교신저자：태 경, 471-701 경기도 구리시 교문동 249-1  한양대학교 의과대학 이비인후과학교실
              전화：(031) 560-2363 · 전송：(031) 566-4884 · E-mail：kytae@hanyang.ac.kr

서     론

   신생혈관생성은 기존의 모세혈관에서 새로운 모세혈관이 형성되는 것으로 정상적으로는 배성장(embryonic development) 및 상처 치유의 과정에 작용하며, 병적인 경우로는 당뇨병성 망막장애, 동맥경화증, 건선, 류마티스성 관절염 및 암종의 증식과 연관이 있다.¹⁾²⁾³⁾ 암종과 신생혈관생성은 밀접한 연관이 있는 것으로 많은 연구에서 밝혀지고 있으며 악성 종양에서 새로운 혈관의 생성은 암세포가 증식하고 성장하는데 필수적인 과정이며, 암세포의 성장과 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다.¹⁾²⁾ 피부 악성 흑색종, 유방암, 비소세포성 폐암 등 인간의 여러 악성 종양에서 미세혈관밀도로 측정한 신생혈관생성의 정도는 원격 전이 및 생존율을 예측할 수 있는 지표로 보고 되었으며 미세혈관 밀도가 높은 경우 원격전이를 잘 일으키며 나쁜 예후 및 낮은 생존율과 연관이 있다고 보고 되었다.⁴⁾⁵⁾⁶⁾
   Ki67은 세포분열의 G1, S, G2 phase에서 발현되는 345 k Da이나 395 k Da의 분자량의 단백질로 종양의 증식지표로 사용할 수 있으며 여러 종양에서 의미 있는 예후 인자로 보고되었다.⁷⁾⁸⁾
   이에 저자들은 갑상선 종양 환자에서 면역조직화학적 방법으로 미세혈관밀도 및 Ki67 발현을 측정하고 의무 기록의 후향적 분석을 통하여 갑상선 종양에서 신생혈관 생성 및 세포 증식지표의 의의를 알아보고자 본 연구를 시행하였다.

대상 및 방법

대  상
   1995년부터 2001년 사이에 한양대학교의료원 이비인후과에서 갑상선 종양으로 수술받은 환자 중 조직의 파라핀 종괴의 보관이 양호하고 추적 관찰이 가능하였던 70예를 연구대상으로 하였다.
   70예 중 60예가 여성, 10예는 남성이었으며, 연령은 14~74세로 평균 46세였다. 총 70예 중 양성종양이 38예, 악성종양이 32예였다. 양성종양 38예 중 선종성 과형성증(adenomatous hyperplasia) 27예, 여포상 선종(follicular adenoma) 11예였으며, 악성종양 32예 중 유두상암종(papillary carcinoma) 29예, 여포상 암종(follicular carcinoma) 3예였다.

방  법

면역조직화학적 염색
   미세혈관밀도와 종양의 증식지표는 이중면역조직화학법을 이용하여 측정하였다. 미세혈관밀도의 측정은 혈관 내피 세포의 세포막에 특징적으로 존재하는 CD34에 대한 항체를 이용하였으며, 종양 증식지표의 측정은 Ki67에 대한 항체를 이용하였다. 파라핀 포맷조직에서 4 μm 두께의 절편 슬라이드를 만들어 사용하였으며 xylene에 20분간 탈 파라핀 과정을 거쳤다. 100%, 90%, 70%, 30%의 ethanol에 각각 처리하여 함수화를 유도하였으며 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위하여 methanol과 hydrogen peroxidase를 1：4로 혼합한 용액에 15분간 반응시킨 후 Tris-buffered saline(이하 TBS, pH 7.0)에 3회 세척한 후 citric acid(pH 6.0) 용액에 담그고 전자렌지에서 가열하여 항원회복(antigen retrieval)을 시행하였다. Blocking 항체를 도포하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 TBS 용액에 3회 세척하였다. Ki67에 대한 단클론항체(NeoMarker, CA, USA)를 도포하여 반응시킨 후 TBS에 세척하였으며, 이차 항체를 도포하여 반응시킨 후 재차 세척하였다. ABC(Avidin-biotin complex, Vectastain, CO, USA)를 도포하여 37℃에서 30분을 반응시킨 후 3, 3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)로 발색하였다. Ki67에 대한 염색이 끝난 슬라이드를 TBS에 세척한 후 다시 CD34에 대한 단클론 항체(NeoMarker, CA, USA)를 도포하여 반응시킨 후 TBS에 세척하였으며, 이차 항체를 도포하여 반응시킨 후 재차 세척하였다. ABC(Avidin-biotin complex, Vectastain, CO, USA)를 도포하여 3-Amino-9-Ethylcarbazole(AEC)로 발색한 후 universal mount를 이용하여 봉입하였다.

