교신저자：김형종, 431-070 경기도 안양시 동안구 평촌동 896  한림대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
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서     론

   만전산화 단층 촬영(CT) 또는 자기공명영상(MRI) 등 방사선 영상을 이용한 생체 측두골의 3차원적 재구성에 대해서는 여러 연구가 보고되어 왔으며,¹⁾²⁾ 사후 병리조직 절편을 이용한 사람 측두골의 3차원적 재구성에 대해서도 여러 연구가 진행되어 왔다.³⁾⁴⁾ 측두골을 3차원적으로 재구성한 영상의 장점은 관심 구조물의 크기, 면적 및 부피 등의 계측이 가능하고, 구조물 사이의 공간적인 관계를 측정할 수 있다는 것이다. 현재까지 3차원적 재구성에 대한 연구를 보면 정상 인체의 사후 측두골을 대상으로 한 연구는 많이 보고되어 있지만 중이 질환에 이환된 측두골을 대상으로 하고, 특히 인위적 조작이 가능한 실험 동물의 측두골을 대상으로한 3차원적 재구성에 대한 연구는 미미하다. 따라서 동물모델에서 3차원적 재구성의 기법을 사용할 수 있다면 실험적으로 유발시킨 질병의 경과를 보다 정확하게 평가할 수 있을 것이다. 
   본 연구에서는 병리조직의 평가에 앞선 기초연구로서, 이과 분야의 연구에 많이 사용되는 몽고 저빌을 대상으로 하여 컴퓨터 프로그램을 이용한 측두골의 3차원적 재구성 방법을 개발하였고, 이를 이용하여 측두골내 와우, 반규관 및 안면신경 등 주요 구조물을 3차원적으로 구현하고 각 구조물에 대한 계측을 시행하였다.

재료 및 방법

   실험동물로는 정상 Preyer 반사를 보이고 고막 소견이 정상인 몽고 저빌(Mongolian gerbil, Meriones Unguiculatus)을 이용하였으며 생후 연령은 5주, 체중은 50 gm이었다.
   케타민(Ketamine hydrochloride, 50 mg/ml, 유한양행)과 럼푼주사액(Xylazine hydrochloride, 23.32 mg/ml, 바이엘코리아)을 2：1의 비율로 혼합한 마취제를 체중 gm 당 1.6 μl 의 용량으로 복강내 주사하여 마취하였다. 깊은 마취 후 10% 포르말린용액으로 심장관류고정을 시행하였고, 두부 절단 후 측두골만 채취하여 같은 고정액에 2일 동안 침수 고정하였다. 고정이 끝난 후 Cal-Ex II(Fisher Scientific, CS511-1D)용액에서 4일간 탈회를 시행하였고, 탈회 후에는 약 5시간 이상의 수세를 실시하여 고정액과 탈회액이 충분히 씻겨질 수 있도록 하였다. 충분히 수세가 된 조직에 알코올 용액을 이용한 연속 탈수를 실시하였고 파라핀에 조직을 포매하여 파라핀 블록을 만들었다. 파라핀이 굳기 전에 각 모서리에서 일정한 간격이 떨어진 4곳의 점을 정하여 18G 바늘을 삽입함으로써 파라핀 블록에 기준점(reference hole)을 만들었다(Fig. 1).
   파라핀 블록이 완전히 굳은 후 기준점에 위치한 바늘을 제거하고 마이크로톰을 이용하여 10 μm두께로 연속되게 절단하였고 얻어진 모든 절편들을 3차원적 재구성에 이용하였다. 각 절편은 슬라이드에 놓인 상태로 육안으로 관찰하여 국소적으로 파라핀이 결손된 부위인 기준점을 확인하였고 결손된 부위에 Red name pen(Simport Co., cat.#：M495-11)으로 표시를 하여 염색과정에서 파라핀 성분이 제거되더라도 구멍의 위치를 파악할 수 있게 하였다. 각각의 슬라이드는 헤마톡실린-에오신 염색을 시행하였다.
   염색된 각 슬라이드는 디지털카메라(Coolpix 995, Nikon)를 이용하여 이미지 파일(해상도-1024 X 768)로 만들었다. 전체 850장의 조직절편을 얻었으며 이중 상반규관이 보이기 시작하는 부위에서 시작하여 아래로는 안면신경의 유돌분절이 끝나는 부위까지 총 450개의 파일을 선택하여 삼차원적 영상을 얻었다. 각 이미지 파일에서 관찰하고자 하는 와우, 반규관, 전정, 안면신경의 구조물을 Digitizer(Intuos-2, Wacom)를 이용하여 Fig. 2와 같이 투사(tracing)하였다. 
   전체 450개의 파일을 소프트웨어(Image Generator, Hanyang University)를 이용하여 Analyze 파일 포맷으로 변환하였다. 그리고 Analyzer(version 5.0, Mayo clinic)를 이용하여 관심영역의 등록 및 분절화를 시행하였다. 삼차원 영상을 재구성 할때 Nearest Neighbor method를 적용하여 보간(interpolation)을 하였고, 저역 공간 필터링(low pass spatial filtering)을 하였다. 몽고 저빌의 내이 구조물을 3차원적으로 재구성하였고, 각 구조물의 전후 길이, 높이, 그리고 각 구조사이의 공간 관계를 측정하였다(Fig. 3).

