교신저자：김용대, 705-717 대구광역시 남구 대명5동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   인체의 호흡기상피세포는 흡입된 자극물질이나 해로운 화학물질에 대해 급성방어기전으로 점액을 분비한다. 그러나 천식, 만성기관지염, 알레르기 비염, 부비동염 등과 같은 만성호흡기염증질환에서는 과도한 점액분비가 중요한 특징 중 하나로 점액분비를 감소시키는 것이 병의 진행을 막는데 중요하다.¹⁾²⁾ 염증반응은 여러가지 사이토카인이나 염증성 매개물질이 관여하는 아주 복잡한 과정으로 비만세포는 arachidonic acid의 lipoxigenase와 cycloxygenase에 의해 histamine, leukotriene, prostaglandin, thromboxan 등을 분비한다.³⁾ 특히 leukotriene은 5-lipoxygenase에 의해 arachinoic acid가 leukotriene C4로 전환되고, 이것이 leukotriene D4, E4로 전환된다.⁴⁾ 이들의 약리학적 작용은 기관지근수축, 혈관투과성증가, 점액분비의 증가를 유발하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ 따라서 이러한 leukotriene의 작용을 조절할 수 있다면 호흡기 염증반응의 기전에 대한 이해와 치료에 도움이 될 것이다.
   최근에 개발된 leukotriene D₄ 수용체에 대한 선택적 길항제인 pranlukast hydrate(Onon^®)가 ovalbumin에 의해 감작된 guinea-pigs의 기도 점액분비를 in vitro에서 억제시키는 것을 보고한 예가 있으나,²⁾ 인체 호흡기 상피세포에서 leukotriene이나 이의 길항제가 점액유전자발현에 미치는 영향을 직접 연구 보고한 예는 없는 실정이다. 이에 본 연구는 호흡기 상피세포인 NCI-H292 세포에서 leukotriene D₄ 수용체에 대한 선택적 길항제인 pranlukast hydrate(ONO-1078)가 점액유전자발현과 점액분비에 어떠한 효과가 있는지를 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

세포배양 및 대상
   사람 호흡기 상피세포인 human pulmonary mucoepidermoid carcinoma cell line(NCI-H292, American Type Culture Collection, Rockville, MD)을 6개의 실험판(well-plate)에 1×10⁶ cells/well의 농도로 배양하고, 95%의 산소와 5%의 이산화탄소가 가습화된 대기에서 37℃의 온도로 RPMI 1640배지(10% fetal calf serum, penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 μg/ml를 추가)에 배양하였다. 배양이 어느정도 이루어지면, 세포를 24시간 동안 0.5% fetal calf serum을 포함하는 RPMI 1640배지에서 배양하였고, phosphate buffered saline(PBS)에 헹구어낸 후 leukotriene D₄ 10 μM, 20 μM과 30 μM을 투여하여 점액유전자와 점액의 생성여부를 관찰하였다. 한편 leukotriene 수용체의 효과를 관찰하기 위해 배양세포에 ONO-1078을 5 μM와 100 μM 용량으로 1시간 동안 전처치한 후 leukotriene 20 μM를 투여하였다.
   정한 시간마다 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH)를 이용하여 전체 세포의 RNA를 추출하였다. 대조군은 leukotriene D₄ 처치를 하지 않았고, leukotriene D₄는 0.1% Bovine serum albumin이 함유된 PBS에, ONO-1078은 에탄올에 용해하였다. 에탄올과 다른 용매의 최종농도는 0.1% 이하로 유지하였다. MUC2/5AC 점액유전자의 분석을 위하여 RT-PCR법을 이용하였고, 점액분비의 분석은 ELISA법을 이용하였다.

MUC2, MUC5AC 유전자의 RT-PCR 분석
   MUC2, MUC5AC mRNA의 측정은 변형된 RT-PCR 방법을 이용하였다.¹⁹⁾ 총 mRNA를 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinati, OH)를 이용하여 추출하였다. 총 mRNA를 무작위 hexanucleotide primer들과 Moloney murine leukemia virus(MMLV) reverse transcriptase(Perkin Elmer, Morrisville, NC)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. RT-PCR에 사용한 oligonucleotide primer는 인체 MUC2/5AC 유전자의 sense와 antisense를 사용하였다. 인체 MUC2 유전자의 primer 염기서열은 sense는 5'-TGC CTG GCC CTG TCT TTG이며, antisense는 3'-CAG CTC CAG CAT GAG TGC이다. MUC5AC 유전자의 염기서열은 sense는 5'-ATC ACC GAA GGC TGC TTC TGT C, antisense는 3'-GTT GAT GCT GCA CAC TGT CCA A이다. PCR 과정은 초기 가열을 95℃에서 3분간 실시한 후 변성은 95℃/1분, 60℃/1분, 72℃/1분간을 34 cycles을 실시하고 신전(extension)은 72℃에서 20분간 실시하였다. PCR의 산물은 50 ng/ml의 ethidium bromide가 들어있는 1% Tris-boric acid-EDTA 완충용매에서 2% agarose gel을 통한 전기영동을 이용하였다. 띠(band)의 정도는 densitometry를 이용하여 분석하였다.

