교신저자：정성민, 158-710 서울 양천구 목동 911-1  이화여자대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   반회후두신경의 손상으로 의한 성대마비의 가장 이상적인 치료는 생리적인 방법으로 어떤 형태로든지 후두의 신경재지배를 유도하여 성대의 정상 움직임을 회복하게 하는 것이다. 이를 유도하기 위하여 다양한 방법의 반회후두신경 문합술이 시도되었으나 대부분 신경섬유의 재생이 잘못된 방향으로 유도되어 후두근육들의 공동운동(synkinesis)을 일으키게 되어 아직까지 성대 움직임이 완전히 회복되었다는 보고는 미미한 상태이며 성대근육의 긴장도를 유지하는 것에 만족하고 있다.¹⁾ 공동운동(synkinesis)은 정상적으로는 함께 수축하지 않는 근육들이 동시에 수축하는 것을 의미하는데, 후두에서 길항작용을 하는 근육들이 동시에 수축하게 되므로 서로 상반되는 힘에 의해 성대는 움직이지 않고 고정되게 된다. 성대마비 후 성대에서 공동운동이 일어나는 원인은 하나의 신경줄기 속에 길항작용을 하는 성대내전근과 성대외전근으로 분포되는 신경다발들이 불규칙하게 분포되어 있기 때문에 잘려진 신경의 줄기의 양끝을 재문합하는 경우 성대내전근 또는 성대외전근으로만 분포하여야 하는 신경섬유들이 잘못된 방향으로 신경재분포를 하기 때문인 것으로 생각되고 있다.²⁾
   본 교실에서는 골절된 뼈의 치유에 도움을 주고 절단된 말초신경의 재문합 후에 신경재생을 촉진시킨다고 알려져 있는 pulsed electromagnetic stimulation(PEMS)을 흰쥐에서 반회후두신경 재문합 후 적용한 결과, 후두의 기능회복을 조기에 촉진하는 역할을 한다는 것을 확인한 바 있었다.³⁾ 이에 저자는 PEMS를 이용하여 반회후두신경의 재생 및 후두기능회복을 유도하여 성대 기능이 회복된 경우와 회복되지 않은 경우에 의핵내에서의 후두운동신경원의 분포를 역행성 이중추적방법으로 알아보고 반회후두신경의 조직학적 변화를 전자현미경으로 확인하여 그 차이를 비교해보고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물
   실험동물로는 체중 250~300 g의 정상적인 성대의 움직임을 보이는 86마리의 수컷 Sprague-Dawley계 흰쥐를 사용하였다. 그 중 2마리는 정상쥐의 역행성 이중 추적방법을 위해 사용하였고 나머지 84마리는 두 군으로 나누어 A군(PEMS를 주고 후두기능회복을 유도한 군)과 B군(자연적 기능회복을 유도한 군)으로 구분하였다.

반회후두신경재지배
   Ketamine hydrochloride(Ketalar, 10 mg/100 g)을 흰쥐 복강내 주사하여 마취시킨 후 경부 정중부의 털을 전기면도기로 제거하고 앙와위로 고정하여 1% povidone iodine으로 소독한 다음 전경부 정중앙에 설골부터 시작하여 윤상연골의 하연에서 2 cm정도까지 수직절개를 하였다. 악하선과 근육을 박리하여 기관을 노출시킨 다음 피대근(strap muscle)을 좌우로 당겨 기관과 식도사이에 주행하고 하인두수축근의 하연부에서 후두로 들어가는 반회후두신경을 확인하였다. 수술용 현미경(OMPI 99, Carl Zeiss, Hamburg, Germany)하에서 윤상연골 하연으로부터 0.5 cm 아랫부분에 위치하는 반회후두신경을 확인하고 microscissor로 한번에 절단한 후 긴장이 없도록 주의하며 10-0 나일론으로 일차신경봉합을 하였다. 일차봉합한 반회후두신경을 silastic tube(diameter 0.025"×0.047"×0.011") 사이에 끼워, 주위 조직과의 유착 및 장액종의 형성을 방지하였다. 또한, 상후두신경의 영향을 배제하기 위해 상후두신경을 절단하였다. 위의 모든 실험조작이 끝난 후 절개부위를 봉합하였다. 수술 후 내시경 검사를 통해 좌측 성대가 부정중위로 고정되어있는 것을 확인한 후 무작위적으로 42마리씩 A군과 B군으로 나누었다.