평균미세혈관밀도 및 신생미세혈관밀도의 측정
   동일한 부위의 다른 슬라이드를 헤마톡실린-에오신으로 염색하고 종양이 있는 부분을 슬라이드에 표시한 후 항 CD34와 Ki67 항체를 이용하여 이중 면역조직화학법으로 염색한 슬라이드를 겹쳐서 종양이 있는 동일한 부분을 표시하였다.
   광학 현미경 100배 시야에서 각 슬라이드를 대상으로 종양이 있는 부분을 찾아서 CD34에 의해 혈관 내피 세포의 세포막이 붉은색으로 염색된 혈관의 개수를 측정하였으며 평균미세혈관밀도[average MVD(microvascular density)] 는 100배 시야에서 무작위로 3개의 시야를 골라 혈관의 개수를 측정한 후 그 평균값으로 하였다. 신생미세혈관밀도(neo MVD)는 CD34를 이용한 면역조직화학법으로 염색된 혈관내피세포 중 Ki67에 의해 핵이 동시에 갈색으로 염색되는 현재 증식중인 신생미세혈관의 밀도로 정의하였으며 신생미세혈관의 수가 가장 많은 부분을 골라 광학 현미경 400배의 한 시야에서 측정한 신생미세혈관의 수로 정의하였다(Fig. 1).

증식지표의 측정
   전체 종양세포 중 항 Ki67항체를 이용한 면역조직화학적 염색에서 세포핵이 갈색으로 염색되는 종양세포수의 백분율을 구하여 Ki67 index로 하였으며 Ki67 index가 0.1 미만인 경우를 Ki67 음성(0)으로 하였으며, Ki67 index가 0.1-0.3인 경우를 +1, 0.3-0.6인 경우를 +2, 0.6 이상을 +3로 정의하였다(Fig. 2).

의무기록의 후향적 고찰
   대상 70예의 의무기록을 후향적으로 분석하였으며 성별, 연령, 종양의 조직학적 분류, 병기(TNM Stage, AJCC 6th edition), 경부 림프절 전이, 예후지표인 AMES score, AGES score, MACIS score 등을 조사하여 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도 및 Ki67 index와의 상관관계를 알아보았다.

통계 처리
   성별, 연령, 종양의 병기, 경부 림프절 전이, 및 예후지표인 AMES score, AGES score, MACIS score와 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도, 및 Ki67 index와의 상관관계는 Pearson correlation으로 SPSS version 10.0을 이용하여 각각 분석하였으며, 통계학적 유의수준은 p<0.05으로 정하였다.

결     과

양성종양과 악성종양에서의 차이
   양성종양과 악성종양에서 신생미세혈관밀도와 Ki67 index는 각각 2.26, 0.42 및 3.94, 1.53로 악성종양에서 통계적으로 유의하게 높았다(p=0.001, p=0.001). 평균미세혈관밀도는 양성종양과 악성종양에서 각각 45.67, 60.34로 통계학적 유의성은 없으나 악성종양에서 높은 경향이 있었다(p=0.053)(Table 1).

