교신저자：전시영, 660-751 경남 진주시 칠암동 90번지 경상대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비부비동염의 발병기전을 연구하기 위해서는 실험적 비부비동염의 유발이 필수적이다. 현재까지 실험적 비부비동염에 대한 연구로는 Hilding¹⁾이 토끼 상악동의 자연공 부근에 비-상악동창을 만들어서 화농성 비부비동염을 유발시킨 것을 시작으로, Maeyama²⁾가 2.5% 난백알부민으로 감작시킨 토끼의 상악동내에 포도상구균을 주입하여 발생시킨 비부비동염의 병리조직학적 변화를 관찰하였으며, Kemlien과 Schiratzki³⁾는 토끼의 상악동내에 이물과 폐렴구균을 동시에 주입하여 비부비동염을 유발시켰으며, Min 등⁴⁾은 상악동 자연공을 골편으로 폐쇄한 후 폐렴구균을 주입하여 급성 비부비동염을 유발시켰다. 이러한 기존의 방법들은 비부비동염의 유발에 있어서 자연공의 폐쇄와 세균주입이 필요하였다. 그러나 이 방법들은 자연공을 인위적으로 폐쇄하여야 하고 세균을 주입해야 하므로 상악동을 노출할 때 이로 인한 상악동 자체의 손상과 이차적 염증을 유발시킬 가능성이 있어 실제 비부비동염의 치유과정을 이해하는데 한계가 있다.
   실험적 비부비동염의 연구에 가장 적합한 동물로 토끼가 널리 이용되어 왔다.^5)6)7)8) 비교적 크기가 큰 동물로서 수술적 조작이 용이하기 때문이다. 그러나 토끼는 비부비동염을 유발하기 위하여 상악동 자연 개구부를 인위적으로 폐쇄하여야 하고 유전적 조작, 염증반응에 관여하는 다양한 염증매개체와 항체들에 대한 실험적 조작이 용이하지 않기 때문에 최근 생쥐를 이용한 실험적 비부비동염 모델이 개발되어 보고되고 있다. Bomer 등⁹⁾은 생쥐의 비강내에 폐렴구균을 주입하여 유발시킨 급성 비부비동염의 생쥐 모델을 보고하였다. 그러나 아직 흰쥐를 이용한 실험적 모델은 보고된 바 가 없다. 흰쥐는 의학적 연구에 광범위하게 사용되며 신뢰도가 높은 동물이다. 생쥐에 비하여 크기가 커 실험적 조작이 용이하다. 흰쥐의 비강 및 비부비동은 사람과 유사한 해부학적 구조를 가지고 있으며 조직학적으로도 흰쥐의 비부비동은 호흡상피로 이루어져 있어 사람의 비부비동염을 연구하는데 적합한 실험적 비부비동염의 새로운 모델이라고 생각된다.
   혈소판활성인자는 생물학적으로 활성을 띤 내인성 인지질로서, 염증과 알레르기에 관여하는 강력한 염증매개체로 알려져 있다.
   혈소판활성인자와 같은 염증매개체에 의해 유발된 실험적 비부비동염 모델의 연구는 아직은 초보 단계이다. Jeong 등¹⁰⁾이 토끼 상악동내에 혈소판활성인자를 주입하여 상악동염을 유발시키고 그 병리학적 변화를 보고한 바 가 있다.
   본 연구의 목적은 혈소판활성인자에 의해 유발된 실험적 비부비동염 흰쥐모델을 만드는 것이다. 실험군에는 혈소판활성인자를 흰쥐의 비강내에 점적하였고. 대조군은 생리식염수를 흰쥐의 비강내에 점적하였다. 점적 후 1일, 3일 그리고 5일 후에 흰쥐을 희생시켜 실험군과 대조군간에 흰쥐의 비강 및 부비동에서 병리조직학적 변화, 즉 중성구 군집, 호산구 침윤, 상피세포 손상, 배상세포(goblet cell)의 과형성(hyperplasia) 그리고 inducible nitric oxide synthase(iNOS) 양성세포 침윤을 관찰하여 비부비동염의 발병여부를 확인하였다.