결     과

   총 450장의 조직절편을 이용한 삼차원적 재구성을 통하여 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다.

반규관의 측정
   상반규관, 후반규관, 외반규관을 Fig. 3과 같이 관찰할 수 있었다. 각 반규관의 폭은 골부(bony portion)를 포함하여 미로팽대부 말단과 비팽대부 말단의 최대 길이로 정의하고 높이는 폭을 나타내는 선으로부터의 수직길이로 정의하였을 때 반규관의 폭과 높이는 Table 1과 같다.
   또한 상반규관과 후반규관, 상반규관과 외반규관, 외반규관과 후반규관이 이루는 각은 각 반규관의 중심에서 가장 멀리 떨어진 세점을 연결하는 평면을 구하여 두 평면이 이루는 각을 구하였으며 이는 각각 110.5°, 98.3° 및 94.7°로 측정되었다. 

와우의 측정
   Fig. 4와 같이 와우의 기저회전에서부터 첨부까지 관찰을 할 수 있었다. 골부 와우의 각 회전에서의 직경의 길이는 첨부회전, 제 1 중간회전, 제 2 중간회전, 그리고 기저회전에서 각각 0.766 mm, 1.731 mm, 2.074 mm, 2.173 mm이었다. 첨부에서 기저회전부까지의 수직길이는 2.592 mm 이었고, 골부를 포함한 와우의 부피는 3.08 mm³이었다.

안면 신경의 측정
   안면신경의 미로분절(labyrinthine segment), 고실분절(tympanic segment), 유돌분절(mastoid segment)을 관찰할 수 있었다. 안면신경관내에 위치한 안면신경의 각 분절의 길이와 직경은 Table 2와 같으며, 미로분절과 고실분절, 고실분절과 유돌분절이 이루는 각도는 각각 121.4°, 154.5°이었다(Fig. 5).

