교신저자：박시내, 137-701 서울 서초구 반포동 505번지 가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   편도 및 아데노이드의 비후 및 반복되는 염증 및 삼출성 중이염은 소아 이비인후과 영역에서 흔히 발생하는 질환이며, 많은 경우에서 수술적 치료를 필요로 한다. 염증 발생시에 주로 침윤하는 B-임파구와 다핵 임파구들은,¹⁾ 조직내에서 활성 산소(reactive oxygen species)의 일종인 superoxide free radical, 즉 O₂^-(SFR)을 생성하게 된다.²⁾³⁾ O₂^-은 화학적으로 매우 반응성이 높고 불안정하여⁴⁾ 세균에 대한 항균작용⁵⁾ 뿐만 아니라 세포내 단백질, 지질 등을 파괴함으로써 정상적인 세포에 대해서도 독성을 나타나게 되며 간질환, 노화, 방사선 손상, 심질환, 각종 염증, 암, 노화 및 면역질환과 허혈후 손상 등의 병적 상태에 관여한다고 보고되고 있다.⁶⁾⁷⁾ 이런 세포 독성에 의한 손상을 최소화하기 위해 유핵세포내에는 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase(GSH-Px) 등의 항산화 효소계들이 존재하게 되고⁸⁾ 이외에도 여러 항산화 물질이 세포 독성에 대한 방어에 관여한다.⁹⁾ 염증에 의해 조직내에 많은 O₂^-가 분포하게 되고, 이런 O₂^-에 의한 손상을 적게 하기 위한 유핵세포 내의 SOD 등의 항산화 효소의 발현 또한 많이 나타나는 것으로 알려져 있다.¹⁾
   저자들은 편도와 아데노이드 비대를 가진 환아들에서 수술시에 얻어진 편도와 아데노이드의 부위별 조직을 이용하여, 면역조직화학염색과 역전사 중합효소 연쇄반응 방법을 통해 SOD의 분포 양상과 발현 정도를 확인하고, 편도선염의 빈도 및 이환시기, 편도의 크기 등의 변수와 편도에서의 SOD의 발현사이의 관련성을 살펴보고, 삼출성 중이염 여부와 빈도, 아데노이드의 크기 및 부비동염, 후비루의 존재 여부 등과 아데노이드 조직내에서의 SOD의 발현 정도를 비교 분석해 보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   강남성모병원 이비인후과에서 1999년 12월에서 2000년 2월까지 편도 및 아데노이드 비대로 편도 및 아데노이드 절제술을 시행받은 환아 21명으로 나이는 평균 7±2.76세로 4세부터 12세까지 분포하고 있었으며, 성비는 남아가 15명, 여아가 6명이었다. 이들 중에는 3개월간의 약물요법에 반응하지 않아 환기관 삽입술을 함께 시행한 만성 삼출성 중이염을 동시에 지닌 환아 7명이 포함되었다.

방  법

문진, 이학적 검사 및 단순 방사선학적 검사
   수술 전날 대상 환아와 보호자를 통해 최근 1년간의 편도선염을 앓은 횟수, 가장 최근에 편도선염을 앓은 시기, 최근 1년간의 급성 또는 삼출성 중이염을 앓은 빈도, 가장 최근에 중이염을 앓은 시기 등에 대한 문진을 하였다. 이학적 검사를 통해 후비루의 유무 및 편도선의 크기를 확인하여 편도와내에 존재할 때를 grade 1로 양측 편도가 맞닿아 있을 때를 grade 4로 하고 그 사이의 크기를 정도에 따라 grade 2, 3로 표시한 후 양측의 값을 더하여 편도선의 크기로 하였으며, 이경 검사와 임피던스 고막검사를 통해 삼출성 중이염의 여부를 확인하였다. 또한, 경부 측면 사진을 통해 아데노이드의 크기를 A/N(Adenoid to Nasopharynx) ratio로 측정하였고, 부비동 단순 X선 사진에서 부비동염의 정도를 확인하되 상악동에서 염증소견이 없는 경우 0, 경도에서 중등도의 혼탁이나, 점막의 비후소견이 관찰되는 경우 1, 전체 부비동의 혼탁한 경우를 2로하여 양쪽을 합한 값을 부비동염의 정도로 표시하였다.