Pulsed electromagnetic stimulation(PEMS)
   후두기능이 회복된 쥐의 모델을 얻기 위해 간헐적 전자기장 자극은 Chung 등³⁾의 방법에 따라 Helmholtz coil을 장치한 원통을 이용하여 시행하였다. A군은 하루 3시간, 주 5일씩 Helmholtz coil이 내장된 원통에 넣어 PEMS을 시행하였으며, B군에서는 PEMS를 제외한 모든 조건을 동일하게 유지하였다.

비디오후두내시경 관찰
   기능회복의 여부를 알기 위해 매주 1회 비디오후두내시경을 실시하였다. 흰쥐를 ketamine chloride(ketalar, 10 mg/100 g) 복강내 주사로 마취한 다음 2.7 mm 경성내시경(Karl Storz, Model 27018A, Germany)을 이용하여 후두내시경검사를 시행하였다. 검사결과는 카메라(CCD camera, Kay Electronics, Model 9111, USA)와 컴퓨터(Computer, Multimedia system, Kay Elemetrics, Model 9140, USA)에 연결된 후두스트로보스코피(Rhinolaryngeal stroboscope, Kay Elemetrics, Model 9100, USA)를 사용하여 기록하고, 모든 기록은 S-VHS Model 9132를 사용하여 녹화 및 재생하였다. 비디오후두내시경검사 결과는 성대고정, 호흡시 성대의 떨림, 호흡시 성대가 외전되는지의 3가지 형태로 구분하여 성대고정과 떨림은 회복이 되지 않은 것으로, 호흡하는 동안 외전이 정상적으로 일어나는 경우는 회복이 된 것으로 분류하였다. 후두기능회복의 판정은 실험에 참여하지 않은 2명의 이비인후과 의사가 참여하여 결정하였다.

자발 후두 근전도 측정
   실험과정이 끝난 12주 후 흰쥐를 희생시키기 전에 근전도를 통해 병변쪽인 좌측의 후윤상피열근과 정상쪽인 우측의 후윤상피열근의 호흡시 활동전위가 일치하는지를 관찰하여 전기생리학적 기능회복의 정도를 다시 한번 확인하였다. 흰쥐를 ketamine hydrochloride(ketalar, 10 mg/100 g) 복강내 주사로 마취시킨 후 상기방법으로 기관을 노출시킨 후 왼쪽에 있는 하인두수축근을 절단하여 왼쪽 갑상연골의 날개를 hook로 젖히고 윤상연골 뒤쪽의 후윤상피열근을 확인하였다. 접지전극(ground electrode)은 꼬리에, 기준전극(reference electrode)은 턱에 위치시키고 채널 1은 우측 후윤상피열근에, 채널 2는 좌측의 후윤상피열근에 hooked-wire 전극을 사용하여 연결한 후에 두 근육의 자발적인 근육의 활동전위를 보았다. Wire 전극을 통해서 얻은 근복합활동전위는 differential amplifier(cyber amp 380, Axon Instruments, CA)를 통해 증폭, 여과시켰고 다시 디지털화(Digidata, Axon Instrument, CA)시킨 후 컴퓨터에 저장하였고 파형의 분석은 Axoscope 프로그램(Axon Instrument, CA)을 사용하였다.

의핵내 운동신경원의 역행성 이중 추적방법
   상기 과정에서 얻은 기능이 회복된 흰쥐 8마리와 기능이 회복되지 않은 흰쥐 8마리, 정상 2마리를 이용하였다. 이들을 2개의 군으로 나누어 1군은 Horseradish peroxidase(HRP. type VI. Sigma Chemical Co, St. Louis, MO：U.S.A)와 Diamidino yellow(DY. D0281, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO. U.S.A)를 이용하여 역행성 이중추적방법을 시행하였고 2군은 Fast blue(FB. F5756, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO. U.S.A)와 Diamidino yellow(DY)를 이용하였다.