Immunoassay를 이용한 MUC2/5AC 점액의 분석
   배양 NCI-H292 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·HCL, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백을 추출하여 정량하였다. 추출한 단백을 100 μg을 96 well에 첨가하여 40℃에서 배양시켰다. 2% bovine serum albumin으로 1시간 동안 실온에서 배양한 후, PBS용액으로 세 번 씻어 냈다. 1：100으로 희석한 MUC5AC(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)또는 MUC5AC 일차항체(NeoMarkers, Inc., Fremont, CA)를 첨가하여 1시간 동안 배양시킨 후, 이차항체인 horeseradish peroxidase-goat anti-mouse IgG conjugate(1：10,000)를 첨가시켜 1시간 동안 배양시켰다. PBS로 세번 씻은 후 3, 3, 5, 5-tetramethylbenzidine peroxidase 용액으로 발색반응을 시켜서 ELISA 판독기로 450 nm에서 측정하였다.
   실험 세포군에서 측정된 MUC2/5AC 점액의 양은 IL-1β를 처리하지 않은 대조세포군에서 검출된 양을 초과하는 만큼의 양을 백분율(% above control)로 나타내었으며 student t-test를 시행하여 대조군과 비교하였다(p<0.05).

결     과

Leukotriene D₄에 의한 MUC2/5AC 점액유전자의 발현과 점액 분비
   배양된 NCI-H292 세포에 leukotriene D₄ 10, 20, 30 μM를 처치한 경우 MUC2/5AC 점액유전자의 발현이 leukotriene D₄의 농도가 높아질수록 증가하였고 점액분비도 같은 양상이었다(Fig. 1).

ONO-1078의 효과
   Leukotriene 수용체 길항제인 ONO-1078의 효과를 알아보고자 배양된 NCI-H292 세포에 ONO-1078(5 μM, 100 μM)을 1시간 동안 전처치하고 leukotriene 20 μM을 각각 8시간, 12시간 동안 투여한 후 MUC2/5AC 점액유전자의 발현과 점액분비를 관찰하였다. 5 μM의 ONO-1078을 투여한 경우 MUC2 점액유전자의 발현과 점액의 분비가 약간 감소한 것 같으나 통계학적인 의미는 없었으며, MUC5AC의 점액유전자의 발현과 점액의 분비는 큰 변화가 없었다(Fig. 2). 한편 100 μM의 ONO-1078을 전처치한 후 leukotriene D4(20 μM)를 전처치한 경우 MUC2, MUC5AC 점액유전자의 발현이 모두 대조군 정도로 감소하였고 점액의 분비도 통계학적으로 의의있게 감소하였다(Fig. 2).

