Address for correspondence : Yong Soo Park, MD, PhD, Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 665-8 Bupyeong 6-dong, Bupyeong-gu, Incheon 403-720, Korea
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서     론

   중이염은 소아에서 가장 흔한 세균 감염 질환이며 항생제 치료 및 외과적 치료를 필요로 하는 가장 흔한 질환이다.¹⁾ 삼출성 중이염의 병인에 대한 많은 연구가 있어 왔으며, 세균 감염에 의한 직접적인 염증반응, 세균 항원에 의한 국소 면역반응, 이관의 폐색, 알러지 등이 원인으로 생각되고 있으며, 이러한 1차적인 원인에 의해 염증성 매개체 및 효소 등이 방출되고, 그 결과 중이 점막의 혈관투과도의 증가, 주화성에 의한 염증 세포 동원, 점액 분비 증가, 점액섬모 기능 장애 등에 의해 중이강에 삼출액이 저류되어 삼출성 중이염이 발생하는 것으로 생각되고 있다.¹⁾
   삼출성 중이염의 면역학적 기전을 설명하는 물질인 싸이토카인은 염증의 주요 매개체이며 면역 반응을 조절하는 당단백질로, 중이강내 점막의 영구적 변화, 섬유화, 골미란 등의 중이강내 병리학적 변화를 설명하는 데 중요한 역할을 하고 있다고 알려져 있으며, 여러 가지 싸이토카인을 이용한 실험들이 행해져 왔다.²⁾ 
   현재까지 삼출성 중이염 환자의 중이 삼출액에서 Interleukin(IL)-1β, IL-2, Tumor necrosis factor(TNF)-α, Interferon(IFN)-γ, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, Transforming growth factor(TGF)-β 등의 다양한 cytokine들이 존재하는 것으로 확인되었고, 중이염의 매개체로서의 역할을 하는 것으로 보고되었다.³⁾
   IL-10은 활성화된 대식세포와 호중구에 작용하여 이들을 비활성화시키고, IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α의 생산을 저해하여 염증을 완화시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ 그러나 실제로 중이염이 유발된 중이 내에 외부 IL-10을 직접 주입하여 생리적인 양보다 과량의 환경을 만들었을 때 IL-10이 조직에 어떠한 역향을 미치는지에 대한 연구는 아직 없었다. 중이염의 원인이 단순한 감염에 의한 원인이라고는 설명되지 않는 부분이 많으며 오히려 과도한 국소면역반응에 의한 조직의 변화도 하나의 원인이 되는 만큼 세균의 내독소인 리포다당류(Lipopolysaccharide, LPS)로 유발한 실험적 중이염의 급성 염증기에서 IL-10의 투여가 중이 점막에 대해서 실제로 조직학적인 항염 작용을 하는 지에 대해 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

실험동물 및 실험군 
   동일한 조건에서 사육된 7주령의 BALB/c mouse 24마리(48귀)(Japan SLC, Shizuoka, Japan)를 대상으로 다음과 같이 실험군과 대조군을 나누었다.
   1) 음성 대조군-Phosphate Buffered Solution(PBS) 투여군(n=8귀)
   0.1 mL의 PBS만을 중이강 내에 투여한 군. 
   2) 양성대조군-LPS 투여군(n=8귀) 
   1 mg/mL 농도로 LPS(LPS from Pseudomonas aeruginosa, Sigma, St. Louis, MO, USA)만을 100 μL(0.1 mL) 중이강 내에 투여한 군.
   3) 실험군 1-LPS+IL-10 0.1 ng/mL 투여군(n=8귀) 
   Recombinant Mouse IL-10(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)을 PBS에 희석하여 0.1 ng/mL의 농도로 맞춘 후 0.1 mL을 중이강 내에 투여한 군.
   4) 실험군 2-LPS+IL-10 1 ng/mL 투여군(n=8귀) 
   Recombinant Mouse IL-10(R&D systems)를 PBS에 희석하여 1 ng/mL의 농도로 맞춘 후 0.1 mL을 중이강 내에 투여한 군.
   5) 실험군 3-LPS+IL-1010 ng/mL 투여군(n=8귀) 
   Recombinant Mouse IL-10(R&D systems)를 PBS에 희석하여 10 ng/mL의 농도로 맞춘 후 0.1 mL을 중이강 내에 투여한 군.
   6) LPS+IL-10 100 ng/mL 투여군(실험군 4귀)(n=8) 
   Recombinant Mouse IL-10(R&D systems)를 PBS에 희석하여 100 ng/mL의 농도로 맞춘 후 0.1 mL을 중이강 내에 투여한 군.