재료 및 방법

재  료
   실험동물로는 4~6 주령의 Sprague Dawlely계 흰쥐를 성별 구분 없이 사용하였다. 실험군 12마리와 대조군 6마리로 나누었으며 이들 흰쥐는 동일한 조건하에서 사육하였다.

방  법

Hematoxylin-Eosin 염색과 alcian blue 염색
   흰쥐는 혈소판활성인자와 생리식염수 처리 전에 ketamine HCl(75 mg/kg)와 xylazine HCl(10 mg/kg)으로 복강마취 하였다. 마취가 된 흰쥐는 기도확보를 위해 머리를 30도 정도 낮게 한 다음 실험군에는 16 μg/ml의 혈소판활성인자를 흰쥐의 양쪽 코구멍에 각 50 μl씩 micropipett을 이용하여 점적하였으며 대조군에는 실험군과 동일한 방법과 양으로 생리식염수를 점적 하였다. 혈소판활성인자와 생리식염수를 점적한 후 각 1일, 3일 그리고 5일의 생존기간을 둔 후 각 해당일에 다시 동일 마취액으로 마취시키고 심장을 통해 관류고정을 하였다. 관류고정은 먼저 200 ml의 생리식염수를 관류시키고 이어서 2% paraformadehyde 첨가, 0.1 M 인산완충액의 고정액 200 ml로 관류고정을 하였다.
   관류고정이 끝난 후 흰쥐의 머리를 적출하여 동일 고정액에 2시간 동안 4°C에 담가 후고정을 하였다. 그런 다음 머리는 눈, 피부, 근육, 하악골과 혀를 저배율의 현미경하에서 제거한 후 1주일간 250 mM EDTA 【ethlene diamine tetra acetic acid (pH 7.4)】 용액에 담궈 탈회를 실시하였다. 탈회가 되어 조직이 연하게 되면 머리를 면도칼로 앞니의 바로 뒤쪽과 어금니의 바로 앞쪽에서 조직을 취하였다. cryoprotect를 위해 30% sucrose 첨가 0.1 M 인산완충용액에 24시간 둔 후 조직을 O.C.T compound에 포매, 동결시킨 후 -20°C의 cryostat를 이용해 10~20 μm 두께로 연속절편을 제작하여 gelatin coating slide에 올린 후 -80°C에 보관하였고 일반적인 형태학적 관찰을 위해 hematoxylin과 eosin 염색을 하였다. 준비된 조직에서는 배상세포를 관찰하기 위해 alcian blue로 염색을 하였으며 methyl green으로 대조염색을 하였다.
   염색된 각 조직에 중성구 군집의 수는 40배의 저배율에서 모든 비강에서 그 수를 세었으며, 호산구와 상피세포 손상의 수는 비점막에서 10군데를 정하여 400배의 고배율에서 세었다. 배상세포의 수는 호흡상피가 있는 비점막에서 4군데를 정해 400배의 고배율에서 세었다.

iNOS에 대한 면역조직화학염색
   냉동조직절편을 실온에서 30분 이상 건조시키고 0.1 M 인산완충용액에 5분씩 3회 세척한 후 0.5% periodic acid에 실온에서 10분 동안 처리하여 내인성 peoxidase의 활성을 억제시켰다. 조직절편을 다시 1차 증류수로 1분 동안 세척하고 0.1 M 인산완충용액에 5분씩 3회 세척하였다. 조직절편을 차단혈청용액(3% normal goat serum, 1% bovine serum albumin, 0.3%의 triton X-100 in 0.1 M PBS)에 실온에서 3시간 동안 처리하였다. 이어서 희석한 1차 항체(1：1,000 rabbit anti-iNOS serum, Transduction laboratories Inc., kentucky, USA)에 실온에서 15시간 이상 반응시켰다. 0.1 M 인산완충용액에 5분간 6회 세척한 후, 2차 항체(biotinylated anti-rabbit IgG in 3% normal goat serum, 1% bovine serum albumin, 0.3%의 triton X-100 in 0.1 M PBS)에 실온에서 1시간 처리 하였다. 다시 0.1 M 인산완충용액에 6회 세척한 후, avidin-biotin-complex(Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA)에 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 0.1 M 인산완충용액에 5분씩 6회 세척한 후, karnovski-Nikel 용액(0.025% diaminobenzidin, 0.04% nickel chloride, 0.03% hydrogen peroxidase in PBS)에 3분 동안 발색반응을 시켰다. 조직절편을 0.1 M 인산 완충액에 5분씩 6회 세척한 후 methyl green에 대조 염색하여 탈수 후에 봉입하였다. 염색된 조직의 iNOS 양성세포(염증세포) 수는 비점막에서 10군데를 정해 400배의 고배율에서 수를 세었다.