조직채취
   수술실에서 전신 마취하에서 큐렛으로 아데노이드를 절제한 후 중심부에서 상피를 포함하여 약 5×5 mm의 조직을 절제한 깊이만큼 얻고, 편도는 절제 후 편도의 중심부에서 역시 상피를 포함한 약 5 mm 두께의 조직을 편도의 장축에 수직인 방향으로 원기둥 모양으로 절개하여 얻은 후 가능한 빨리 질소 가스로 급속 냉동시킨 후 영하 70°C에서 실험 전까지 보관하였다.

면역조직화학염색
   냉동 절편(cryosection)으로 조직 절편을 만들고 항체는 sheep antihuman -CuZnSODs polyclonal antibodies(Kal biochemical, USA)를 일차 항체로 ABC sheep IgG kit를 이차항체로 면역조직화학염색을 시행하였으며, 발색제로 3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB：Sigma, St. Louis, USA)을 사용하여 아데노이드 및 편도의 각 부위별로 CuZnSOD의 발현 정도를 관찰하였다.

역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)

RNA분리 및 cDNA합성
   수집된 편도 및 아데노이드 조직액 100~300 μl를 RNA_ZOL^TM-B 용액(Bioteck Laboratory. Texas, USA) 1 ml로 균질화시킨 후 chloroform 200 μl로 처리하여 유기용매층의 DNA와 변성된 단백질을 제거하였다. 수용액층의 RNA는 동량의 iosopropanol로 처리한 후 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전 회수하였다.
   추출된 전체 RNA 1 μg에 DEPC H₂O 7.2 μl를 넣고 65°C 15분, 4°C에서 5분 반응시킨 후 10× reaction buffer 2 μl, Oligo-p(dT)₁₅ primer 2 μl, 25 mM MgCl₂ 4 μl, RNase inhibitor(50 U/μl) 1 μl, AMV(avian myoblastosis virus) 역전사 효소 0.8 μl를 넣고 25°C 10분, 42°C 60분, 99°C 5분, 4°C에서 5분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다.

중합효소 연쇄반응(PCR)
   0.2 μg cDNA를 50°C에서 15분간 반응시키고, 주문 제작한 249 bp의 CuZnSOD cDNA probe(5' primer：TGTGATCTCACTCTCAGGAGA/3' primer：TTACAGT-GTTTAATGTTTATCAGGA：바이오니아) 5 μl와 각 조직의 mRNA양의 보정을 위해 310 bp β-actin cDNA probe(5' primer：GCTCTCTTCCAACCTTCCTTCC/3' primer：TCGTCATACTCCTGC TTGCTGA：바이오니아) 5 μl를 각각 dNTP 1 μl, 10× reaction buffer 5 μl, Taq DNA polymerase 0.2 μl, cDNA 4 μl 및 H₂O를 넣어 총량이 50 μl가 되게 한 후 PCR DIG Probe Synthesis Kit(Boehringer Mannheim, Germany)를 이용하여 중합 효소 연쇄반응을 실시하였다. Thermal Cycler(Perkins-Elmer Corp., USA)를 이용하여 94°C에서 45초간 denaturation, 46°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 1분간 extension하여 총 28회 시행하였다. 2.0% agarose gel을 만든 후, CuZnSOD 및 β-actin PCR산물을 각각 4 μl씩 취하여 함께 넣고 100 V 직류하에서 1시간동안 전기영동한 후 ethidium bromide(Sigma, St. Louis, USA)로 염색하여 RT-PCR 산물의 띠를 확인하고 제작물 크기를 확인하였다. 음성 대조군으로 cDNA 대신 증류수를 사용하였고 양성 대조군으로는 만성 중이염 수술시 이개 후부에서 얻은 염증성 반응으로 종창된 림프선을 사용하였다.

결과 분석
   면역조직화학 염색된 슬라이드 표본에서 편도 및 아데노이드에서 배중심, 외투대, trabecula, 외소포부위, 편도음와 상피, 점막 상피와 같은 조직의 각 부위별 CuZnSOD의 면역조직화학염색의 정도에 따라 강양성은 ＋＋＋, 양성은 ＋＋, 약양성은 ＋, 음성은 -로 표시하였다.
   최근 편도염을 앓은 시기와 편도에서의 CuZnSOD 발현 정도, 편도 및 아데노이드 크기와 이들 조직에서의 CuZnSOD 발현 정도, 삼출성 중이염 발생 빈도와 최근 삼출성 중이염을 앓은 시기, 수술 당시 삼출성 중이염의 유무, 후비루와 부비동염의 정도와 아데노이드에서의 CuZnSOD 발현 정도 사이의 관련성을 확인하고자 각 조직에서 CuZnSOD의 발현 정도를 부위별로 관찰하고 이를 합산한 후 각 변수와의 관련성을 통계적으로 분석하였다.
   역전사 중합효소 연쇄반응 산물을 전기영동하여 나타난 band를 scanning laser densitometry(Pharmacia Biotech, USA)로 CuZnSOD/β-actin mRNA비로 측정함으써 각 sample과 lane간의 오차를 줄이면서 CuZnSOD의 발현 정도를 반정량적으로 비교 분석하였다.
   통계처리는 SPSS 8.0으로 하였으며, 유의 수준 0.05 이하일 때 통계적으로 의의가 있음을 확인하였다.