약제투여
   Ether로 흡입 마취한 후 모든 실험군과 대조군에 대하여 수술용 현미경을 이용하여 건강한 외이와 중이를 가지고 있는 지를 확인하고, 27 G 주사용 바늘로 고막의 상부에 counter perforation을 내고 고막의 하방에 고막천자를 하고 LPS, PBS, LPS와 IL-10을 주입하였다. LPS와 IL-10 투여군은 LPS 0.1 mL를 중이강에 투여한 직후, IL-10 0.1 mL를 같은 방법으로 투여하였다. 주입한 약물이 중이강 내에서 고루 퍼지도록 흰쥐를 5분간 눕혀 놓았다.

조직 채취 및 표본 제작 
   양성대조군과 음성대조군, 실험군에서는 약물을 흰쥐의 중이강에 투여한 지 각각 24시간 후에 흰쥐를 각 군당 각각 4마리(8귀)씩을 케타라(ketamine hydrochloride, 유한양행, 한국) 100 mg/kg과 럼푼(xylazine, Bayer, Germany) 6 mg/kg을 복강내 주사하여 전신 마취시킨 후 수술용 현미경 하에서 흰쥐의 복강을 열고 복대동맥을 절단하여 방혈시킨 후 심장 내로 헤파린이 섞인 식염수 100 mL와 0.1 M PBS 완충 용액을 이용하여 pH 7.4로 맞춘 4% Paraformaldehyde(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 주입하여 심장관류 고정을 하고 즉시 두개골을 개방하고 뇌를 제거한 후 측두골 전체가 완전히 포함되도록 양측 측두골을 적출하였다. 
   그후 4% Paraformaldehyde 용액에 담가 24시간 추가로 고정한 후, Rapid decalcifying solution(Calci-Clear Rapid, National Diagnostics, Atlanta, GA, USA)에 24시간 탈회하였다. 파라핀에 포매한 후 조직을 5 μm의 두께로 박절하여 슬라이드에 부착시켜 Hematoxylin-Eosin으로 염색하였다. 

조직소견의 분석 

염증세포의 침윤정도
   각 조직절편에서 중이 갑각을 덮고 있는 점막을 400배 시야에서 관찰하여 측정하였다. 2.5×2.5 μm² 크기의 격자를 상피 기저막에 맞추고 격자 안에 있는 세포 수를 세었다. 격자 선에 세포가 걸쳐진 경우에는 상측과 좌측 선에 걸린 것은 포함하였고 하측과 우측 선에 걸린 것은 제외하였다. 각 개체의 염증세포 수는 10개의 조직절편에서 측정한 수치의 평균으로 하였고, 각 군의 평균 염증세포 수는 8귀 수치의 평균으로 하였다.

상피하층의 두께 측정
   각 조직 절편에서 중이 갑각을 덮고 있는 점막 중 가장 두꺼운 부분의 두께를 400배 시야에서 측정하였다. 각 개체의 상피하층 평균 두께는 5개의 조직절편에서 측정한 수치의 평균으로 하였고, 각 군의 상피하층 평균 두께는 8귀 수치의 평균으로 하였다.

통계학적 검증
   각 대상군의 통계학적 분석 방법은 일원분산분석법(ANOVA)을 사용하였고, Tukey 다중 t검정을 이용하여 사후 분석하였다. 통계프로그램은 SPSS for Windows Ver.11.5를 이용하였고, 유의수준은 5%로 하였다. 

결     과

IL-10의 농도 차이에 따른 염증세포의 침윤 
   실험군 1에서 실험군 4까지 점막하층에 위치한 염증세포의 갯수는 IL-10의 농도가 증가함에 따라 감소하였고, 실험군 1에서 4까지 모두 양성 대조군에 비해 통계적으로 유의한 감소를 보였다(p<0.05)(Figs. 1 and 2).

IL-10의 농도 차이에 따른 점막하층 두께의 측정
   실험군 1에서 실험군 4까지 점막하층의 두께는 IL-10의 농도가 증가함에 따라 감소하였고, 실험군 1에서 4까지 모두 양성대조군에 비해 통계적으로 유의한 감소를 보였다(p<0.05)(Figs. 1 and 3).

