교신저자：박기현, 442-721 경기도 수원시 팔달구 원천동 산 5번지  아주대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   중이 진주종은 임상적으로 골파괴가 강한 침습성향과 수술 후 높은 재발 등의 임상적 성향과 세포생물학적으로 상피세포의 과증식과 세포분화의 이상을 보인다는 면에서 종양세포와 유사점이 있다.¹⁾ 그럼에도 불구하고 현재까지 분자생물학적연구나 유전학적인 어떠한 연구의 결과에서도 진주종은 실제 종양세포와는 완전히 구별된다. 즉 중이진주종은 감염이나 고막의 유착 등에 의해 유발되는 지속적인 염증반응의 결과 각종 염증의 매개인자들이 상피세포의 분화와 증식의 변화를 초래한다고 이해된다.^2)3)4)5) 그러나 이러한 변화가 과연 가역적인 변화냐, 아니면 비가역적, 즉 한번 진주종으로 변화되면 정상적인 상피로 돌아올 수 없는지는 아직까지 많은 논란이 있다. 이러한 논란은 임상적으로 진주종은 어떠한 경우에서도 완전히 제거되어야 된다는 주장과 염증이 제거되고 진주종상피가 외부로 노출되는 환경이 가능한 경우에는 보존될 수 있다는 주장이 맞서고 있는 이유가 된다. 저자들은 중이진주종의 비정상적인 증식 및 분화가 감염이나 염증과 같은 특수한 환경속에서만 발생하는 현상이라고 생각하고, 따라서 진주종의 비정상적인 분화 및 증식은 가역적일 수 있다고 가정해본다. 실제로 이러한 가능성은 임상에서도 간혹 볼 수 있는데 외이도 진주종 환자의 경우나 초기 진주종 환자의 경우 케라틴을 잘 제거하고 염증을 적절히 조절하면 시간이 지나도 특별한 문제가 생기지 않는 것이 그 실례이다. 하지만 진주종에 의해 내이에 누공이 발생되어 수술을 시행할 때, 누공을 덮은 진주종의 일부를 완전히 제거하지 않고 남겨 둔 경우 특별한 염증 반응 없이도 감음신경성 난청이 진행되는 경우도 있다. 이런 상반된 점들을 생각해 볼 때 아직까지도 증식 및 분화에 이상을 보이는 진주종이 다른 종양과 마찬가지로 증식 및 분화에 비가역적인 변화를 보이는 것인지, 아니면 케라틴 및 염증이 조절되면 정상적인 상피 세포의 특성으로 돌아갈 수 있는지에 대한 의문점이 제기되고 있지만 이를 입증하는 연구는 미비한 실정이다. 따라서 진주종 피부 상피세포 증식 및 분화의 이상이 염증이나 케라틴 축적과 같은 비정상적인 조건을 정상적인 조건으로 변화시킬 때 증식 및 분화는 어떠한 양상을 보이는 지를 보는 것은 임상적으로 중요한 의미를 가질 수 있다.
저자들은 진주종에게 정상적인 환경이 제공된다면 정상 상피 조직과 같은 증식 및 분화의 특성을 보일 수 있다는 가정 하에 이를 실험적 진주종 모델을 통하여 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