   1군에 포함되는 기능이 회복된 쥐 4마리와 기능이 회복되지 않은 쥐 4마리, 정상 쥐 1마리를 각각, 앞의 실험과정에서와 같이 마취하고 후두와 기관을 노출시킨 후 후두를 우측으로 약간 회전시키고 후윤상피열근을 찾아 10 μl Hamilton syringe를 사용하여 생리식염수에 희석된 30% HRP 0.5~1.0 μl를 주위조직으로 번지지 않게 조심하면서 주사하였다. 후두를 제자리에 위치시킨 후 갑상연골의 중앙선에서 왼쪽으로 2 mm 떨어진 지점에 No.10 knife를 이용하여 2×2 mm의 창을 만들고 갑상피열근과 외측윤상피열근을 노출시켰다. 10 μl Hamilton syringe를 사용하여 DY(2% aqueous suspension in 1% Dimethyl sulfoxide(DMSO)) 5~7 μl를 조심스럽게 주사하였다.
   2군에서는 위와 같은 방법으로 후윤상피열근에 FB(3% aqueous suspension in 1% DMSO) 1.0 μl 주사하고 갑상피열근과 외측윤상피열근에 DY(2% aqueous suspension in 1% DMSO) 5~7 μl를 조심스럽게 주사하였다. 각 군 모두 주사 후에는 주사부위에서 시약이 새지 않도록 gelform packing을 하고 수술부위를 봉합하였다.
   48~72시간이 지나면 다시 마취한 후 500 ml의 생리식염수로 심장내 관류를 시켰다. 1군은 500 ml의 1% paraformaldehyde와 2% glutaraldehyde in 0.2M sodium phosphate buffer(pH7.4, 4°C)를 이용하여 고정시키고 10% sucrose solution(phosphate buffer solution, pH7.4, 4°C) 500 cc로 관류시켰다. 그 후 뇌간, 좌측 반회후두신경을 적출하고 방향을 표시하였다. 조직의 급속 동결로 인한 손상을 막기 위하여 적출된 조직을 연속적으로 20%, 30% sucrose(0.2M sodium phosphate buffer)에 각각 24시간씩 냉장 보관하였다. sucrose 용액을 침투시킨 후 냉동절편기를 이용하여 조직냉동절편(40 μm 두께)을 만들었다. 이때 의핵을 포함하기 위해서 빗장(obex)에서 문측으로 600 μm, 미측으로 1600 μm거리까지 연속적인 횡절편을 제작하였다. HRP 발색과정은 tetramethyl bezidine 과정4)에 따라 발색시약에 횡절편한 조직을 2.0~4.0 ml의 0.3% H2O2를 첨가한 incubation 용액에 20분 동안 incubation한 후에 세척 없이 stabilization bath(증류수 45 ml＋absolute alcohol 50 ml＋sodium nitroferricyanide 9 gm＋pH3·3 acetate buffer 5 ml)로 옮겼다. Stabilization 후 증류수로 세척하고 chromalum으로 코팅된 슬라이드에 봉입한 후 대조염색은 핵 구조의 자세한 식별을 위하여 1% neutral red로 3분 동안 염색하였다. 계열 ethanol(70%, 95%, 100%)로 탈수하고 xylene으로 2회의 탈지과정을 거쳐 Permount로 coverslipping하여 모든 절편에서 HRP에 반응하는 신경세포를 광학현미경으로 관찰한다.
   2군은 4% paraformaldehyde(in 0.2M sodium phosphate buffer)를 사용하여 고정한 후 10% sucrose-fixative solution(in refrigerator keep in 4°C)으로 후고정하고 20% sucrose-fixative solution과 30% sucrose-fixative solution에 저장하였다. 저장 후 횡절편하여 형광현미경으로 판독하였다.

반회후두신경의 전자현미경 시료 제작
   신경재지배된 반회후두신경을 적출하여 문합부로부터 근위부로 4 mm, 원위부로 4 mm정도를 적출하여 근위부, 중간부, 원위부로 3등분하여 0.1M 인산완충액(pH7.4)으로 조정된 2.5% glutaraldehyde로 2시간 동안 전고정한 후, 동일 완충액으로 30분씩 2회 세척한 다음 1% osmium tetroxide(0.1M phosphate, pH7.4)로 1시간 후 고정하였다. 후고정한 표본을 동일 완충액으로 세척한 후 알코올 농도상승 순으로 무수알코올까지 완전 탈수 후 propylene oxide로 치환하여 epoxy resin에 포매하였다. 포매한 표본을 37°C에서 24시간, 67°C에서 48시간 방치하여 중합시킨 후 Reichert-Jung형 ultramicrotome으로 1 μm 두께로 잘라 1% toluidine blue로 염색하여 광학현미경으로 부위를 관찰하고 60~65 nm의 초박절편을 만들어 urannyl acetate와 lead citrate로 이중 전자 염색하여 Hitachi H-600형 투과전자현미경으로 관찰하였다.