연령에 따른 차이
   여자는 51세, 남자는 41세를 기준으로 하여 기준연령미만과 이상의 경우로 나누어 비교하였다. 악성종양 32예 중 기준연령 미만인 경우가 18예이었으며, 기준연령 이상인 경우가 14예였다.
   악성종양 중 평균미세혈관밀도는 연령과 통계적으로 연관관계가 있어 기준연령 이상인 경우 증가하였으나(p=0.047), 신생미세혈관밀도와 Ki67 index는 통계적으로 연관관계가 없었다(p=0.134, p=0.275). 양성종양 38예 중 기준연령 미만인 경우가 23예, 기준연령이상인 경우가 15예였으며, 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도와 Ki67 index는 모두 연령과 통계적으로 연관관계가 없었다(p=0.129, p=0.506, p=0.178).

성별에 따른 차이
   악성종양 32예 중 남자가 4예, 여자가 28예로 여자가 많았으며 성별과 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도, Ki67 index는 통계적으로 연관관계가 없었다(p=0.179, p=0.311, p=0.356). 양성종양 38예 중 남자가 6예, 여자가 32예로 여자가 많았으며 성별과 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도, Ki67 index는 통계적으로 연관관계가 없었다(p=0.436, p=0.784, p=0.156).

병기에 따른 차이
   악성종양 32예를 대상으로 2002년 AJCC에 의해 TNM Stage를 결정하였으며, 전체적인 병기(Stage I-IV)와 각각의 T, N 병기에 대하여 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도, 및 Ki67 index를 비교하였다.

전체적인 병기에 따른 차이
   평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도, 및 Ki67 index는 각각 병기가 증가할수록 통계적으로 유의하게 증가하였다(p=0.019, p=0.017, p=0.014)(Table 2).

T stage에 따른 차이
   T병기와 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도, 및 Ki67 index는 통계적으로 유의한 연관관계가 없었다(p=0.979, p=0.311, p=0.356)(Table 3).

경부 림프절 전이여부에 따른 차이
   경부 림프절 전이의 유무에 따라 평균미세혈관밀도를 비교하였을 때, 경부 림프절전이가 있는 경우 통계적으로 유의하게 높았다(p=0.032). 그러나 경부 림프절전이 여부와 신생미세혈관밀도 및 Ki67 index와는 통계적으로 유의한 연관관계는 없었다(p=0.091, p=0.236)(Table 4).

갑상선 종양 예후지표에 따른 차이
   악성종양 32예에서 갑상선 종양의 예후 지표인 AMES score, AGES score, MACIS score와 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도, Ki67 index를 각각 비교하였다.

AMES score에 따른 차이
   AMES score(age, distant metastasis, extent of disease, size of lesion)에 따라 저위험군과 고위험군으로 나누어 비교할 때, 저위험군은 24예, 고위험군은 8예였다. 저위험군과 고위험군에서 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도, Ki67 index는 각각 53.76, 3.56, 1.26 및 85.24, 5.42, 2.57로 3가지 모두 고위험군에서 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p=0.013, p=0.012, p=0.001)(Table 5).

AGES score에 따른 차이
   유두상암종 29예에서 AGES score(age, histologic tumor grade, extent of disease, tumor size)에 따라 저위험군과 고위험군으로 나누어 비교할 때, 저위험군은 22예, 고위험군은 7예였다. 저위험군과 고위험군에서 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도, Ki67 index는 각각 51.91, 3.35, 1.25 및 83.17, 5.27, 2.34로 3가지 모두 고위험군에서 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p=0.021, p=0.014, p=0.011)(Table 6).

MACIS에 따른 차이
   갑상선 유두상암종 29예에서 MACIS score(metastasis, age, completeness of resection, invasion, size)에 따라 저위험군과 고위험군으로 나누어 비교할 때, 저위험군은 22예, 고위험군은 7예였다. 저위험군과 고위험군에서 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도, Ki67 index는 각각 54.67, 3.65, 1.35 및 82.29, 5.00, 2.29로 3가지 모두 고위험군에서 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p=0.031, p=0.026, p=0.023)(Table 7).