통계분석
   모든 자료들은 means±SD로 표시하였다. 통계분석은 대조군과 실험군간의 차이는 t-test를 이용하였으며 대조군의 시간별 차이와 실험군의 시간별 차이는 일원분산분석(ANOVA)을 이용하였다. 유의수준은 p<0.05 범위로 정하였다.

결     과

병리조직학적 변화

중성구 군집
   중성구 군집은 모든 비강 내에서 관찰하였다.
   대조군과 실험군간의 시간적 차이는 대조군 보다 실험군에서 1일, 3일 그리고 5일 모두에서 현저한 증가를 보였다(t-test, p<0.01). 실험군에서의 시간적 차이는 1일째에서 중성구 군집이 관찰되어 3일째에 그 수가 현저히 증가(ANOVA, p<0.01) 하였으며 5일째에는 조금 감소하는 소견을 보였다(Table 1, Fig. 1).

호산구 침윤
   호산구는 비점막에서 관찰하였다.
   대조군과 실험군간의 시간적 차이는 대조군보다 실험군에서 1일, 3일 그리고 5일에서 현저한 증가를 보였다(t-test, p<0.01). 실험군에서의 시간적 차이는 1일째에 호산구가 관찰되어 3일째에 그 수가 현저히 증가(ANOVA, p<0.01) 하였으며 5일째에는 조금 감소하는 소견을 보였다(Table 1, Fig. 2).

상피세포 손상
   상피세포 손상은 염증세포의 침윤으로 기저막에서 상피층까지 상피손상이 관찰하였다.
   상피세포 탈락은 대조군과 실험군간의 시간적 차이는 대조군보다 실험군에서 1일, 3일 그리고 5일에서 현저한 증가를 보였다(t-test, p<0.01). 실험군에서의 시간적 차이는 1일째에 상피세포 손상이 관찰되어 3일째에는 그 수가 증가(ANOVA, p<0.05) 하였으며 5일째에는 조금 감소하는 소견을 보였다(Table 1, Fig. 2).

배상세포의 과형성
   상피층에 있는 배상세포를 관찰하기 위해 Acian blue로 조직을 염색하였다.
   대조군과 실험군간의 시간적 차이는 대조군보다 실험군에서 1일, 3일 그리고 5일에서 현저한 증가를 보였다(t-test, p<0.01). 실험군에서의 시간적 차이는 1일째에는 배상세포를 거의 관찰할 수 없었으며 3일째에서 그 수가 현저히 증가(ANOVA, p<0.01) 하였으며 5일째에는 약간 감소하는 소견을 보였다(Table 1, Fig. 2).

iNOS 양성세포 증식
   iNOS 양성염증세포들은 비점막과 비강내의 삼출물에서 관찰되었다.
   대조군과 실험군의 시간적 차이는 대조군 보다 실험군에서 1일, 3일 그리고 5일에서 현저한 증가를 보였다(t-test, p<0.01). 실험군에서의 시간적 차이는 1일째에서 iNOS 양성세포의 수가 관찰되어 3일째에서 그 수가 현저히 증가(ANOVA, p<0.01) 하였으며 5일째에는 감소하는 소견을 보였다(Table 1, Fig. 3).