Mapping
   HRP 발색 후 40 μm 두께로 횡절편한 조직을 5장씩 한 슬라이드에 올려 200 μm간격으로 보이는 세포의 수를 세었고 HRP 발색이 된 세포들이 있는 경우 17.5 cm×12.5 cm의 사진으로 촬영하여 뇌간의 정중구의 동측 경계로부터 발색된 세포들의 위치를 각각 X(내-외측 길이)와 Y(배-복측 길이)로 표시하여 각각의 거리를 구하고 좌표로 나타내었으며 모든 사진의 규칙성을 부여하기 위해 가장 긴 X와 Y를 구하여 가장 긴 x의 거리와 가장 긴 y의 거리로 각각의 좌표를 나누어주어 비율로서 나타내었고 각각의 점을 2차원 평면으로 표시하였다.

결     과

후두기능회복
   12주 동안 A군에서는 살아남은 32마리 중 20마리(63%)가, B군에서는 27마리 중 5마리(17%)에서 성대의 움직임이 회복되어 A군에서 높은 회복율이 관찰되었고 이는 통계학적으로도 유의한 소견을 보였다(Table 1).

의핵내 운동신경원의 역행성 이중 추적방법
   정상군에서는 DY/HRP를 이용한 경우와 DY/FB를 이용한 경우 거의 비슷한 소견을 보이고 있는데 빗장을 중심으로 많은 수의 발색된 세포들이 의핵내에 보이고 있으며 HRP나 FB를 주입한 후윤상피열근의 운동신경원에 비해 DY를 주입한 갑상피열근/외측 윤상피열근의 운동신경원이 의핵내에서 보다 미측 방향에 위치하는 것을 확인할 수 있었다(Table 2 and 3). 또한 갑상피열근/외측 윤상피열근의 운동신경원은 의핵내에서 배외측에 후윤상피열근의 운동신경원은 복내측에 위치하였다. 기능이 회복된 8마리의 쥐 중 1군과 2군 모두에서 발색된 세포들이 정상보다 전반적으로 약간 수가 감소된 양상을 보였으나 후윤상피열근의 운동신경원과 갑상피열근/외측 윤상피열근의 운동신경원의 의핵내에서의 위치관계는 정상군에서와 거의 동일하였다(Fig. 1). 그러나 기능이 회복되지 않은 쥐에서는 발색된 세포가 거의 나타나지 않았고 1군에서 2마리에서만 DY로 염색한 갑상피열근/외측 후윤상피열근의 운동신경원부위에 소수의 발색된 세포가 발견되었으나 정상군의 운동신경원의 위치에 비해 보다 문측으로 발색되었다. 2군에서도 2마리에서는 전혀 발색된 세포가 나타나지 않았으며 2마리에서는 극소수의 DY로 발색된 세포와 FB로 발색된 세포가 발견되었으나 갑상피열근/외측 윤상피열근의 운동신경원이 후윤상피열근의 운동신경원보다 문측으로 발견되었다(Table 2 and 3).
   HRP 발색된 세포의 좌표를 이용하여 2차원적 평면에 mapping한 결과 마찬가지로 기능이 회복된 후윤상피열근의 운동신경원은 정상군에서와 거의 위치가 비슷한 것을 볼 수 있었다(Fig. 2).