실험 재료
   실험 동물은 성숙한 Mongolian gerbil 20마리를 대상으로 하였으며 20마리 중 18마리는 양쪽 귀에 외이도 결찰을 시행하였고 나머지 2마리는 정상군으로 하였다. 실험적 진주종의 유발은 McGinn 등⁶⁾이 제창한 방법을 이용하였으며, 이는 Mongolian gerbil의 양쪽 귀에 외이도 결찰을 하여 실험적 진주종을 유도하였는데, 이들에게 Xylazine과 Ketamine hydrochloride를 근육 주사한 후 귀 뒤의 피부를 절개하여 외이도 연골이 확인 될 때 까지 박리한 후 외이도에 손상이 없도록 주의하면서 봉합사를 이용하여 외이도를 결찰하였다. 외이도 결찰 기간을 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월로 서로 다르게 나누었다. 외이도 결찰로 유발된 진주종은 그 정도에 따라 Chole의 분류²⁾에 따라 stage I-V까지 구분하였으며 Mongolian gerbil을 국소마취 후에 후이개 상피를 절개하고 골포를 일부 제거한 후 안을 관찰하여 stage를 확인하였다.
   실험군으로 치료군은 양쪽 귀중 한쪽귀의 결찰을 풀고 케라틴을 완전히 제거하고 외이도에 환기를 유지시키고 Ofloxacin 점이액을 점적하여 귀의 청결을 유지한 후 외이도가 완전히 마르고 외견 상 염증의 소견이 없을 때 까지 국소 치료를 하였는데 2주가 소모되었다. 치료 후 측두골 절편을 얻기 위해 측두골을 분리한 후 10% formaldehyde에서 고정하고 5% EDTA로 약 3주간 탈석회화하였다. 조직은 파라핀에 포매한 후 5 μm의 두께로 절편을 만들어 실험에 사용하였다. 치료를 하지않은 반대쪽 진주종을 진주종군으로 삼았고 정상 심부 외이도 상피를 정상군으로 삼고 같은 과정을 통하여 조직 절편을 얻었다. 조직 절편 중에는 고막에 인접한 절편들이 실험에 사용되었다. 

면역조직화학적 염색
   염색을 위해 준비 된 조직 절편을 탈파라핀시키고 탈수한 다음 3% 과산화수소수로 내재성 peroxidase를 억제시킨다. 상피 증식의 표지인자로 PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)(Dako, Carpinteria, CA, U.S.A.), CK(Cytokeratin) 13/16(Sigma Chemical Company, St. Louis, U.S.A.)를 각각 1：100, 1：20으로 희석한 후 4℃에서 12시간 반응시켰고, 이차 항체를 처리한 후 ABC(aVidine-biotin peroxidase complex)법으로 염색한 후 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole, Vector, CA, U.S.A.)로 발색하였다. 대조 염색은 Harris hematoxylin을 사용하였다. 

TUNEL 염색
   면역조직화학적 염색법과 동일한 방법으로 준비된 조직절편에 In situ Apoptosis Detection Kit(Takara Shuzo Co., Japan)을 이용하여 terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)와 labeling 혼합용액을 투여하고 37℃, 90분간 습한 용기내에서 반응시켰다. 반응 종료 후 다시 PBS로 세척하고(10분, 3회) anti-FITC HRP conjugate와 37℃ 30분간 반응시켰다. 발색은 AEC, 대조염색은 Harris hematoxylin을 사용하였다. 

결과 분석 
   진주종군 상피, 치료군의 상피 및 심부 외이도 상피를 기저층(basal layer)과 기저 상층(suprabasal layer)으로 나누어 염색의 강도를 비교 하였다. 염색 반응 정도에 따라 반응이 나타나지 않은 경우를 음성(negatiVe, -)으로, 반응이 애매한 경우를 모호성(equiVocal, ±)으로, 약하게 염색된 경우를 양성(positiVe, +)으로, 강하게 염색된 경우를 강양성(strong positiVe, ++)으로 분석하였다.
   TUNEL 염색은 실험적 진주종 상피와 정상 심부 외이도 상피를 비교하여 사람에서 보고된 결과와 동일하게 TUNEL 양성세포가 현저하게 증가됨이 확인된 후 치료군과 진주종군을 비교하였다. 