고     찰

   혈소판활성인자에 의한 비부비동염의 흰쥐모델은 아직은 보고된 바가 없으나 Jeong 등¹⁰⁾이 토끼에서 혈소판활성인자에 의한 실험적 상악동염을 보고한 바가 있으며, Rhee 등¹¹⁾¹²⁾은 친칠라에서 이관을 결찰하지 않고 혈소판활성인자만을 중이강내 주입하여 삼출성 중이염을 유발하였음을 보고하였다. 본 연구에서 염증매개체중 하나인 혈소판활성인자를 흰쥐의 비강 내에 점적하여 자연공의 폐쇄나 세균주입 없이 실험적 비부비동염을 유발할 수 있었다.
   혈소판활성인자를 생성하고 분비하는 세포에는 호염기구, 혈소판, 중성구, 호산구, 단핵구, 비만세포, 폐포 대식세포, 혈관 내피세포, 상피세포 등이 있으며, 이것은 종(species)에 특이(specific)하며,¹³⁾ 혈소판활성인자가 세포로부터 분비되면 이들 염증세포의 대부분은 활성화하여 양성 되먹이기 현상(positive feedback phenomena)을 유발한다고 알려져 있다.¹³⁾ 여러 가지 염증매개체들 중에서 혈소판활성인자를 사용한 이유는 친칠라에서 중이강내에 혈소판활성인자를 주입하면 중이 정화작용이 지연되고,¹⁴⁾ 이관을 결찰하지 않고 단지 혈소판활성인자만 중이강에 주입해서 삼출성중이염을 유발할 수 있기 때문에¹¹⁾¹²⁾ 여러 염증매개체들 중에 가장 강력하다고 알려진 혈소판활성인자를 사용하였다.
   이 연구에서는 흰쥐의 양쪽 콧구멍에 국소적으로 16 μg/ml의 혈소판활성인자를 각각 50 μl씩 점적하였다. 혈소판활성인자의 농도를 위와 같이 정한 이유는 Rhee 등¹⁵⁾이 친칠라의 이관에서 혈소판활성인자에 의한 점액섬모운동 실험에서 16 μg/ml에서 점액섬모운동이 가장 지연되었다고 보고하였으며, Jeong 등¹⁰⁾이 토끼의 상악동내에서 16 μg/ml의 혈소판활성인자 1 ml을 투여했을 때 상악동 점막의 점액운동이 가장 길게 지연되며 섬모소실과 상피세포 탈락 및 염증세포침윤을 관찰하였다는 보고가 있었기 때문에 본 연구에서도 16 μg/ml의 혈소판활성인자를 이용하였으며, 투여량은 정이 투여한 1 ml은 토끼보다 작은 흰쥐에게는 많은 양이어서 각 50 μl씩 국소적으로 점적하였다.
   급성 비부비동염의 병리학적인 소견으로는 광학현미경관찰에서 상피하 부종, 소정맥의 확장, 배상세포의 형성, 섬모의 융합 및 탈락, 상피세포의 괴사 및 궤양, 중성구, 임파구, 형질세포, 대식세포 등의 염증세포침윤, 편평상피로의 이행 등이 보고되고 있다.^2)4)16) 본 연구에서는 혈소판활성인자을 점적한 실험군에서는 비강 내에서 중성구 군집을 관찰하였으며 비점막에서 호산구 침윤, 상피세포 손상, 배상세포의 과형성, 그리고 iNOS 양성염증세포가 관찰되었다. 모두 1일 부터 나타나기 시작하여 3일째에서 현저한 증가를 보였으며 5일째에는 감소를 보였다.