반회후두신경의 전자현미경 소견
   정상 반회후두신경은 큰 직경을 갖는 섬유가 중앙부에 위치하고 비교적 작은 직경을 갖는 섬유들과 무수초 섬유는 신경외막 주위에 위치하고 있었다(Fig. 3). 기능이 회복된 쥐에서는 근위부에서는 거의 정상과 비슷한 소견을 띄고 있는 축삭들이 보이고 유수화(myelination)는 정상보다는 비교적 얇지만 잘 재생되어있고 Schwann 세포가 얇은 유수섬유(myelinated fiber)를 포함하는 모습을 보이며 무수초 섬유들이 정상에서보다는 약간 증가되어있었다. 원위부의 사진을 보면 무수초 섬유의 수가 증가되어있으며 근위부처럼 얇게 유수화된 섬유를 보인다. 원위부는 일부 수초의 분열을 보이지만 축삭이나 Schwann 세포가 거의 정상소견을 보이고 있었다(Fig. 4). 기능이 회복되지 않은 쥐 8마리 중 6마리에서 반회후두신경은 근위부는 축삭의 크기가 작고 무수초 섬유와 얇은 유수섬유의 수가 증가되어있지만 정상에 가깝게 보이는 신경섬유들이 존재하고 있었다. 원위부에서는 유수화되어있는 축삭은 거의 보이지 않으며 섬유화와 대식세포가 보이고 일부는 변성된 축삭의 형태를 보이며 아직 용해소체(lysosome)를 갖고있는 대식세포의 소견을 보이며 축삭이 있어야할 자리가 빈공간으로 남아있기도 하였다(Fig. 5). 그러나 기능이 회복되지 않은 쥐 중 2마리에는 원위부에서도 기능이 회복된 쥐에서와 비슷하게 재생된 소견을 보이기도 했다.

고     찰

   반회후두신경은 성대의 내전근 및 외전근에 분포하는 운동신경과 성대 아랫부분의 후두의 감각을 담당하는 감각신경을 모두 포함한다. 반회후두신경마비는 악성종양, 염증, 외상 또는 두경부 영역의 수술 도중 부득이하게 발생할 수 있다. 현재의 반회후두신경 손상에 의한 성대마비의 치료는 일측성 마비인 경우 갑상연골성형술, 피열연골내전술, Teflon 주입법 등의 방법으로 마비된 성대를 내측으로 이동시켜 발성시 성대가 닫힐 수 있도록 도와주는 수준에 머물고 있으며, 양측마비인 경우 즉각적으로 호흡곤란이 생기기 때문에 피열연골제거술, 성대제거술 등으로 성대를 외전시켜 기도를 확보하여 호흡은 가능하게 해주지만 성대에 영구적인 손상을 주는 방법을 사용하고 있다. 이와 같이 기존의 성대마비 치료방법은 아직은 후두 자체의 생리적 기능을 무시하는 비효율적인 방법에 의하고 있는 실정이다. 따라서 반회후두신경의 손상으로 의한 성대마비의 가장 이상적인 치료는 생리적인 방법으로 어떤 형태로든지 후두의 신경재지배를 유도하여 성대의 정상 움직임을 회복하게 하는 것이다. 이를 유도하기 위하여 다양한 방법의 반회후두신경 문합술이 시도되었으나 반회후두신경은 기능적 해부학적으로 복잡한 신경으로 내전근과 외전근으로 가는 운동신경원이 신경섬유에서 분리되어있지 않고 분산되어있어 손상 후 재생될 때 부정확한 연결의 가능성이 다른 어떤 신경보다 높아 대부분 신경섬유의 재생이 잘못된 방향으로 유도되어 후두근육들의 공동운동(synkinesis)을 일으키게 되어 아직까지 성대 움직임이 완전히 회복되었다는 보고는 미미한 상태이며 성대근육의 긴장도와 크기를 유지하는 것에 만족하고 있다.¹⁾⁵⁾ 따라서 본 연구에서는 PEMS를 이용하여 반회후두신경 마비 후 후두기능이 회복된 쥐의 모델을 만들어 기능이 회복된 경우와 회복되지 않은 경우에 뇌간의 의핵내에서 후두내 근육을 지배하는 운동신경원의 재분포와 신경 절단부위에서의 재생 정도를 비교하여 후두기능이 회복되지 않는 원인을 분석하고자 하였다.
   본 실험에서는 기능 회복의 정도는 비디오후두내시경과 자발 후두 근전도로 평가하였으며 호흡 시에 나타나는 성대의 외전으로 기능의 회복을 평가하였다. 성대의 외전으로 기능의 회복을 평가하는 이유는 반회후두신경의 신경줄기내의 신경다발 중 외전근인 후윤상피열근으로 가는 부분이 25% 정도이고 나머지 75% 정도가 그 밖의 내전근으로 향하기 때문에 후윤상피열근의 기능회복이 보다 어렵다고 생각되기 때문이다.⁶⁾ 따라서 호흡시 외전이 되면 기능이 회복된 것으로 판정하였고 내시경검사상 진단에 혼동을 줄 수가 있으므로 갑상윤상근의 영향을 배제하기 위해 반회후두신경 절단시 동측의 상후두신경을 절단하여 내시경검사상 보이는 소견에 미치는 영향과 근전도 검사시 갑상윤상근의 전기적 활동의 영향을 배제하고자 하였다.⁷⁾⁸⁾ 매일 1~2 mm 정도씩 반회후두신경이 재생된다고 할 때⁹⁾ 재문합 후 12주경이면 완전한 재생이 이루어 지는 것으로 판단하여 이를 역행성 이중 추적방법과 반회후두신경의 재생정도를 확인하는 시점으로 삼았다.
