부를 절단한 후 측두골에서 와우를 신속히 채취하였다. 청신경을 제외한 막성 와우를 apoprotinin, leupeptin, trypsin inhibitor, phenylmethylsulfonyl fluoride가 들어 있는 lysis buffer(25 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)에 넣고 균질화하였다. 초음파처리를 한 후, 와우 균질액을 섭씨 4도에서 15,000 g로 20분간 원심분리하였다. 단백의 농도는 BCA kit(Pierce chemical company, Rockford, IL, USA)로 정량화하였다. 4개의 와우에서 얻어진 25 μg의 단백을 포함하는 부유물을 15% SDS-PAGE minigel에서 25 mA의 고정전류로 전기영동하였다. Polypeptide를 전이막인 Immobilon-P(Millipore corporation, Bedford, MA, USA)에 70 V에서 2시간동안 전이하였다. 차단용액(5% 탈지분유, 0.1% Tween-20, 137 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl, pH 7.6)으로 전이막의 비특이적 결합을 차단하고 1：50으로 희석한 Bax 항체(Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, USA)에 섭씨 4도에서 하룻밤동안 반응시켰다. 3회 세척한 후, 1：5,000으로 희석한 horseradish peroxidase(HRP)가 붙은 antimouse IgG 항체(Pierce chemical company, Rockford, IL, USA)에 2시간동안 상온에서 흔들면서 반응시켰다. 다시 세척한 후 ECL kit(Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK)를 이용하여 화학발광시켰다. Bcl-2 항체(Santa Cruz biotechnology, Santa Cruz, USA)에 대해서도 같은 방법으로 단백면역전기영동을 시행하였다.

청성뇌간유발전위검사(ABR)
   Sodium pentobarbital 50 mg/kg로 마취한 후 Bio-Logic system으로 1, 3, 8 kHz에서의 ABR 역치를 측정하였다. 실험군 2마리에서 먼저 역치를 측정한 후, cisplatin 20 mg/kg를 복강내주사하고 6, 12, 24시간 후에 역치를 측정하였다. 대조군은 같은 양의 생리식염수를 주사하였으며, 같은 방법으로 역치를 측정하였다.

결     과

TUNEL 염색
   코르티기관이나 와우의 외측벽과 나선신경절에서 변성(degeneration)된 세포는 관찰되지 않았다. TUNEL 염색의 음성대조 염색에서 염색된 핵은 없었고, 양성대조 슬라이드에서는 모든 핵이 양성으로 관찰되었다. 실험군인 6, 12, 24시간군의 절편에서는 양성세포가 관찰되었다. 대조군에서는 양성세포가 관찰되지 않았다. 코르티기관에서는 주로 외유모세포, 내유모세포, Deiter 세포들중에서 TUNEL 양성인 세포가 관찰되었으며, 일부 지주세포와 다른 지지세포에서도 양성세포들이 관찰되었다. 혈관조에서는 중간세포와 기저세포는 전혀 염색되지 않았으나, 변연세포는 많은 세포들이 양성으로 염색되었다. 전반적으로 염색양상은 6, 12, 24시간 사이에 차이는 없었다(Fig. 1).

면역조직화학염색
   Bax에 대한 면역조직화학염색에서 양성세포는 주로 혈관조, 외유모세포, 내유모세포, Deiter 세포에서 관찰되었으며, 6시간군과 12시간군에서만 관찰되었다. 외유모세포, 내유모세포, 그리고 Deiter 세포에서는 염색되지 않은 절편도 관찰되었다. Hensen 세포, Claudius 세포 그리고 지주세포 등은 염색되지 않았다. 대조군에서 염색된 세포는 관찰되지 않았다. 24시간군에서는 대조군과 마찬가지로 염색되지 않았다(Fig. 2).
   Bcl-2에 대한 면역조직화학염색에서도 6시간군과 12시간군에서 모든 절편에서 혈관조 전체가 Bcl-2에 대하여 강하게 염색이 되었다. 외유모세포, 내유모세포, 그리고 Deiter 세포에서는 염색되지 않은 절편도 관찰되었다. 와우의 회전부에 따른 차이는 별로 없었다(Fig. 3).

단백면역전기영동
   각 실험군과 대조군의 와우에서 추출한 단백에서 Bax와 Bcl-2의 발현을 관찰하였다. 24시간군에서의 발현은 대조군과 차이가 없었다. Bax는 6시간군에서 가장 많이 발현되었고, 점차 감소하였다. 대조적으로 Bcl-2는 12시간까지 계속 증가하고 24시간군에서 대조군과 같은 수준으로 감소하였다(Fig. 4).

