교신저자：이재훈, 570-711 전북 익산시 신용동 344-2  원광대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비강 및 부비동에 생기는 비용은 흔한 질환으로 종양이라기보다는 부종이 동반된 일종의 국소적 염증반응으로 표면이 매끄러운 유동성 종괴 형태로 나타난다. 비용의 정확한 병태생리는 알려져 있지 않으나 고유층(lamina propria)에서 일어나는 염증과 세포증식이라 할 수 있다.¹⁾ 또한 비용에서 종종 편평상피로의 화생(metaplasia)과 분비선의 과형성과 같은 형태학적 변화를 동반한 상피세포의 증식 소견도 보인다.¹⁾ 비용의 병인에는 많은 인자들이 관여할 것으로 생각되는데, 그중에서도 일산화질소와 염증 매개체에 대한 연구가 활발하다.²⁾ 최근에는 비용에서 정상 대조군에 비해 free radical에 의한 산화 스트레스(oxidative stress)의 증가가 확인되었으며, free radicals에 의한 산화 스트레스는 세포 막 지질과 단백질에 손상을 야기시켜 세포의 손상 및 괴사를 초래할 수 있다.³⁾⁴⁾ 
   인체에서 산화물에 대한 생리적인 조절은 catalase, superoxide dismutase(SOD), glutathione peroxidase(GSHPX), glutathione(GSH), thioredoxin 등의 thiol 완충제와 같은 내인성 항산화 효소에 의해 세포의 환원과 산화상태의 균형이 이루어진다.³⁾ 그러나 세포 완충 능력(cell-buffering capacity)과 효소 처리 능력을 초과하는 산화물의 증가는 세포독성의 산화 스트레스를 야기할 수 있다.³⁾ 유기체는 이러한 해로운 산화물을 해독하기 위해 비효소적 및 효소적 항산화 방어 시스템을 발전시켰다. 이러한 방어 기전중 하나가 Heat shock protein으로도 알려져 있는 스트레스 반응 단백질(stress response protein)인 HO-1의 유도이다.⁵⁾ 비용의 병리기전 측면에서 비점막 상피세포의 이온 수송 기전의 변화로 인한 점막 부종에서 산화물이 세포막 이온 펌프를 손상시켜 세포내의 Na⁺의 증가, K⁺의 감소 그리고 외부 환경에서 세포질로 Ca²⁺의 이동을 야기한다.³⁾ 
   HO는 혈색소, 사이토크롬(cytochrome) P-450 효소로부터 생긴 헴(pro-oxidant)을 분해하여 빌리베르딘(biliverdin), 자유철(free iron), 일산화탄소 등을 생성하는데 관여하는 효소이다. 이렇게 생긴 빌리베르딘은 빌리베르딘 환원 효소에 의해 빌리루빈(antioxidant)으로 되어 조직손상에 대한 방어 역할을 하게 된다. HO에는 HO-1, HO-2, HO-3과 같은 세가지 동종효소(isoenzyme)가 있는데, HO-1은 헤민(hemin), 사이토카인, 산화제, GSH결핍 등에 의해서 유발되며, HO-2는 구조적, 체질적(constitutive)으로 항상 일정하게 존재하며,⁶⁾ HO-3은 최근에 발견되었으며 낮은 효소 활성도를 갖는다.⁵⁾ 
   저자들은 비용에서 HO-1이 어떻게 발현되는지를 알아보기 위해 정상 하비갑개 조직과 비용조직에서 HO-1의 발현 양상을 면역조직학적 염색법으로 비교 연구하였다. 비용의 약물치료로 흔히 사용되는 스테로이드가 HO-1 발현에 억제 효과가 있는 것으로 알려져 있어,⁷⁾⁸⁾ 스테로이드가 비용군에서 HO-1발현에 어떤 영향을 미치는지를 알기 위해 수술 전 스테로이드 사용 군과 사용하지 않은 군에서 HO발현을 비교하였다.