결     과

각 병기의 진주종군, 치료군의 수 및 정상 심부 외이도 상피의 수
   외이도 결찰을 시행한 Mongolian gerbil 18마리를 2개월 후부터 매달 각각 3마리를 한쪽은 진주종군 한쪽은 치료군으로 나누어 진행한 결과 실험적 진주종 군이 stage I이 3귀 stage II가 3귀, stage III가 3귀, stage IV가 2귀였다. 각 병기에 따른 치료군의 수도 동일하였다. 한쪽 귀 또는 양쪽 귀에서 실험적 진주종이 유도되지 않은 Mongolian gerbil은 실험에서 제외 시켰는데 이들이 4마리였고 사망하여 실험이 불가능해진 Mongolian gerbil이 3마리였다. 진주종군 상피와 치료군 상피를 기저층과 기저상층으로 나누어 병기별에 따른 PCNA 및 CK 13/16 면역 조직화학 염색과 TUNEL 염색의 결과를 정리하면 Table 1과 같다. 

PCNA 면역조직화학적 염색 
   정상 외이도 상피와는 다르게 진주종 상피의 경우 기저층뿐만 아니라 기저상층에서도 양성 발현되는 세포를 많이 발견할 수 있었다(Fig. 1C and D). 병기 별로는 stage I, II(Fig. 3)와 같은 초기 단계인 경우보다 stage III, IV(Fig. 4)와 같이 진행된 경우에 기저상층에 더 많은 양성 발현을 관찰할 수 있었다. 
   치료군에서는 기저층에는 약하게 양성 발현을 보였지만 기저상층에는 거의 발현이 되지 않아 정상 심부 외이도 상피와 비슷한 양상을 보였다(Figs. 3 and 4). 병기 별로는 stage IV에서만 기저층이 강하게 기저상층이 약하게 양성 발현을 보였다.

CK 13/16 면역조직화학적 염색
   정상외이도 상피와는 다르게 진주종 상피에서는 CK 13에 의하여 기저층이 발현되고 과증식을 볼 수 있는 CK 16에 의하여 기저상층에서도 양성 발현되는 세포를 많이 발견할 수 있었다(Fig. 1A and B). 병기 별로는 stage I, II(Fig. 5)와 같은 초기 단계인 경우보다 stage III, IV(Fig. 6)와 같이 진행된 경우에 기저상층에 더 많은 양성 발현을 관찰할 수 있었다. 
   치료군에서는 기저층에는 약하게 양성 발현을 보였지만 기저상층에는 발현이 되지 않아 정상 심부 외이도 상피와 비슷한 양상을 보였지만 stage IV의 경우 기저층이 강하게 기저상층이 약하게 양성 발현을 보였다(Figs. 5 and 6). 

TUNEL 염색 
   TUNEL 염색의 결과를 보면 정상외이도 상피와는 다르게 진주종에서 TUNEL 양성인 세포가 증가되어 있고(Fig. 2) 치료군의 경우는 TUNEL 양성인 세포 수는 정상 심부 외이도 상피와 비슷하였다(Figs. 7 and 8). 치료군에 있어서 각 stage에 따라 큰 차이는 보이지 않았지만 진행된 경우(stage IV)에는 진주종과 유사한 특성을 보였다. 