결     과

면역조직화학염색 결과 CuZnSOD의 발현정도
   모든 대상 환아의 편도 및 아데노이드 조직에서 다양한 정도의 CuZnSOD의 발현을 관찰할 수 있었다(Figs. 1 and 2).
   한 개체내에서 동일 조직 부위 즉, 양측 구개편도와 아데노이드 각각의 배중심, 외투대, trabecula, 외소포부위, 편도음와 상피, 점막 상피내 CuZnSOD의 발현 정도는 차이를 보이지 않았다(ANOVA, Rank Sum Test, Kendall's W test).
   한 조직에서의 부위별 CuZnSOD 발현 정도를 관찰하여 평균한 결과 배중심은 음성, 외투대에서는 약양성을 보이고 있었고, trabecula와 외소포부위에서는 양성, 편도음와와 점막 상피에서는 강양성을 나타냈다(Table 1).
   A/N ratio와 아데노이드 조직에서의 CuZnSOD 발현 정도는 통계적으로 유의한 관련성을 보이지 않았으며(p>0.05), 현재 삼출성 중이염이 있는 환아에서 아데노이드에서의 CuZnSOD의 발현은 삼출성 중이염 없는 환아의 아데노이드에서의 발현에 비해 의미있게 증가되어 있었다(p<0.05). 반면, 최근 1년간 삼출성 중이염을 앓은 횟수와 아데노이드의 CuZnSOD의 발현 사이에는 관련성을 보이지 않았다(p>0.05)(Table 2).
   후비루가 있는 경우, 또 부비동 X-선상에서 부비동염의 소견을 보이는 정도에 따라 아데노이드에서의 CuZnSOD의 발현은 증가되는 양상을 보이고 있었다(p<0.05)(Table 2).
   최근 1년간 편도염을 앓은 횟수와 편도에서의 CuZnSOD의 발현 사이에는 유의한 관련성을 보여 편도염을 많이 앓을수록 발현 정도가 높음을 알 수 있었으며(p<0.05), 편도 크기에 따른 CuZnSOD의 발현 정도는 통계적인 의의를 보이지 않았다(p>0.05)(Table 2).

RT-PCR 산물의 β-actin에 대한 CuZnSOD의 발현 및 발현비
   모든 대상 환아의 편도 및 아데노이드 조직에서 RT-PCR을 통한 β-actin과 CuZnSOD mRNA의 발현이 뚜렷이 관찰되었다(Fig. 3). 삼출성 중이염의 동반 여부에 따라 편도 및 아데노이드 조직에서의 CuZnSOD 존재 및 분포량을 반정량적으로 분석해보고자 RT-PCR 산물인 band를 densitometry를 이용하여 β-actin에 대한 비로 나타내었다. 결과, 아데노이드 조직에서의 CuZnSOD/β-actin 값은 삼출성 중이염이 동반된 환아에서 평균 0.51±0.22, 삼출성 중이염이 동반되지 않은 환아의 경우 평균 0.24±0.26로 나와 삼출성 중이염을 동반한 군에서 의미있게 증가되어 있었으나(p<0.05), 편도조직에서의 값은 두 군간에 의미있는 차이를 보이지 않았다(Fig. 4).