대상 및 방법

대  상
   2003년 1월부터 2003년 12월까지 1년 간 본원 이비인후과학교실에서 임상 및 조직검사로 진단된 비용 환자의 28명으로부터 수술시 채취한 28개의 비용을 대상으로 하였다. 비용군은 알레르기 비염이 동반되지 않고, 수술 전 4주 이상 항생제, 항히스타민제, 국소 혹은 경구용 스테로이드제제 등의 약물 치료를 시행하지 않은 15예를 스테로이드 비사용군으로 하였고, 다른 약물은 사용하지 않고 국소 및 경구용 스테로이드제제만을 사용한 13예를 스테로이드 사용군으로 하였다. 경구용 스테로이드는 수술 전 1주일 전부터 prednisolone(Nisolone^®) 30 mg을 시작으로 5일 사용한 후 20 mg 1일, 10 mg 1일로 용량을 감소시키면서 복용하였고, 국소 스테로이드인 mometasone furoate(Nasonex^®)를 하루에 1회 두 번씩 수술 전 2주 동안 비강에 분무하도록 하였다. 실험군의 연령분포는 18~65세로 평균 연령은 42.3세였고 남자 18명, 여자 10명이었다. 대조군으로 알레르기비염, 천식, 그리고 비질환의 과거력이 없는 11명의 비중격만곡증 환자에서 비중격성형술 시 대상성 비후성비염이 없는 하비갑개의 점막을 사용하였다. 대조군의 연령분포는 22~55세로 평균 연령은 40.5세였고 남자 7명, 여자 4명이었다.

면역조직화학적 염색 및 판독

HO-1의 면역 조직화학적 염색
   조직편을 상용화된 ProbeOn-plus slide(Fisher Scientifics, Pittsburg, PA, USA)에 부착하여 고정한 후 xylene으로 파라핀을 제거하고 증류수에 함수시겼다. Citrate buffer(pH 6.0)에 조직이 부착된 슬라이드를 넣고 13분간 microwave로 처리한 후 Immuno/DNA 완충액(Invitrogen, Carlsbad, CA. USA)으로 세척했다. 조직의 내부에 있는 과산화효소를 제거하기 위해 Autoblocker(Invitrogen, Carlsbad, CA. USA)로 실온에서 30분간 처리하고 완충액으로 수세하였다. 그 다음에 heme oxygenase-1(dilution 1：200, BD bioscience, San Diego, CA, USA) 1차 항체로 -4℃에서 하룻밤 반응시켰다. 그 후 2차 항체에 HRP-polymer가 접합된 PicTure-plus kits(Zymed, San Francisco, CA, USA)로 실온에서 40분 처리하였다. 그리고 완충액으로 수세한 다음 AEC(Zymed, San Francisco, CA, USA)로 발색시켰다. Hematoxylin으로 대조염색을 하고 Universal mount(Research Genetics, Huntsville, AL, USA)로 봉입한 후 관찰하였다. 간에서 HO-1에 양성으로 보이는 Kupffer 세포를 기준으로 비용에서 HO-1 양성 세포가 대식세포인지를 확인하기 위해 동일 비용 조직에서 대식세포에 특이 표식자인 CD68(1：50, NeoMarkers, Fremont, CA, USA) 1차 항체를 사용하였고, 염색은 CD68 1차 항체를 45℃에서 30분간 반응시킨 것을 제외하고는 앞의 방법과 동일하게 시행하였다. 면역염색에 대한 HO-1의 양성 대조군은 간조직을 사용하였고, 음성 대조군은 간조직을 이용한 염색과정 중 1차 항체를 처리하지 않은 것으로 하였다. 판독기준은 광학 현미경 100배로 확대된 슬라이드 상에서 붉은색으로 염색된 부위 중 무작위로 3개의 시야를 골라 비상피성 세포 100개를 세어 그 중 염색된 세포가 평균 2개 이상인 경우를 양성으로 판독하였으며, 비용환자에 대한 임상적인 정보가 주어지지 않은 상태로 두 명의 병리 의사가 동시에 양성으로 판정한 것을 기준으로 하였다. 

결     과

   28개의 비용에서 HO-1은 20개(71.4%)에서 발현되었으며, 대부분의 발현된 세포는 낭성 변화된 부위의 고유층의 비상피성 세포였다(Fig. 1). 일부 예에서 극히 소수의 상피세포에서 국소적으로 매우 미약하게 염색되기도 하였다. 대조군에서는 염증 세포, 상피세포 등 모두에서 전혀 발현되지 않았다(Fig. 2). 동일 조직을 이용한 HO-1 발현 세포와 CD68 양성 세포가 서로 거의 일치하였다(Fig. 3).
   Steroid 사용한 비용 13개 중 11개에서 양성(84.6%)을 보였고 2개에서 음성(15.4%)을 보였다. steroid 사용하지 않은 비용 15개 중 9개에서 양성(60%)을 보였고 6개에서 음성(40%)을 보였으며 두군 사이에 유의한 차이는 보이지 않았다.