   Bomer 등⁹⁾은 Streptococcus pneumoniae를 생쥐의 비강 내에 접종하여 중성구 군집과 중성구의 관찰로 급성 세균성 비부비동염의 생쥐 모델을 보고하였는데 세균 접종 후 5일째에서 중성구 군집과 중성구수의 증가로 생쥐에서 세균에 의한 부비동염이 유발됨을 보고하였다. 우리의 연구에서는 중성구 군집과 중성구 대신에 혈소판활성인자가 호산구에 대한 강력한 화학주성인자로 작용하기 때문에 호산구 침윤을 관찰하였다. 관찰된 중성구 군집은 흰쥐의 비강 내에서 40배의 저배율로 그 수를 세었으며, 호산구는 흰쥐의 비점막에서 10군데를 정해서 400배 고배율에서 그 수를 세었다. 혈소판활성인자를 준 실험군의 1일째에서 중성구 군집과 호산구가 나타나기 시작하여 3일째에서 그것들의 수가 현저한 증가(중성구 군집(p<0.01)과 호산구(p<0.01))를 보였으며 5일째에는 감소를 보였다.
   Jeong 등¹⁰⁾의 토끼에서의 혈소판활성인자에 의해 유발된 상악동염의 병리조직학적 보고에 의하면 혈소판활성인자를 주입한 실험군에서 섬모소실은 3일째부터 나타나기 시작하여, 5일째에 더 심한 섬모소실의 소견을 보였고, 상피세포의 손상은 5일째부터 나타나기 시작하여 7일째에 더욱 심하게 나타났으며, 침윤된 염증세포중 대부분은 호산구였으나 일부에서는 중성구가 관찰되었다. 이러한 염증세포는 상피하 조직뿐만 아니라 상피 내로의 침윤과 일부에서는 상악동 내로의 침윤을 관찰되었다고 보고하였다. 본 연구에서는 섬모 소실은 관찰하지 않았지만 상피세포 손상을 관찰하였다. 혈소판활성인자를 준 실험군의 1일째에서 상피세포 손상이 나타나기 시작하여 3일째에서 그 수가 증가(p<0.05)를 보였으며 5일째에는 다소 감소하는 경향을 보였다.
   본 실험에서는 비부비동염에서 증가되는 배상세포를 관찰하였다. 배상세포는 alcian blue로 염색하였으며 흰쥐의 호흡상피가 있는 비점막의 4군데를 정해서 400배 고배율에서 그 수를 세었으며 대조군보다 혈소판활성인자를 준 실험군 1일째부터 증가하기 시작하여 3일째 그룹에서 배상세포의 수가 현저한 증가(p<0.01)를 보였으며 5일째에는 감소를 보였다. 이 결과는 비부비동염에서 증가되는 배상세포 과형성이 혈소판활성인자로 유발되는 것을 볼 수 있었다.
   그리고 염증세포에 발현되는 iNOS 양성염증세포를 관찰하였다. iNOS 양성염증세포는 흰쥐의 비점막에서 4군데를 정해 400배 고배율에서 그 수를 세었으며 면역조직염색과정에서 iNOS의 발현 양상은 대조군에 비해 혈소판활성인자를 준 실험군에서 1일째부터 나타나기 시작하여 3일째 그룹에서 현저한 증가(p<0.01)를 보였으며 5일째에는 감소를 보였으며 iNOS 양성염증세포발현으로 면역반응과 염증반응에 관여하리라 추측되며 여기에 연구가 더 필요하다고 생각된다.

결     론

   흰쥐의 비강 내에 혈소판활성인자를 점적하여 비강에서 시간의 경과에 따른 비강 및 부비동 내에서의 중성구 군집, 호산구 침윤, 상피세포 손상, 배상세포 과형성 그리고 iNOS 양성염증세포의 침윤이 증가됨을 관찰할 수 있었다. 따라서 흰쥐에서 혈소판활성인자에 의해 유발된 실험적 비부비동염을 병리조직학적 방법으로 확인할 수 있었다. 혈소판활성인자에 의해 유발된 비부비동염 흰쥐모델은 기존의 실험적 비부비동염 모델과는 다른 새로운 모델로서 향후 염증매개체에 의한 비부비동염의 발병에 대한 이해와 그 발병 예방 및 치료에 기여하리라 사료된다.

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