고     찰

   인체에서 점액분비를 증가시키는 기전은 명확히 알려지지 않았으나, 최근에는 세포막의 인지질에서 유래한 arachidonic acid의 대사물질인 leukotriene이 중요한 역할을 한다고 알져져 있다.⁵⁾ Leukotriene은 lipoxigenase가 arachidonic acid에 작용하여 5-hydroperoxyeicosatetraenoic acid(HPETE)를 생성하고 이는 다시 leukotriene A₄를 생성하며, 이는 다시 leukotriene B₄, leukotriene C₄로 전환되고, leukotriene C₄는 다시 leukotriene D₄, leukotriene E₄로 전환된다.⁵⁾⁶⁾ Leukotriene C₄, leukotriene D₄, 및 leukotriene E₄는 slow-reacting substance of anaphylaxis(SRS-A)의 가장 중요한 부분으로서, 호흡기 염증질환 환자의 객담에서 측정되어 기관지 수축, 혈관 투과성 항진, 기도 분비 항진 등을 유발시키고, 아토피성 질환과 알레르기 반응도 일으킨다고 알려져 있다.⁵⁾
   그 중 leukotriene D₄는 급성기의 강력한 기관지 수축작용을 가지지만 지연효과는 나타내지 않는다고 알려져 있고, 용량에 비례하여 비점막의 혈류량과 저항을 증가시키나, 소양감, 재채기 등에는 작용하지 않는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ 그리고 leukotriene D₄를 ovalbumin에 의해 감작된 guinea-pig의 기관지 상피세포의 점막층과 장막층에 동시에 투여하는 경우보다 점막층에만 투여하였을 경우에 점액분비가 증가한다고 한다.²⁾ 그러나 leukotriene D₄가 호흡기에서 발현되는 점액유전자 MUC2와 MUC5AC의 관계를 밝힌 연구는 없는 실정이다. 본 연구에서는 leukotriene D₄가 배양된 세포에서 MUC2와 MUC5AC의 발현을 용량 의존적으로 증가시키는 것을 관찰하였다.
   Leukotriene D₄는 비장, 말초혈관, 호흡기 상피세포에 있는 leukotriene-1(CysLT(1)) receptor 혹은 leukotriene-2(CysLT(2)) receptor에 작용하여 세포내의 칼슘을 증가시켜 세포의 탈과립을 일으킴으로써 염증작용에 의한 점액분비 증가와 기관지 수축을 일으킨다.⁷⁾⁸⁾ 따라서 leukotriene receptor의 두 가지 종류인 CysLT-1 receptor와 CysLT-2 receptor에 작용하는 antagonist를 사용하여 천식이나 알레르기 반응에서 생기는 점액분비를 줄일 수 있는 것에 대해 최근 연구가 진행되고 있다. 지금까지 보고된 leukotriene receptor antagonist중에 MK-571, montelukast, zafirlukast, pranlukast 등은 CysLT-2 receptor보다 CysLT-1 receptor에 더 친화적으로 작용하는 antagonist이다.⁹⁾ 또한 이러한 물질은 β-agonist와 같은 작용을 가지고 있어 기관지 확장 효과를 지니고 있다고 알려져 있고, 운동, 찬공기, 아스피린에 의해 유발된 코막힘과 점액분비의 초기반응에 관여하여 증상을 호전시키고, 항히스타민제에 의해 효과가 더욱 증진시킨다.⁷⁾ 그 중 pranlukast는 zafirlukast와는 다르게 leukotriene D₄와 leukotriene E₄ 뿐만아니라 leukotriene C₄와도 경쟁적으로 작용하여 점액분비를 감소시키는 우수한 약제이다.¹⁰⁾ Pranlukast는 γGTP를 불활성화 시켜 leukotriene 생성을 억제시키는 것이 아니라 leukotriene receptor에 leukotriene과 경쟁적으로 작용하여 항원에 의한 기관지 수축 억제, 아세틸콜린에 의한 기도의 과민반응 억제, 호흡기에 호산구의 침윤 억제의 효과를 가진다.¹⁰⁾ Pranlukast는 집먼지 진드기에 노출시 일어나는 항원 항체 반응에 의한 leukotriene 과다생성과 아스피린에 의한 arachidonic acid 대사과정에서의 leukotriene 과다생성에 의한 점액분비 증가에 효과가 있다는 보고가 있으나,¹¹⁾ 알코올에 의해 유발된 천식 환자에서는 효과가 없는것으로 알려져 있다.⁶⁾
   지금까지 알려진 점액유전자 중, 중요한 호흡기 점액유전자는 MUC2, 4, 5AC, 5B, 6, 7과 8 등이다.^12)13)14) 특히 MUC2, 5AC, 5B, 6 유전자는 모두 염색체 11p15.5에 존재하며 gel forming 점액유전자로 기도 상피의 보호와 윤활작용에 필수적인 점액을 생산한다.¹⁵⁾ MUC2는 인간의 장과 기도에 주로 존재하고 만성기관지염이나 섬유성 낭종에서 증가하는 것으로 밝혀져 있으며, MUC5AC와 MUC5B는 인간 기도에서 분비되는 점액의 대부분을 구성하고 있다.¹⁶⁾¹⁷⁾ 
   호흡기 상피세포의 점액에서 발현되는 MUC2와 MUC5AC는 염증 반응에 의한 점액분비 증가시 다량으로 발현된다.¹⁸⁾ Leukotriene D₄가 호흡기상피세포의 점액 분비를 증가시키고,²⁾ IL-β의해 증가된 MUC2와 MUC5AC가 steroid 제재에 의해 억제되지만,¹⁹⁾ leukotriene D₄가 점액분비와 MUC2와 MUC5AC의 발현을 증가시키고, leukotriene receptor antagonist가 이러한 유전자의 발현을 억제시킨다는 보고는 없다. 본 연구에서는 배양된 NCI-H292 세포에서 leukotriene D₄가 용량의존적으로 MUC2/5AC 점액유전자의 발현과 점액의 분비를 증가시키고 leukotriene 수용체 길항제인 ONO-1078(100 μM)이 leukotriene D₄에 유도된 MUC2/5AC 점액유전자의 발현과 점액의 분비를 감소하는 것을 관찰하였다. 이러한 결과로 보아 leukotriene 수용체가 MUC2/5AC 점액 발현과 점액 분비에 관여하는 하나의 기전으로 생각할 수 있을 것이다.

결     론

   Leukotriene receptor가 호흡상피세포에서 MUC2와 MUC5AC 점액유전자의 발현과 점액분비에 관여하는 하나의 과정으로 생각된다.

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