고     찰

   HO은 헴 분해에 관여하는 효소로 강력한 세포방어 항산화 시스템이다. 빌리루빈은 유기체에서 가장 강력한 항산화 시스템으로 산화 스트레스 모델에서 세포방어의 역할이 있는 것으로 알려져 있다.⁹⁾ HO의 동종효소 중 HO-2는 36 kD 단백질로 인체 조직에서 전반적으로 발현되며 뇌와 고환에서 높게 발현된다.¹⁰⁾ 자극에 의해 발현되는 HO-1은 32 kD 단백질로, HO-2와는 달리 다양한 환경적, 생리적, 병리적 자극에 의해 발현된다.¹⁰⁾
   만성 질환에서 superoxide anion, free radical, hydrogen peroxide와 같은 reactive oxygen species(ROS)은 활성화된 면역세포 및 염증세포에서 생산된다.¹¹⁾ 이러한 매개체는 핵산, 단백질, 막 지질을 산화하여 질환을 악화시킨다.¹¹⁾ 산화물을 포함한 ROS는 정상 상태의 몸에서 일정하게 존재한다. 산화물은 두가지 형태 즉, 내인성 인자 및 외인성 인자에 의해 발생하는데 내인성 인자는 1) 미토콘드리아와 마이크로솜의 전자 수송으로부터 전자 방출에 의하여, 2) 대식세포로부터, 3) NADPH oxidase, xanthine oxidase, monoamine oxidase, peroxisomal cytochrome P-450 oxidase와 같은 내인성 효소 시스템에 의해 발생된다.¹²⁾ 외인성 인자로는 방사선, 공기오염, 담배연기, 일광, 오존, nitrogen mustard, bleomycin, acetaminophen, xenobiotics와 chemical warfare agents 등이 있다.¹²⁾ 
   산화 스트레스 후 HO-1의 기능적 중요성은 많이 보고 되어 있지 않으나, HO-1이 산화물 손상에 대한 세포 방어 역할을 하리라는 연구들이 있다.^13)14)15) A549 상피 cell line에서 HO-1을 transfection한 군에서 산화물 손상에 대해 세포 방어를 한 반면, HO-1 결핍 세포에서는 헤민과 카디미윰(cadimium) 노출 후 세포 손상이 더 심해졌다.¹³⁾ 또한 과산소증에 따른 신생 쥐 폐에서 HO-1의 기초 발현이 증가되었다.¹⁴⁾ Willis¹⁵⁾는 대식세포에 의한 HO 활성 및 HO-1 발현이 쥐에서 급성 염증의 carrageenin으로 유도된 흉막 모델의 치유와 연관된다고 보고하였다. HO-1의 억제는 염증 반응의 증가를 야기하였으며 이런 결과를 통해 그는 HO-1 발현이 급성 염증 모델에서 내인성 항염 효소라고 주장하였다.
   본 연구에서 HO-1의 발현 판독을 2%를 기준으로 하여 양성, 음성의 2가지로 분류하고, 양성 군에서 양성의 정도는 나누지 않았다. 그 이유는 2% 미만의 세포에서 국소적으로 발현되었을 때 이것을 양성으로 판독하기에는 세포수가 너무 적을 뿐만 아니라 위양성세포를 포함될 수 있어서 100개의 비상피성 세포에서 최소 2%이상에서 염색되어야 양성으로 판독할 수 있으리라 저자들은 생각하였다. HO-1이 발현된 비용 조직에서도 발현되는 비상피성 세포의 비율이 전반적으로 높지 않아 양성의 정도를 나누지는 않았다. 본 연구 결과 28개의 비용 중 20개(71.4%)에서 주로 비상피성 세포에서 HO-1이 발현되었고, 대조군에서는 전혀 발현되지 않았다. 본 연구에서는 일반적으로 비용조직에서의 염증반응이 가장 심하게 일어나는 부분으로 알려진 고유층의 비상피성 세포에서만 주로 HO-1 발현을 보였다. 저자들은 HO-1 발현 세포의 종류를 확인하기 위해 HO-1과 대식세포의 특이 표식자인 CD68의 이중 면역염색을 하였으나 세포질에 같이 염색되어 구분이 어려워 동일조직 그 다음 절단편에 CD68을 염색하였다. 