   본 연구에서는 Chung 등³⁾의 연구에서와는 달리 PEMS를 준 군과 주지 않은 군의 기능이 회복된 흰쥐의 수를 비교해봤을 때 PEMS를 준 군에서는 20마리(63%), 자연적 기능 회복을 유도한 군에서는 5마리(17%)로 PEMS를 준 군에서 현저히 많은 수의 흰쥐가 기능이 회복되었고 두 군 사이의 회복률은 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(p<0.05). 이는 이전의 실험이 내시경 검사 전후에 마취 자체의 영향과 마취를 하고 검사를 시행하는 과정에서 구강내 분비물의 흡인 등에 의해 사망한 쥐의 수가 많아 통계처리에 어려움이 있었고 이번 실험에서는 사망한 쥐의 수가 적어서 보다 정확한 결과를 얻을 수 있었던 것으로 생각된다.
   본 연구에서는 정상 쥐 2마리와 기능이 회복된 쥐 8마리와 회복되지 않은 쥐 8마리에서 역행성 이중 추적방법을 이용하여 신경재문합 후 후두기능 회복이 제대로 이루어지지 않는 원인을 분석하고자 뇌간의 의핵내에서 후두운동신경원이 분포를 보고자 하였다. 현재까지 알려진대로 후두신경재지배 후 기능회복이 제대로 이루어지지 않는 이유가 misdirected innervation이 원인일 경우 회복되지 않은 쥐의 의핵내에서 후윤상피열근과 갑상피열근/외측윤상피열근의 운동신경원의 위치가 바뀌어 있을 것으로 예상되기 때문이었다. 처음 형광 염료(FB/DY)로만 역행성 이중 추적방법을 시행하였을 때 색 대비에 의한 효과와 후윤상피열근과 갑상피열근/외윤상피열근의 운동신경원을 동시에 확인해서 상대적인 위치관계는 알 수 있다는 장점은 있었으나 정확한 위치를 mapping하기에는 어려움이 있어 DY/HRP로 염색하여 HRP로 발색된 세포를 mapping하기로 하였다. HRP로 mapping할 경우 HRP 반응물이 장기간 안정성을 갖으며 counterstaining후에도 HRP로 염색된 세포체를 확인할 수 있고 광학현미경과 전자현미경 모두에서 확인 가능한 안정된 반응이라는 장점은 있으나 중추신경계의 모든 신경원과 축삭세포내로 투과하지는 못할 수 있고 특히 극도로 미세한 축삭은 세포내로 투과하기 어려우며 수지상 배열(terminal arborization)의 전체적인 크기와 연관해서 HRP가 주입한 전체 신경원과 축삭을 통해서 확산되는지 확신할 수가 없다.¹⁰⁾ 즉, 크기가 크면 전자밀도가 다르게 염색될 수 있고 시간과 노력이 많이 소모되는 단점이 있다. 그러나 구조와 기능사이의 연관관계를 확인하는 강력한 도구임에는 틀림없다.
   후두운동신경원의 정상쥐에서의 분포는 종단면에서의 위치관계를 보면 윤상갑상근의 경우 후안면핵과 의핵에 걸쳐서 위치하고 윤상갑상근의 운동신경원보다 미측 방향으로 후윤상피열근의 운동신경원이 있고 이보다 미측으로 갑상피열근, 외측윤상피열근, 피열간근 순서로 존재하며¹⁾ 횡단면에서의 위치관계는 윤상갑상근의 운동신경원은 배측부위에서 밀집되어 위치하고 후윤상피열근은 중앙부에 밀집되어있는 반면 갑상피열근은 복측부위에서 산재해있고 피열간근은 의핵에서 넓은 부위에 흩어져서 드물게 분포하고 있다.¹¹⁾¹²⁾ 윤상갑상근의 운동신경원은 중간 크기의 세포로 주로 문측 1/3부위에 외측윤상피열근, 갑상피열근보다 복외측에 위치하고 외측윤상피열근/갑상피열근의 운동신경원은 큰 운동신경원으로 주로 미측 2/3에, 후윤상피열근의 운동신경원은 의핵의 전체에 걸쳐있고 미측에 문측부보다 더 많이 분포되어있다.¹¹⁾ 빗장위치에서의 횡단면을 보면 후윤상피열근이 복내측, 갑상피열근/외측윤상피열근은 배측부에 위치해 있다.¹⁾ 본 연구에서 정상 반회후두신경을 이용하여 역행성 이중 추적방법을 통해 후두운동신경원의 상대적인 위치를 확인한 결과 이와 거의 일치하는 소견을 보였다.