고     찰

   만성 진주종성 중이염은 골파괴를 동반하여 심각한 합병증을 일으킬 수 있기 때문에 수술적 치료가 반드시 필요하지만 수술을 할 수 없는 환자에게서 질병의 경과를 정체, 억제시킬 목적으로 보존적으로 사용할 수 있는 약물의 개발이 시도되고 있다. 그러나 질병의 경과 및 약물로 인한 질병의 억제 정도를 평가하기 위해 현재 사용되는 방법은 고막을 관찰하거나 3차원적인 병변을 2차원적인 조직절편으로 관찰하는 방법 뿐으로 이는 공간적, 정량적 계측이 불가능하다. 따라서 측두골내 구조물들에 대한 삼차원적 재구성을 시행하고 정량적인 계측을 시행한다면 질병의 파급된 양상이나 정도, 그리고 약물에 의한 억제 정도를 객관적으로 평가할 수 있다.
   중이 및 내이 구조물을 평가하는데 있어 일반적으로 축상면 혹은 관상면의 CT나 MRI, 그리고 조직절편 등이 이용되고 있다.
   CT를 이용한 연구로는 Jang과 Lee⁵⁾가 3차원적 컴퓨터 영상을 사용하여 만성중이염의 골파괴 소견을 평가함으로써 술전 계획을 세우는데 도움을 줄 수 있다고 하였고, Park 등⁶⁾은 MicroCT를 이용하여 사람 이소골의 3차원적 구조에 대해 연구하였으며 궁극적으로 인공 이소골 개발에 활용하고자 하였다. Vrabec 등⁷⁾은 3D CT 이미지를 이용하여 사람 측두골의 함기화 정도에 대하여 연구하는 등 CT는 주로 골성 구조물의 평가에 이용되어 왔다. 
   주로 골성 구조물을 관찰하는 CT에 비하여 MRI는 내이구조물과 안면신경 등 연부조직의 관찰에 우수한 장점을 갖고 있다. Arnold 등⁸⁾은 3차원 고해상도 MRI를 이용하여 사람의 와우, 반규관, 전정, 7, 8번 뇌신경을 3차원적으로 구현한 바 있다. 특히 메니에르병이 의심되는 환자에서의 확진은 현재 사후 부검을 통한 내림프수종의 병리조직학적 확인을 통해서만이 가능한데, 최근 MRI를 이용하여 내림프수종을 진단하기 위한 기초 연구가 진행되고 있다.⁹⁾
   이렇듯 최근 CT, MRI를 이용하여 중이나 내이구조물을 관찰 및 계측하려는 시도가 있었지만 이는 사람을 대상으로 한 것으로서 실험동물에서의 측두골의 3차원적 재구성은 시행된 바 없다. 실험동물의 경우 사람과 달리 인위적으로 질병을 유발시킬 수 있으며 원하는 시기에 평가를 할 수 있다. 그러나 실험동물의 경우는 그 크기가 사람에 비해 매우 작기 때문에 현재 CT나 MRI로는 3차원적으로 재구성하기는 힘들다. 또한 CT와 MRI는 그 특성상 주요 관찰대상이 다르기 때문에 한 가지 검사로서 중이, 내이, 안면신경과 유발된 중이 병변 등 서로 다른 조직특성을 갖는 구조물들을 함께 측정하는 것은 어렵다. 이에 비하여 조직절편을 이용할 경우 이러한 제한을 받지 않으며, 특히 유발된 중이 병변에 대해서는 면역조직화학적 기법을 이용하여 추가로 평가할 수 있는 장점이 있다. 따라서 실험동물에서 중이 및 내이병변의 객관적인 평가를 위해서는 조직절편을 이용한 3차원적 구현이 이상적이라고 하겠다. 측두골의 3차원적 재구성에 대해서는 정상 사람을 대상으로 하여 여러 연구가 있었으며 주로 중이수술을 위한 해부학적 논의에 집중되었다. Nakashima 등¹⁰⁾은 연령별로 안면신경의 구간별 단면적 및 직경을 측정하였는데 미로분절의 근위부와 고실분절의 중간부가 가장 좁고 특히 미로분절의 근위부는 연령의 증가에 불구하고 거의 단면적이 증가하지 않는다고 하였다. 또한 Hasebe 등¹¹⁾은 경동맥벽과 고막의 근접성에 대해서 연구를 시행하여 두 구조물사이의 거리가 4.9 mm에 불과하다고 하였으며 또한 경동맥벽의 부분 골결손이 약 5%에서 관찰되었다고 발표한 바 있다. 
   본 연구에서는 몽고 저빌을 이용한 측두골의 3차원적 재구성을 시행하였다. 몽고 저빌은 작은 크기, 짧은 수명, 그리고 경제성으로 인해 이과학, 신경학, 종양학, 발생학, 소화기학, 병리학, 약리학 등 많은 분야에서 실험동물로 사용되고 있다. 그중에서도 이과분야에서는 사람과 달리 청력이 출생이후에 발달되기 때문에 청각구조의 발달에 대한 연구에 이용되며,¹²⁾ 또한 진주종의 호발부위인 고막 이완부의 크기가 전체 고막의 10~20%로서 사람의 약 2~3%에 비해 크고 이완부가 외이도의 입구에 근접해 존재함으로써 조작하기 쉽다는 점,¹³⁾ 그리고 진주종이 자발적으로 발생된다는 점으로 인해 많이 사용되고 있다.¹⁴⁾ 