고     찰 

   중이 진주종은 중이강 내에 각화된 편평상피가 존재함으로써 유발되는 비교적 흔한 질환으로 중이강 내에 피부 상피가 존재하면 지속적인 염증반응을 유발하여 상피의 증식 및 분화에 이상을 초래하고 결과적으로 진주종의 특성인 골파괴 현상이 생겨 이소골 파괴 및 소실에 의한 청력장애, 내임파 누공 및 두개내 합병증 등을 유발하는 질환이다. 즉, 중이 진주종은 골파괴를 통하여 여러 합병증을 일으킬 수 있는 질환이다. 
   최근 진주종의 병인에 대한 연구가 활발하게 이루어지고 있는데, 세포생물학이 발전하면서 사이토케라틴이나 상피의 증식 및 분화의 표지인자를 이용한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.^2)3)4)5) 사람의 진주종이나 여러 방법을 통하여 실험적으로 유도된 진주종에서⁷⁾⁸⁾ 진주종의 증식 및 분화의 이상을 증명하였고 분화의 최후과정인 세포의 사멸은 apoptosis의 특수한 형태로 진행되고 있다고 알려져 있다.⁴⁾⁹⁾ 또한 이러한 분화 및 증식 이상이 염증 반응의 산물인 여러 가지의 EGF나 cytokine 등에 의한 외부 신호가 PLC-γ 등의 inositol pathway에 의해 이차신호 전달체계로 전달됨으로써 이루어진다고 알려지고 있지만¹⁰⁾ 자세한 신호전달체계나 이들이 어떻게 조절되는지는 알려지지 않았다. 이렇듯이 정상적인 피부 상피의 경우 증식 및 분화가 상호 보완관계를 가지며 세포층을 일정하게 유지하는데 반하여 진주종은 다른 피부 상피에서 발생하는 종양과 비슷하게 세포의 과증식 및 변화된 분화양상을 보여 종양과도 유사한 특성을 가지고 있다.¹⁾ 하지만 진주종은 종양과 비슷한 성향을 보이지만 일반적인 종양과는 달리 염증에 의한 여러 가지 매개 물질들에 의해 병이 진행되는 질환이다. 처음에는 이러한 진주종의 변화된 특성 때문에 진주종이 양성 종양의 일종으로 생각되었으나 조직학적인 연구를 통해 종양과 확연하게 구별되는 염증성 질환임이 밝혀졌다. 결국 진주종은 종양과 비슷한 특성을 보이지만 종양과는 구별되는 질환이다. 진주종의 형성과정에서 나타나는 많은 분자 생물학적 물질들은 상피세포가 transformation되는 과정에서 발견되는 물질들과 유사한 것들이라는 주장이 계속되고 있다. 한 예로 EGFR의 분비증가와 활성화는 정상 상피와는 달리, 기저상피세포층에서 관찰되며, 정량적으로 75%이상 증가되었다. 또한 진주종 상피의 전 층에서 TGF-α의 증가발현은 공통된 소견이다. 따라서 진주종상피 내에서 이러한 물질들이 autocrine stimulation형태를 띠기 때문에 진주종이 중이강 내에서 종양과 같이 성장의 제한 없이 자랄 수 있다는 가설이 뒷받침된다. 그렇다면, 과연 진주종은 어떠한 질환이냐는 원천적인 의문은 아직도 완전히 풀리지 않고 있다. 이에 대한 견해 중 최근까지 가장 지지를 받고 있는 주장은 진주종에서 초래되는 유전학적 변화는 염색체 수준이 아니라 유전자 수준이라는 것이다. 다시 말해 진주종의 성장과 침습성향은 세포의 분화조절기능의 일시적인 장애에 기인된 것이라는 주장이다. 즉, 진주종의 결체조직성분이나 국소적인 주위환경에서 분비되는 여러 성장 인자, lymphokine, 그리고 cytokine의 조화되지 않은 생산이 조절되지 않는 성장을 초래한다는 설이다. 이러한 현상은 임상적으로 진주종이 급성기의 감염이나 염증반응이 있는 경우에 더욱 특징적으로 나타나며, 감염이나 염증이 거의 없는 경우에서는 매우 약하게 나타난다. 
   동물에서 실험적으로 진주종을 유발하는 방법으로는 중이강내에 propylene glycol이나⁹⁾¹¹⁾ chemical irritant를 투여하거나,¹²⁾ 이관을 폐쇄하여 진주종을 유발하는 방법,¹²⁾ 외이도를 폐쇄하는 방법,⁶⁾⁷⁾ 중이강내에 자가 피부를 이식하는 방법 등이 있다. 이러한 방법들 중에서 진주종의 가역성을 연구하는데 외이도결찰에 의해 유도한 Mongolian gerbil모델은 여러 가지 장점을 갖고 있다. 첫째로 진주종이 유도된 후 지속적인 성장이 가능하며, 둘째로 일단 형성된 진주종을 외과적으로 쉽게 제거할 수 있다. 셋째로 진주종의 세포 생물학적인 특성이 사람의 중이 진주종과 거의 동일한 특성을 보인다. 다만 gerbil의 특성은 외이도 상피가 다른 종과 비교할 때 정상적으로 높은 과증식성향을 띠고 있기 때문에 자연 외이도진주종이 잘 유도된다는 점이다. 이러한 특성은 본 연구에서 실시한 TUNEL염색의 결과에서도 엿볼 수 있다. 즉 정상 상피와 비교해 볼 때 사람의 진주종과 gerbil의 외이도 진주종상피에서 TUNEL염색된 세포는 현저히 증가되었으나, 사람의 경우 TUNEL염색에 양성인 세포는 기저상층에서만 관찰된 반면, gerbil의 경우 일부 기저세포에서도 관찰됨을 알 수 있었다. 이러한 차이는 독특한 증식과 분화특성을 보이는 gerbil의 특성으로 생각된다. 한편, 외이도 결찰로 유발된 진주종은 그 정도에 따라 Chole의 분류에 따라 stage I-V까지 구분할 수 있다.²⁾ stage I은 고막의 위치 변화 없이 케라틴이 외이도에 가득 찬 경우이고, stage II는 고막이 안으로 밀려들어 왔으나 와우에는 도달하지 않는 경우, stage III는 고막이 와우와 접촉한 경우, stage IV는 골포 전체가 진주종으로 가득 찬 경우, stage V는 진주종이 두 개강으로 진행된 경우이다.