청성뇌간유발전위검사
   생리식염수를 주사한 대조군 2마리에서는 24시간 동안 역치의 변화가 관찰되지 않았다. 실험군 2마리에서는 6시간 후에 30 dB 이상 증가한 역치가 그 후에는 큰 차이를 보이지 않았다(Fig. 5).

고     찰

   Cisplatin에 의한 종양세포의 세포독성 효과는 비가역적으로 DNA에 결합하여 이웃한 guanine 염기 사이에 유전자 가닥내의 교차결합(intrastrand crosslinks)을 형성하기 때문으로 여겨지고 있다.¹¹⁾ Cisplatin에 의한 종양세포의 세포독성은 apoptosis에 의하며, 실제로 그 세포들은 apoptosis의 생화학적, 형태학적 특징을 보여주고 있다. 또한 cisplatin과 함께 2시간 동안 배양된 고환생식세포종양주에서도 apoptosis가 일어나는 것으로 명확히 밝혀졌다.¹²⁾ Lau는 cisplatin에 의한 신독성에서 caspase-3의 활성도가 증가하고 연이어 유전자의 전기영동에서 apoptosis의 전형적인 ‘DNA 사다리 모양’을 관찰하였다고 보고하였다.⁹⁾
   이독성의 기전은 완전히 이해되고 있지는 않지만, Ravi 등은 cisplatin 투여후 항산화계의 변화와 유리기(free fadicals)의 생성에 의한다고 제안하였다.⁷⁾ Cisplatin의 세포독성효과는 부분적으로 반응성 산소(reactive oxygen species)의 생성과 유리기의 증가에 기인하고 있다. 또한 Ueda는 산화제에 노출된 신세뇨관 상피세포에서 DNA를 손상시켜 세포의 사멸을 일으키는 초기 단계에 속하는 endonuclease의 활성화를 보고하였다.¹³⁾ 
   이와 같은 결과로, cisplatin에 의한 이독성도 와우의 apoptosis에 의할 것이라고 유추할 수 있다. 최근, Alam 등은 ciplatin을 5일간 투여한 gerbil의 와우에서 cisplatin에 의해 유발된 apoptosis를 보고하였다.¹⁰⁾
   유모세포, 지지세포, 그리고 혈관조의 변성에 대해서는 많은 보고가 있지만 나선신경절에 대해서는 보고가 많지 않다. Hinojosa 등은 cisplatin 항암치료를 받은 환자의 측두골에서 주로 첨단회전부의 나선신경절 세포의 감소를 보고하였다.¹⁴⁾ Alam 등¹⁰⁾은 주로 기저회전부의 나선신경절에서 apoptosis를 관찰하였다고 하였으나, 급성 이독성에서의 apoptosis를 관찰한 본 연구에서는 나선신경절에서 apoptosis를 관찰할 수 없었다. 많은 다른 연구에서 나선신경절의 변성에 대해서는 보고가 없으며, 이는 나선신경절이 급성 이독성에 매우 저항이 크다는 것을 시사한다. Alam 등¹⁰⁾도 다른 세포와 비교할 때, TUNEL 양성비율이 나선신경절에서 가장 낮았다고 보고하고 있다. 나선신경절의 apoptosis는 단지 cisplatin의 반복적인 투여에 의해서만 관찰할 수 있다고 여겨진다.
   일부 연구에 의하면 cisplatin이 혈관조에는 변성을 일으키지 않는다고 하지만,¹⁾ 본 연구에서는 혈관조, 특히 변연세포에서 상당히 많은 세포들이 TUNEL 양성으로 염색되었다. Kohn 등은 혈관조에서 가장 손상을 많이 받는 세포는 변연세포라는데 동의하였다.²⁾ 지주세포, Hensen 세포, Claudius 세포, 나선판연세포에서도 TUNEL 양성인 세포를 관찰할 수 있었다.
   Bcl-2 family는 apoptosis를 조절하는 중요한 요소이다. Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1 등은 apoptosis를 억제하며, Bax, Blk, Bad, Bcl-x 등은 항진시킨다.¹⁵⁾ Bax는 미토콘드리아 내로 이동하여 활성화된 monodimer가 되어 apoptosis를 항진시키고,¹⁶⁾ 이러한 Bax에 의한 세포사멸은 Bcl-2/Bax의 heterodimer에 의해 억제된다.¹⁵⁾ Bcl-2는 cisplatin, vincristine, paclitaxel, 5-fluorouracil 등 다양한 항암제에 의해 유발되는 apoptosis를 억제하거나 상당히 저지하는 것으로 알려져 있다.¹⁷⁾ 세포내의 억제요소와 항진요소의 비율이 apoptosis를 결정한다는 제안도 있다. Bcl-2 family가 apoptosis에는 공통적으로 발현되므로, cisplatin에 의한 이독성세포에서도 발현되리라고 생각된다.