본 연구를 시행함에 있어 조직절편들을 재구성할 때 연속적으로 나열하기 위한 목적으로 파라핀 블록의 주변부에 기준점을 만든 후, 새로 만들어진 조직 슬라이드에서 해당 부위에 염색에 지워지지 않는 특수펜(red name pen)을 이용하여 표시를 하였으며 염색과정 후 각 슬라이드의 정렬시 이를 이용하였다. 한 평면상에서 두개의 점으로서 정렬은 가능하였지만 염색을 포함한 실험과정에서 생길 수 있는 오차를 최대한 줄이기 위해 측두골 주위 네 곳에 기준점을 만들어 정확한 3차원 영상을 얻고자 하였다. 실제 염색과정 중 일부 슬라이드에서 탈색 및 번짐 현상이 발생되었으며 차후에 염색과정에서 탈색이 되지 않는 펜이 개발된다면 보다 좋은 이미지를 얻을 수 있을 것이다. 기준점을 위한 다른 방법으로는 파라핀 블록이 아닌 골 자체에 드릴을 하는 방법을 생각해 볼 수 있다. 염색과정에서 탈색되어 버리는 파라핀과는 달리 골 자체는 염색과정에 의해 탈색되지 않기 때문에 그 위치 정보가 변형되지 않아 이미지의 향상을 가져올 수 있으며, 주위 중요 구조물에 손상을 줄 가능성이 있지만 관찰하고자 하는 측두골의 반대편에 기준점을 만드는 경우 주 관찰부위의 손상은 피할 수 있으므로 차선책으로 고려할 수 있다. 그러나 질병 유발모델에서는 통상적으로 좌우측 귀를 각각 실험군과 대조군으로 사용하기 때문에 이 경우에는 사용하기 어려울 것이다.
   본 연구에서는 몽고 저빌의 측두골 절편을 이용하여 작은 크기의 내이구조에 대한 3차원적 영상을 성공적으로 재구성함으로써 서로 다른 조직 특성을 갖는 구조물들의 3차원적 구현을 가능하게 한데 큰 의미가 있다고 생각한다. 특히 최근 많이 사용되는 면역조직화학적 기법을 사용할 경우에는 그 결과를 3차원적으로 분석하고 정량적으로 평가할 수 있는 보다 객관적인 도구가 될 수 있을 것이다.
   본 연구의 결과는 몽고 저빌 1마리를 이용한 결과로서 그 결과를 일반화시키는 데 무리가 있겠으나 이전 예비실험으로써 3마리의 몽고 저빌 측두골 조직절편을 이용한 3차원적 재구성을 하였고 그 경험을 토대로 최적화된 연구 방법을 개발하였으므로 조직영상 또는 3차원적 재구성 방법에 의한 결과의 오차는 최소화하였다고 생각된다. 사람의 결과와 비교하여 보면 3개의 반규관이 서로에 대해 이루는 각도는 각각 110.5°, 98.3°, 94.7°로서 사람을 대상으로 측정했던 Takagi 등¹⁵⁾의 결과치와 비교하였을 때 각각 108.2°, 101.8°, 101.3°로서 대체로 유사함을 보였다. 안면신경의 두께에 있어서 본 연구에서는 미로분절이 다른 분절에 비해 가장 가늘게 측정되었는데 이것은 이전의 보고들과 비슷한 결과로서 Nakashima 등¹⁰⁾은 정상의 7명의 사람을 대상으로 조직절편의 삼차원적 재구성의 방법을 사용하여 측정하였을 때 미로분절의 근위부와 고실분절의 중간부위가 가장 가늘다고 하였고, Fisch¹⁶⁾는 벨안면마비(Bell's palsy)의 수술시에 현미경하에서 안면신경의 단면적을 측정한 결과 미로분절의 시작부분이 0.68 mm로서 안면신경 중에서 가장 가늘다고 한 바 있다. 안면신경의 각 분절별 길이는 미로분절, 고실분절, 수직분절이 각각 1.006 mm, 2.012 mm, 2.460 mm로서 사람에서의 길이가 각각 23~24 mm, 8~11 mm, 10~14 mm임을 고려하면 각 분절의 길이의 비는 대체로 사람과 비슷하다고 할 수 있겠다. 그러나 미로분절과 고실분절, 그리고 고실분절과 수직분절이 이루는 각은 121.4°, 154.5°으로I 측정되어 사람을 대상으로 한 결과들과 큰 차이를 보였는데, Fujita 등¹⁷⁾은 9명의 사람을 대상으로 조직절편의 삼차원적 재구성의 방법을 사용하여 측정한 결과 미로분절과 고실분절, 그리고 고실분절과 수직분절이 이루는 각은 각각 58.18°, 115.46°라고 하였다. 이러한 차이가 실제 의미 있는 것인지를 검증하기 위해 더 많은 개체를 대상으로 연구가 이루어져야 할 것으로 생각한다. 
   부피의 측정에 있어서는 와우의 부피가 3.08 mm³로 측정할 수 있었는데 차후 진주종 유발 모델에 적용할 경우 병변의 부피를 측정함으로써 질병이 진행 또는 억제된 정도를 정량적으로 평가하는데 응용할 수 있을 것으로 생각된다.

결     론

   본 연구에서는 몽고 저빌 측두골의 3차원적 재구성법을 이용하여 측두골의 내이 구조물과 안면신경의 3차원 영상을 얻고 각 구조물에 대한 계측을 시행할 수 있었으며, 향후 질병 유발 모델에 적용한다면 질병의 결과와 치료의 효능을 평가하는데 보다 효율적인 연구방법으로써 이용될 수 있을 것이다.

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