고     찰

   구개편도와 아데노이드는 점막상피와 연관되어 존재하는 대표적인 점막 면역조직(Mucosa-Associated Lymphoid Tissue, MALT)의 하나로, 병적 상태에서 B-임파구, 다핵 임파구 및 식세포들이 침윤하고 조직내로의 이들 염증 세포들의 침윤으로 염증 반응이 나타난다.¹⁾¹⁰⁾
   인체는 산소를 이용함으로써 에너지를 생성하며, 이 과정에서 산소화합물의 일종인 활성산소(reactive oxygen species)가 형성되고, 그외 외부에서의 방사선 조사나 화학물질 등에 의한 자극이 있는 경우에도 활성산소가 생성된다.¹¹⁾ 활성산소는 oxygen free radical과 그로부터 유래된 산소화합물로 분자의 최외곽에 쌍을 이루지 않은 전자를 가지고 있는 분자나 원소로 인체내에는 O₂^-, HO₂, H₂O₂, OH^-, ¹O₂, OCl^-, O₃ 등⁶⁾과 같이 여러 가지 free radical이 존재한다고 알려져 있다. Free radical은 화학적으로 매우 반응성이 높고 불안정하며 세균 및 이물질에 대한 독성^1)2)3)5) 뿐 아니라 세포내 단백질, 탄수화물, nucleotide, 지질 등과 반응하여 정상 세포에 대한 독성을 나타내기도 한다.⁴⁾ 이같은 활성산소에 의한 정상세포의 손상을 최소화 하기 위해 인체내에는 방어기전으로 항산화효소계인 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathione peroxidase(GSH-Px)등이 존재하고, 이외에도 비효소적인 항산화물질로 Vit E, ascorbate, beta-carotene, 불포화 아미노산 및 지방산, 요산, calcium channel blocker, Ginkgo biloba 등이 존재하여 free radical에 의한 세포독성을 방지하는 작용을 하게 된다.¹²⁾¹³⁾ 이들 항산화효소들에서 SOD는 O₂^-를 과산화수소 및 산소로 변화시키고, CAT는 과산화수소를 물과 산소로 대사시키며, GSH-Px는 과산화수소를 물과 산소로 대사시키는 기능 이외에도 lipid hydroperoxide를 nontoxic alcohol로 대사시키는 작용을 한다.¹²⁾
   대표적 항산화효소계인 SOD는 호흡하는 세포내에서 산소의 대사적 환원에 의해 생성된 독성물질인 superoxide free radical을 제거하는 효소로 포유동물에서는 미토콘드리아내에 분포하고 있는 MnSOD(Manganase superoxide dismutase)와 세포질과 핵에 넓게 분포하는 CuZnSOD(opper-Zinc superoxide dismutase), 그외 세포외(extracelluar) SOD 등이 알려져 있다.¹⁴⁾ 염증이 많이 반복되는 조직에 침윤되는 염증세포에는 염증 반응을 통해 많은 superoxide free radical이 분포하게 되고 이런 O₂^-에 의한 손상을 최소화 하기 위한 SOD 등의 항산화 효소들의 발현 또한 많이 나타나게 된다고 알려져 있다.¹⁾
   많은 연구에서 여러 병적 상태와 SOD의 발현사이에 관련성을 찾으려 하였고 그 병리 기전을 설명하고자 하였다. Kim 등¹²⁾은 비용환자에서의 SOD 및 O₂^-를 측정, 비용형성에 O₂^-가 관여함을 보고하여 SOD가 생체방어기전에 담당한다고 설명한 바 있다. 또한 Matkovics 등은 Duchene muscular dystrophy 환자에서 SOD와 CAT의 활성과 lipid peroxidation이 정상인에 비해 증가된 것을 발견, 항산화 효소들의 진단 및 치료적 가치를 언급하기도 하였다.¹⁵⁾ 또한, 중이 저류액내에서 SOD의 발현에 대한 기존의 연구에서 삼출성 중이염의 병인으로 O₂^-의 가능성과 저류액내 감소된 SOD를 보고하기도 하였다.¹⁶⁾
   본 연구에서는 편도 및 아데노이드 조직에서의 CuZnSOD의 발현 정도를 면역조직 화학염색을 통해 관찰하되, 이들 조직의 다양한 부위에서 발현되는 정도를 비교하고, 개체별 발현정도에 영향을 미치는 여러 인자를 찾아보고자 하였다.