   Flint 등¹⁾에 따르면 반회후두신경 재지배 후 후윤상피열근과 갑상피열근/외측윤상피열근의 운동신경원은 전반적으로 배측부로 이동하여 전체적으로는 정상군의 갑상피열근/외측윤상피열근의 운동신경원의 위치와 비슷하게되는데 이것이 신경재문합후에 무작위적으로 일어나는 의핵내의 후두운동신경원의 국소적 조직의 이동이며 이것이 misdirected reinnervation으로 공동운동을 일으키는 원인으로 보고 있다. 그러나 본 연구결과에 따르면 기능이 회복된 8마리의 쥐에서는 발색된 세포들이 문측과 미측에 특별한 차이 없이 정상보다 수는 감소된 양상을 보였으나 후윤상피열근의 운동신경원과 갑상피열근/외측 윤상피열근의 운동신경원의 의핵내에서의 위치관계는 거의 동일하였고 기능이 회복되지 않은 쥐에서는 DY/HRP로 염색한 4마리 중 2마리에서는 발색된 세포가 전혀 나타나지 않았으며 2마리에서는 DY로 발색된 세포만 소수 나타났으며 DY/FB로 염색한 4마리 중 2마리에서는 역시 전혀 발색된 세포가 나타나지 않았으며 나머지 2마리에서는 DY와 FB로 발색된 세포가 소수 나타났으나 의핵내에서 정상군에서와 같은 후두운동신경원의 분포를 발견할 수 없었다. 이는 전혀 발색되지 않은 4마리에서는 신경재생이 제대로 이루어지지 않아 뇌간의 의핵까지 역행성으로 시약이 도달하지 않았음을 의미하고 일부 발색된 경우는 DY/FB로 염색된 2마리에서 반회후두신경의 전자현미경 소견상 기능이 회복된 쥐에서와 비슷하게 재생된 소견을 보이는 것으로 보아 misdirected innervation의 가능성을 생각해 볼 수 있었다.
   전자현미경상 정상적인 흰쥐의 반회후두신경내에서 유수섬유의 평균 직경은 2~3 μm와 4.5~7 μm의 2 peak를 갖고 작은 섬유의 수는 신경의 말단에서는 감소한다. 또한 상당수의 무수초 섬유(0.2~0.6 μm)를 포함하고 이는 전체 축삭중에서 50~60%를 차지한다. 유수섬유는 다양한 직경으로 여러 구획에서 군으로 분류되어 있고 주로 큰 직경을 갖는 것이 중앙의 주요 부위를 차지하고 작은 직경을 갖는 섬유는 신경외막주변에서 여러 개의 무수초 섬유와 함께 존재한다. 혼재되어있는 무수초섬유는 신경절후의 교감신경 섬유 또는 신경절후 부교감신경섬유로 추정된다.¹³⁾ 이러한 신경이 손상받은 경우 신경이 재생될 때 처음 손상 후에는 1~2주간 축삭세포수와 Schwann 핵의 수가 정상의 3배 이상 증가했다가 3개월 후에 정상 범위로 감소된다. 말초신경의 미세환경에서 특히 Schwann 세포의 기저판 등이 말초 신경원의 축삭 재생에 전도성 성격을 갖는다고 가정되어있고 특히 Schwann 세포의 기저판은 자라는 축삭의 기질로 작용하고 재생되는 축삭의 효과적인 통로역할을 한다. 따라서 재생 기간동안 Schwann 세포의 증식이 뚜렷하고 기저판은 여러 세포외 물질 또는 신경내막의 교원질에 의해 둘러싸인 관을 형성한다.⁹⁾ 무수초 섬유의 재생은 4단계를 거치게 되는데(축삭의 sprouting, 종적 성장, 여분의 sprout 소실, 축삭의 성숙) 손상 후 3개월 정도 지나면 여분의 축삭의 sprout가 감소하면서 전체적인 축삭의 수가 정상 범위로 감소하게된다. 이러한 감소는 말초부위에서 연결을 만드는데 실패한 축삭의 위축과 흡수 때문인 것으로 생각된다. 