대식세포에 대한 직접 연구가 아니라 명백한 해석은 어려우나, 저자들은 HO-1에 의해 염색된 세포와 CD68에 양성인 대식세포가 동일한 것으로 생각되었다. 이러한 추정은 다음과 같은 3가지 1) 염색된 부위가 서로 거의 일치하고, 2) 산화물의 내인성 인자가 대식세포를 통해 일부 발생되고,¹²⁾ 3) 다른 조직에서 HO-1이 대식세포에서 발현된다는 연구결과들에 근거할 수 있다.^6)16)17) 정상 간조직에서는 HO-1이 Kupffer세포에서만 발현되지만, 간경화와 같은 만성 간 손상의 조직에서는 대식세포와 근섬유세포에서 발현되었다.¹⁶⁾ 천식환자의 객담에서의 HO-1 발현은 대식세포에서 발현되고 정상대조군에 비해 객담에서 빌리루빈이 증가된 소견을 보였다.¹⁷⁾ 정상대조군에 비해 비용환자의 혈액과 조직에서의 malondialdehydethiobarbituric(MDA)과 같은 산화물의 증가된 소견과 레티놀, 베타카로틴, 알파토코페롤, 아스코빅산, SOD, GSH와 같은 항산화물들은 감소된 소견을 보였다.³⁾⁴⁾ 만성 염증 질환에서는 산화물이 증가되고 HO-1과 같은 항산화효소가 유도되는 것 같다. 본 연구를 통해 저자들은 비용에서 항산화 효소인 HO-1이 대식세포를 통해 염증 발생에 대한 방어 기전의 역할을 할 것으로 생각하였다. 
   HO에 대한 스테로이드의 영향은 glucocorticoid response element(GRE)가 HO-1 promoter에 있기 때문에 헴이나 IL-6에 의한 HO-1 promotor 부위의 활성을 억제하는 것으로 알려졌다.⁷⁾⁸⁾ 본 연구결과 스테로이드 사용한 비용군에서 HO-1 발현이 감소되리라는 기대와 달리 스테로이드 사용한 비용군과 steroid 사용하지 않은 비용군에서 유의한 차이를 보이지 않았다. 비용조직에서 HO-1에 대한 스테로이드의 영향은 거의 없을 것으로 추정할 수 있었다. 다른 연구들을 살펴보면 IL-6에 의해 야기된 HO-1 유전자 발현에 대한 스테로이드의 처리 후 HO-1 유전자 발현의 감소를 보이지 않았고,¹⁸⁾ 천식환자를 대상으로 한 HO 동형효소의 발현에 대한 연구에서 흡입 스테로이드의 사용 후 HO 동형효소들의 발현에 차이가 없었고 스테로이드가 HO 동형효소의 발현을 조절하지는 않는다고 주장하였다.⁶⁾ 그러나 본 연구는 동일인에서의 스테로이드 사용 전, 후의 연구가 아니고, 스테로이드의 사용량과 기간에 따른 HO-1 발현의 차이가 있을 수 있으므로 본 결과의 정확한 해석은 내리기 어려울 것으로 생각된다. 동일인의 스테로이드 사용에 따른 비용조직과 스테로이드의 사용량과 기간에 따른 H0-1 발현에 대한 연구를 통해서 스테로이드의 직접적인 효과가 앞으로 규명되어야할 것으로 생각된다. 

결     론

   본 연구에서 정상 하비갑개군과 비용군에서의 HO-1 발현을 면역조직학적 염색으로 비교한 결과, 정상 대조군에서는 전혀 발현이 되지 않은 반면, 비용군에서는 71.4%에서 발현되었다. 스테로이드를 사용한 비용군과 스테로이드를 사용하지 않은 비용군의 양성 발현을 비교분석한 결과, 스테로이드를 사용한 비용군에서 약간 높은 발현을 보였으나 두 군사이에 유의한 차이는 없었다. HO-1이 발현 세포는 주로 대식세포로 추정되었다. 이런 결과를 통해 대식세포내의 HO-1이 비용의 염증 반응에 방어 기전으로 역할을 할 것으로 생각된다. 스테로이드에 의한 대식세포의 HO-1발현 변화는 좀더 많은 연구가 있어야한다고 생각된다. 

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