   본 연구에서는 cisplatin에 의한 급성 이독성에서 시간 경과에 따른 Bcl-2 family의 발현을 알아 보았다. 단백면역전기영동에서 Bax는 6시간 후에 가장 높게 발현되었고 Bcl-2는 12시간후에 가장 높게 발현되었다. 24시간 후의 Bax와 Bcl-2의 발현은 대조군과 차이가 없었다. 면역조직화학염색에서도 Bax와 Bcl-2가 6시간과 12시간군에서 관찰되었고 대조군과 24시간군은 염색되지 않았다. Bax와 Bcl-2는 정상조직에서도 존재하는 것으로 알려져 있으나, 면역조직화학염색에서는 대조군의 조직에서 나타나지 않는다. 이는 단백면역전기영동과 면역조직화학염색에서 단백 검출의 민감도의 차이 때문이다. 일반적으로 단백면역전기영동의 민감도가 면역조직화학염색보다 월등하게 높으므로 이번 연구에서도 단백면역전기영동에서는 검출이 되었으나 면역조직화학염색에서 염색이 되지 않았다고 생각된다.
   Lee 등은 사람의 췌장암세포주인 PANC-1 세포주에서 단백면역전기영동을 함으로써 Bax가 확실히 증가하는 것을 관찰하였지만 Bcl-2는 24시간 동안 변화가 없었다고 하였다.¹⁸⁾ 항암제에 민감한 종양세포와는 달리 와우조직은 어느 정도 cisplatin에 대해 저항력이 있을 것이다. 와우조직은 cisplatin 주사후에 발현되는 Bcl-2에 의하여 종양세포보다는 apoptosis가 적게 일어난다고 추론할 수 있으며, cisplatin에 대한 저항력도 더 강하다고 볼 수 있었다.
   Cisplatin에 의한 급성 이독성에서 apoptosis는 초기에 Bax에 의해서 반응이 시작되고 연이어 발현되는 Bcl-2는 apoptosis의 기전을 억제한다고 생각된다. 한편, 면역조직화학염색에서 변연세포의 대부분은 Bax와 Bcl-2를 발현하는 것으로 밝혀졌으나, 모든 변연세포가 TUNEL 양성으로 염색되지는 않았다. 이러한 사실들로 인해 각 세포에서 초기에 발현되는 Bax와 나중에 발현되는 Bcl-2의 비율에 의하여 그 세포의 생존여부가 결정됨을 알 수 있었다.
   청성뇌간유발전위검사에서 cisplatin을 주사하고 6시간후에 역치가 증가하고 그 후에는 변동이 거의 없었다. 이러한 관찰에 의하여 와우의 기능적인 변화가 cisplatin에 의한 급성 이독성에서 apoptosis에 병행하여 나타나고 apoptosis에 중요한 역할을 하는 Bax와 Bcl-2는 6시간 이내 그 발현이 시작되어 24시간 이후에는 조직에서의 농도가 대조군과 차이가 없음을 알 수 있었다.

결     론

   1회의 고용량의 cisplatin을 주사하였을 때, 와우의 외유모세포, 내유모세포, 혈관조의 변연세포, 그리고 Deiter 세포, 지주세포와 같은 지지세포에서 TUNEL 양성인 세포들이 관찰되었다. Bax와 Bcl-2는 cisplatin에 의한 급성 이독성의 발현에 중요한 역할을 하고 있음이 밝혀졌다. Apoptosis는 6시간 이내에 그 기전이 시작되고, 각 세포의 apoptosis는 Bcl-2 family의 조절에 의해서 결정된다.
   이 연구의 결과를 토대로 유리기를 감소시켜 Bax의 발현을 차단하든지 또는 짧은 시간내 Bcl-2의 발현을 증가시키는 제제의 개발을 통해 cisplatin 항암치료를 받는 환자들에서 이독성을 방지하거나 줄일 가능성을 기대할 수 있을 것이다.

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