   결과, 편도 및 아데노이드 조직의 여러 부위에서 뚜렷한 차이를 보이는 CuZnSOD의 발현 정도를 관찰할 수 있었는데, 이는 조직의 각 부위에서 염증 반응과 관련해 요구되는 SOD의 양과 관련성이 있을 것으로 생각된다. 즉, 미생물이나 이물질 등의 침윤이 많이 일어나는 편도 음와, 점막 상피 및 아데노이드 점막 상피에서는 SOD의 발현 정도가 강하게 나타났는데, 이는 이곳에서 염증반응에 의해 O₂^-가 많이 생성됨에 따라 O₂^-에 의한 정상 세포의 손상을 방지하기 위한 SOD의 요구량이 증가되어 높게 발현된 것으로 생각되고, SOD의 요구량에 따라 trabecula와 외소포부위에서는 중증도로, 외투대에서는 약한 발현을 보인 것으로 여겨지며, 외부에서의 염증 세포 및 미생물의 침윤이 적은 배중심에서는 SOD가 전혀 발현되지 않아 이 부위에서는 SOD를 필요로 할 만한 O₂^-의 생성이 없을 것을 시사하고, 이같은 결과는 Ming-Tang Lai 등이 편도 조직에서 관찰한 결과와도 일치되고 있다.¹⁾
   조직에서의 SOD 발현 정도에 영향을 미칠 것으로 예상된 여러 인자에 대해 그 관련성을 관찰해 본 결과 아데노이드에서의 CuZnSOD 발현은 수술 당시 삼출성 중이염이 동반된 경우와 후비루를 보이면서 X-선상 부비동염의 소견이 보인 경우에서 의미있게 증가되어 관련성을 보이고 있었고, A/N ratio로 살펴본 아데노이드의 크기나, 최근 1년간 삼출성 중이염을 앓은 횟수와는 관련성을 보이지 않았다. 이는 삼출성 중이염이나 부비동염이 있는 경우 아데노이드에서 SOD의 요구량이 증가될 만한 염증 반응이 일어나고 있음을 시사하는 것으로 여겨진다.
   편도 조직에서의 CuZnSOD 발현은 최근 1년간의 편도염을 앓은 횟수가 높을수록 또 최근에 편도염을 앓은 시기가 수술 시기에서 가까울수록 증가되는 양상을 보이고 있었는데, 편도염을 만성적, 혹은 반복적으로 앓는 경우 편도 조직내에서 보다 많은 염증 반응과 이에 따른 SOD의 요구량 증가로 인한 결과로 생각되며, 편도의 크기와 CuZnSOD 발현은 관련성을 찾아볼 수 없었기에 결국 편도에서의 염증 반응 정도만이 SOD 발현에 관련되어 있음을 재확인할 수 있었다.
   편도 및 아데노이드 조직내 있는 CuZnSOD의 mRNA량을 RT-PCR을 통해 반정량적 분석한 결과에서도 삼출성 중이염을 동반한 아동에서 아데노이드 조직내에 의미있게 증가된 CuZnSOD/β-actin 값을 관찰할 수 있었고, 반면 편도 조직에서는 삼출성 중이염의 동반 여부가 CuZnSOD/β-actin 값에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다. 이 결과는 이관과 해부학적으로 가깝게 위치하고 있는 아데노이드에서의 염증이나 세균 감염으로 인해 증가된 O₂^-와 이에 대한 생체방어기전으로 작용할 SOD가 삼출성 중이염의 발생과 관련이 있을 것을 시사한다고 여겨지며, 향후 삼출성 중이염 환아의 아데노이드 조직과 중이 삼출액에서의 SOD 발현 정도의 차이에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   편도와 아데노이드 비대를 가진 환아들에서 수술시에 얻어진 편도와 아데노이드의 부위별 조직을 이용하여, 면역조직화학염색과 RT-PCR 방법을 통해 SOD의 분포 양상과 발현 정도를 확인하고, 이와 관련성을 가진 여러 인자에 대해 살펴보았다.
   결과 아데노이드에서의 CuZnSOD 발현에는 수술 당시 삼출성 중이염의 존재, 부비동염과 후비루의 존재가 의미있는 관련성을 보여 아데노이드에서의 염증 반응이 아데노이드 주위 기관의 염증과도 밀접한 관련성을 보이는 것으로 생각되며, 그 인과 관계에 대해서는 향후 추가적 연구가 필요할 것이다. 또한, 편도에서의 CuZnSOD 발현은 편도염을 앓은 횟수와 최근 편도염을 앓은 시기가 관련성을 보이는 것으로 관찰되어 잦은 편도염에 의한 생체방어기전으로 SOD가 역할을 담당할 것임을 시사한다.
   본 실험을 통해 아데노이드 및 구개 편도에서 CuZnSOD는 항상 발현되며, 그 발현 정도와 이들 조직 및 주변 기관의 염증 정도가 연관성을 가지고 있다고 생각된다. 따라서 이들 염증 반응의 예방 혹은 치료와 관련한 SOD의 역할에 대한 더욱 다양한 실험과 연구가 추가적으로 필요할 것으로 생각된다.

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