   PCNA는 분자량 36 kd의 DNA polymerase의 보조단백으로 증식하는 세포에서만 증명되는 nuclear antigen과 반응하는 자가항체이다. 1978년 Miyachi 등¹⁴⁾이 처음 발표한 이 단백질은 G1 후기에 핵내에서 발현되기 시작하여 S기에 최고로 도달하며 G2 및 M기에 감소한다고 알려져 있다.¹⁵⁾ PCNA leVel은 휴지기의 세포에는 미약하게 존재하지만 증식 중의 세포에는 증가하여 세포의 증식에 결정적인 역할을 하고 세포 증식을 아주 잘 표현하는 핵 단백으로 알려져 있다.¹⁶⁾ 진주종의 연구에도 PCNA는 자주 이용되고 정상 상피세포와는 달리 진주종에서는 기저층만이 아니라 기저상층에서도 PCNA 양성인 세포를 볼 수 있어 진주종에서는 증식도가 증가되었음을 알려주고 있다. 본 연구에서도 진주종군의 PCNA 양성 세포는 많이 증가하였고 그 층이 기저 상층까지 확장되었지만 치료군의 결과에서는 정상 상피와 유사하였다. 
   Cytokeratin은 세포의 구조 골격을 구성하는 여러 성분 중 40에서 60kd의 분자량을 가지는 비수용성의 중간세사로 이들의 종류는 여러 가지가 있고 각 조직의 종류, 각 종, 세포의 성장과정, 질병의 상태에 따라 뚜렸한 기본 단위의 차이가 있어¹⁷⁾ cytokeratin의 기본 단위의 변이에 대한 연구를 통하여 질환의 기원 기관을 알 수 있을 정도이다.¹⁸⁾ 이들 중 cytokeratin 16은 건선, 지루성 피부염, 편평상피암 등과 같이 과증식 질환에서 볼 수 있는 cytokeratin이고¹⁹⁾ cytokeratin 13은 미분화된 상피의 기저 층에서 발견되는 cytokeratin으로²⁰⁾ 진주종에서도 많은 연구가 진행되어 정상 상피와는 달리 진주종에서 다른 과증식 질환과 마찬가지의 결과를 보인다고 알려져 있다. 본 연구에서도 진주종군의 경우 과증식 성향을 보였지만 치료군은 stage IV를 제외하고는 정상 상피와 비슷하였는데, stage IV가 치료군과 비치료군에서 유사한 양상을 보인 이유는 진주종이 너무 진행되어서 진주종의 처치가 불완전 하였거나 치료기간이 짧았기 때문인 것으로 추정할 수 있겠다. 임상적으로 중이 진주종의 치료는 수술을 통하여 진주종을 완전히 제거하고 청력을 복원시키는 방법이 이용되고 있다. 하지만 최근에는 과거에 비하여 진주종이 초기인 상태로 발견되는 예가 흔하여 이런 경우 과거와 같이 destructiVe한 수술을 시행해야 하는 지에 대한 의문점이 제기되고, 진주종에 의해 내이 누공이 있는 경우 진주종 상피를 일부 남기고 수술을 할 것인지, modified radical mastoidectomy를 시행하는 경우 진주종의 내측 피부 상피를 남길 것인지의 여부에 대한 논란은 아직도 지속되고 있다. 진주종에 의한 골파괴가 진주종의 과증식 및 분화의 이상에서 오는 과케라틴 형성이나 염증 반응에 의한 여러 분비 물질에 매개되어 일어나는 것이 확인되었다. 만약에 이와 같은 원인 요소를 제거하는 경우 진주종이 다시 정상화되어 정상 상피와 같은 성질을 가지게 된다는 것이 증명된다면 진주종의 치료 방법 설정에 아주 좋은 지표로 이용될 수 있을 것이다.
   저자들의 결과를 보면 치료군의 분화인자 및 TUNEL 염색의 발현이 정상군과 비슷하게 나타나서 진주종의 성장 및 분화의 변화가 결국 종양과는 달리 가역적일 수 있다는 것을 증명하였다. 물론 외이도 결찰을 통한 실험적 진주종이 사람의 중이 진주종과는 근본적으로 차이가 있을 수 있지만 저자들은 진주종은 특수한 환경속에서 병이 진행될 수 있으며 이러한 환경을 제거하는 경우에는 정상으로 환원될 수 있다고 생각한다. 저자들의 결과에서도 진주종이 상당히 진행된 stage III, IV의 경우에는 처치를 시행한 실험군의 결과가 진주종과 유사한 결과를 보였는데 이는 진주종에서 케라틴을 제거하거나 염증을 조절하는 것이 현실적으로 어려워서 이러한 결과가 나왔을 것으로 생각되고 이러한 점은 임상에도 연결되리라고 생각된다. 결국, 모든 중이 진주종의 치료에는 적용될 수 없지만 합병증이 동반되지 않은 초기의 진주종이나 외이도 진주종과 같이 수술적 치료 없이 간단한 처치나 약물치료로 진주종의 염증을 제거하고 환기를 시킬 수 있다면 그 자체가 병의 진행을 막는 치료로 이용될 수 있을 것이라고 사료된다. 