본 연구에서 정상 반회후두신경은 위에서와 동일한 소견을 보이며 기능이 회복된 쥐의 근위부에서는 거의 정상과 비슷한 소견을 띄고 있는 축삭들이 보이고 유수화는 정상보다는 비교적 얇지만 잘 재생되어있고 무수초 섬유들이 정상에서보다는 약간 증가되어 있었다. 원위부에서는 무수초 섬유의 수가 증가되어있으며 근위부처럼 얇게 유수화된 섬유를 보이며 원위부는 일부 수초의 분열을 보이지만 축삭이나 Schwann 세포가 거의 정상소견을 보이고 있었다. 이처럼 전반적으로 무수초 섬유의 수가 증가되어 보이는 것은 아직 여분의 축삭의 sprout가 감소하지 않은 단계이기 때문인 것으로 생각된다. 기능이 회복되지 않은 쥐에서의 반회후두신경은 근위부는 축삭의 크기가 작고 무수초 섬유와 얇은 유수섬유의 수가 증가되어있으며 정상에 가깝게 보이는 신경섬유들이 존재하고 있었지만 원위부에서는 2마리를 제외하고는 거의 정상적으로 재생된 축삭이 보이지 않고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이는 부적절한 축삭의 재생에 의해 후두기능이 회복되지 않는다는 것을 의미하며 위에서의 역행성 이중 추적방법의 결과와도 일치한다.
   본 연구에서는 역행성 이중 추적방법과 전자현미경 관찰상 반회후두신경의 재문합 후 후두의 기능회복이 제대로 이루어지지 않는 원인이 기존의 학설처럼 주로 misdirected innervation에 의한 것이라기 보다는 불완전한 축삭의 재생이 보다 많은 원인으로 작용하는 것으로 결론지을 수 있었다. 그러나 본 실험에서는 장기간 대량 사육이 가능한 흰쥐를 사용했으나 후두는 그 구조가 복잡하고 미세하기 때문에 개나 고양이같은 보다 큰 실험동물을 이용한 추가적 실험이 필요할 것으로 생각되며 이러한 결과를 바탕으로 임상적으로 반회후두신경의 문합부에서의 축삭 재생을 촉진시킬 수 있는 방법에 대한 고안이 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   흰쥐의 반회후두신경 절단 후 신경말단끼리 일차문합하여 만든 동물 모델에서 12주 후에는 A군에서는 20마리(63%)가, B군에서는 5마리(17%)가 성대의 움직임이 회복되어 A군에서 높은 회복율이 관찰되었다. 이는 통계학적으로 의미 있는 결과를 보였다(p<0.05). 따라서 이 연구결과는 반회후두신경의 신경재문합 후 기능회복에 있어서 PEMS의 적용이 후두의 기능회복율도 증가시키는 역할을 한다는 것을 의미한다.
   기능이 회복된 쥐에서는 의핵내에 발색된 neuron의 수는 정상쥐에서보다 다소 감소했지만 후윤상피열근과 갑상피열근/외측윤상피열근의 운동신경원의 위치는 정상쥐의 운동신경원의 위치와 유사하였고 전자현미경소견에서 반회후두신경은 비교적 신경재생이 잘된 소견을 보였다. 반면 기능이 회복되지 않은 쥐에서는 역행성 이중 추적방법상 거의 발색된 신경원이 없었으며 일부 발색된 경우에도 정상적인 위치에 존재하지 않았고 전자현미경소견에서는 2마리에서 신경재생이 된 소견을 보이기도 하였으나 대부분에서 신경재생이 제대로 이루어지지 않았음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 실험의 결과에서는 반회후두신경의 재문합 후 후두의 기능회복이 제대로 이루어지지 않는 원인이 기존의 misdirected reinnervation 뿐만 아니라 문합부에서의 불완전한 축삭의 재생이 보다 많은 원인으로 작용하는 것으로 생각된다.

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