고     찰

   악성 종양에서 새로운 혈관의 생성은 암세포가 확장하고 성장하는데 필수적인 과정으로 암세포의 주위 침습 및 전이에 관여하는 것으로 알려져 있다. 대부분의 고형암은 신생혈관생성이 없으면 1내지 2 mm 이상으로 자라지 못하며 그 이상으로 자라기 위해서는 반드시 신생혈관생성이 뒷받침 되어야한다.¹⁾²⁾³⁾
   신생혈관생성은 여러 단계를 거쳐 이루어지는 복잡한 과정으로 암세포, 혈관내피세포, 대식구, 섬유아세포 및 세포외기질 등에서 분비되는 신생혈관생성을 촉진하는 인자와 억제하는 인자에 의해 서로 균형을 유지하고 있으며 암종에서의 궁극적인 신생혈관생성의 양상은 두 인자간의 실질적인 차이에 의해 결정된다.²⁾ 정상 성인의 혈관내피세포는 대부분 휴지기에 있게 되며 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 생성되기 위해서는 신생혈관생성의 시작 스위치가 커져야 되는데 형질전환 생쥐에서의 실험에 의하면 신생혈관생성의 시작 스위치는 암생성의 초기 단계에 커진다고 알려져 있다.³⁾
   신생혈관생성은 역동적인 과정으로 이의 정확하고 실질적인 측정은 사실 매우 어려우며 대부분 미세혈관밀도를 측정하여 암종에서의 신생혈관생성의 정도를 평가한다. 미세혈관밀도는 인체 여러 암종에서 암종의 성장, 전이, 재발 및 예후와 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 침윤성 유방암에서 미세혈관밀도는 원격 전이와 상관관계가 있으며,⁵⁾ 초기 유방암에서는 환자의 생존율을 예측할 수 있는 가장 중요하고도 독립적인 변수로 보고 되었다.⁹⁾ 폐의 비소세포성 암종에서도 미세 혈관 밀도가 원격 전이와 연관이 많으며⁶⁾ 두경부편평세포암종에서도 미세혈관 밀도가 암종의 전이, 재발 및 생존율과 연관이 있다 보고되었다.¹⁰⁾¹¹⁾
   갑상선은 우리 몸에서 혈액공급이 매우 풍부한 기관 중의 하나로 이는 적은 양의 호르몬 분비를 조절하여 정상 생체기능을 할 수 있도록 하기 위함이다. 신생혈관생성이 갑상선종의 발생과도 많은 연관이 있는 것으로 알려져 있는데 혈관내피세포의 증식이 갑상선 여포세포의 증식 이전에 일어나는 것으로 미루어 알 수 있다.¹²⁾ 갑상선종양은 정상 갑상선 조직보다 혈관밀도가 높다고 알려져 있는데 Akslen 등은 128예의 갑상선 유두상암종에서 미세혈관밀도를 측정한 결과 정상 조직과 비교할 때 암종에서 미세혈관밀도가 3배 높다고 보고하였다.¹³⁾
   그리고 다른 조직에서와 마찬가지로 갑상선암종은 양성종양보다 미세혈관밀도가 높다고 알려져 있으며 Segal 등¹⁴⁾에 의하면 갑상선 여포선종 보다 여포성암종에서 미세혈관밀도가 높으며 특히 피막침습이 있는 부위에서 미세혈관밀도가 높다 하였다. 이로 미루어 신생혈관생성이 여포성암종의 침범 및 전이에 중요한 역할을 하리라는 것을 추정할 수 있으며 특히 여포성암종은 혈관을 통하여 전이가 일어나기 때문에 이런 소견이 의미있는 것으로 사료된다.
   갑상선 수질성암종에서 미세혈관밀도가 높은 경우 생존율이 감소한다는 보고가 있으며¹⁵⁾ 유두상암종에서는 미세혈관밀도가 높은 경우 암종의 재발률이 증가하며 재발되는 시기가 빠르다고 한 보고가 있다.¹⁶⁾ 미세혈관밀도는 갑상선암종의 분화도나 재발과 연관이 없다는 보고도 있으며 반대로 미세혈관밀도가 높은 경우 생존율이 증가한다는 보고도 있어 연구자간에 차이가 있다.¹³⁾¹⁷⁾ 이런 차이는 연구자들 사이에 혈관을 나타내기 위해 이용하는 항체가 다르고 또 혈관밀도를 측정하는 부위도 다르기 때문이라 생각된다.