결     론

   진주종 상피의 증식 및 분화의 이상이 가역적인 것을 알아보기 위하여 Mongolian gerbil을 이용하여 실험적 진주종을 유도한 군과 유도된 진주종의 결찰을 풀고 케라틴을 제거한 후 처치를 시행한 실험군 및 정상 심부 외이도 상피에 PCNA, CK13/16, TUNEL 분석을 통해 이들의 증식 및 분화도를 비교하여 다음과 같은 추론을 할 수 있었다.
   치료를 한 실험군은 진주종군보다는 정상 상피에 가까운 증식이나 분화도를 보였는데, 이는 진주종의 비정상적인 증식이나 분화도는 가역적이라는 사실을 뒷받침하리라고 추정할 수 있다. 결국 진주종은 종양과 같은 비가역적인 질환이 아니라 염증이나 감염, 케라틴의 축적과 같은 비정상적인 환경에서는 종양과 같은 성질을 보이지만 비정상적인 환경을 제거하면 종양과 같은 성질은 정상으로 변화될 수 있으리라 사료된다. 결국 진주종의 과증식 성향이나 분화의 변화 같이 진주종의 임상적 특성을 나타내는 변화가 가역적인 것이라면 이 결과는 진주종의 치료 방침이나 방법의 결정에 중요한 지표로 자리 잡을 수 있으리라 생각된다. 

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