   본 연구의 결과 양성종양보다 분화성 갑상선 악성종양에서 신생미세혈관밀도가 의미있게 높았으며 평균미세혈관밀도도 통계적으로 유의하지는 않았지만 악성종양에서 높은 경향이 있었다(p=0.053). 이상의 결과로 미루어 분화성 갑상선 암종에서 신생혈관생성이 암종의 발생에 중요한 역할을 하리라 추정된다.
   갑상선은 원래 혈관 분포가 많은 기관이기 때문에 단순히 미세혈관밀도를 측정하기 보다는 새로이 증식하여 생성되는 신생미세혈관을 측정하는 것이 더 의미있다고 사료되며 저자들은 본 연구에서 항 CD34 항체와 항 Ki67항체를 이용하여 이중면역조직화학염색법으로 신생미세혈관밀도를 측정하였으며 연구결과는 악성종양의 병기가 증가할수록 신생미세혈관밀도 및 평균미세혈관밀도가 모두 통계적으로 유의하게 증가하였다. 그러나 T병기와 미세혈관밀도와는 연관 관계가 없었으며 N병기에서는 신생미세혈관밀도는 연관이 없고 평균미세혈관밀도는 통계적으로 유의하게 의미가 있어 림프절전이가 있는 경우 평균미세혈관밀도가 증가하였다.
   그리고 본 연구 결과에서 가장 주목할 만한 것은 지금까지 갑상선 종양의 예후지표로 널리 쓰이고 있는 AMES score, AGES score, 및 MACIS score와 신생미세혈관밀도 및 평균미세혈관밀도 사이에 통계학적으로 유의한 연관관계가 모든 인자사이에 있었다는 것이며 이상의 결과로 미루어 신생혈관생성이 갑상선 분화성암종의 진행과 연관이 있으며 환자의 예후를 측정할 수 있는 좋은 예후 인자일 수 있음을 의미한다고 하겠다.
   Ki67은 분열중인 세포에서만 검출되는 증식세포핵단백으로 종양의 증식능을 측정할 수 있는 간편하고 신뢰성이 높은 방법으로 알려져 있으며,⁷⁾ 이미 악성 림프종, 유방암종, 폐암종, 뇌암종, 연골육종 등에서 의미 있는 예후 인자로 보고 되었다.¹⁸⁾ Lorz 등¹⁹⁾은 Ki67 index가 두경부편평세포암종의 조직분화도와 밀접한 연관이 있다고 보고하였으며, Welkoborsky 등⁸⁾은 40예의 후두암환자에서 수술 후 평균 37개월간 추적관찰하여 재발여부를 관찰한 결과 Ki67 index, 조직학적 분화도가 재발과 관련이 있는 것으로 보고하였다. Carr 등²⁰⁾은 갑상선 유두상암종에서 암종이 갑상선에 국한 된 경우보다 갑상선피막 밖으로 침범한 경우 Ki67 index가 높기 때문에 Ki67 index가 유두상암종의 악성도와 연관이 있다 보고하였다.
   본 연구에서 Ki67 index는 양성종양보다 분화성 악성종양에서 높았으며 병기와 AMES, AGES, MACIS score가 증가할수록 통계학적으로 유의하게 증가한 결과를 보였으며 Ki67 index가 갑상선 분화성 암종의 예후지표로 사용 될 수 있을 것으로 사료된다.

결     론

   갑상선종양에서 이중면역조직화학적 방법으로 미세혈관밀도와 Ki67 index를 측정한 결과 평균미세혈관밀도, 신생미세혈관밀도 및 종양세포의 증식지표(Ki67 index)는 분화성 갑상선암종에서 예후를 예측할 수 있는 중요한 예후 인자로 사료된다.

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