고     찰

   급성 중이염 동안의 중이내 염증 과정은 세균과 바이러스, 백혈구, 대식세포 그리고 여러 종류의 싸이토카인이 관련된 복잡한 과정으로,⁵⁾ 싸이토카인은 여러가지 손상과 감염에 대한 면역반응의 매개체로서 염증반응의 시작과 전파에 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.⁶⁾ 
   싸이토카인은 다양한 세포에서 생산되는 polypeptide로서 감염이나 독소, 외상 등에 대한 염증 반응의 중심적인 역할을 하는 물질들로 IL(interleukin)-1β와 TNF(tumor necrosis factor)-α는 초기 염증 반응에 가장 중요한 역할을 하는 싸이토카인들이다.⁷⁾ 이들은 T 세포의 증식을 촉진하고, 대식세포를 활성화 시키며, 염증부위로 과립구(granulocyte)들의 유입을 일으키고, 발열 반응을 유발하고, 급성기 단백질(acute-phase protein)의 생산을 유도하고, 결합조직과 골의 리모델링을 일으키고, 혈관투과성을 증가시키는 여러가지 기능을 가지고 있다.⁷⁾
   리포다당류(LPS)는 Haemophilus influenzae와 같은 Gram 음성 내독소 분비 세균의 세포벽에 존재하는 다당류로서 IL-1β와 TNF-α를 매개로 하여 중이 점막에 염증반응을 일으키는 흔한 원인 물질이 되며, Ovesen과 Ledet⁸⁾은 삼출성 중이염 환자의 중이 삼출액의 96%에서 검출되었다고 보고한 바 있다. 내독소에 의해 발생하는 염증은 TNF-α나 IL-1β와 같은 여러가지 전염증(proinflammatory) 싸이토카인에 의하여 발생되고, 중이 삼출액에서 내독소의 농도와 이러한 싸이토카인의 농도 사이에는 통계적으로 유의한 상관관계를 보인다.⁹⁾ 
   IL-10은 자연 면역의 주된 조절 싸이토카인으로 다핵호중구, 단핵구, 대식세포로부터 생산되는 염증성 싸이토카인의 생산을 억제하고, IL-10의 항염 효과를 증진시키는 물질들의 표현을 상향 조절한다.¹⁰⁾
   여러가지 질환과 손상에 대한 IL-10의 역할과 효과에 대한 동물실험과 임상연구가 있어왔다.^11,12,13,14) IL-10의 항염 작용은 대장 내 박테리아 항원에 대한 과민반응에서 생기는 염증창자병(inflammatory bowel disease, IBD)을 일으킨 IL-10 결핍 흰쥐 동물모델에 대한 연구에서 확인되었다.¹¹⁾ Ozturk 등¹²⁾은 동물실험을 통해 고용량의 인간 합성 IL-10이 저산소증에 의해 유발된 골격근의 손상을 유의하게 감소시켰다고 보고하였고, Qian 등¹³⁾은 신경세포의 배양 연구를 통해 IL-10이 LPS에 의해 유발된 TNF-α, nitric oxide(NO), 세포외 superoxide의 생산을 감소시키고, NADPH oxidase(PHOX)의 기능을 억제시킴으로써 리포다당류에 의한 신경독성을 예방할 수 있었다고 보고하였다.
   본 실험에서도 다양한 농도의 IL-10이 중이염의 급성기의 염증세포 침윤과 점막의 비후를 감소시키는 조직학적인 염증 감소의 결과를 보였으며, 배양된 세포나 IL-10 결핍모델이 아닌 실험동물 내에 외부 IL-10을 직접 주입한 점에서 일반적인 생체 내의 약물 투여 양상과 더 유사하다 하겠다.
   삼출성 중이염 동물 모델의 싸이토카인 연구에 의하면 급성 중이염의 초기 단계에서 주로 CD4 T 임파구에 의해IL-10이 생산되는 것으로 보고 되었다.^15,16,17,18) Streptococcus pneumoniae는 급성중이염 발병 인자 주사 후 1~2일 사이에, Non-typeable Haemophilus influenzae(NTHi)는 더 빨라서 주사 후 6시간 내에 생성되며,^16,18) 또한 IL-10 mRNA의 발현이 TNF-a와 IL-6 mRNA의 발현에 뒤이어 생기거나, 동시에 발현되기도 한다.¹⁸⁾ 또 Streptococcus pneumoniae의 중이내 주입 후 1~2일 이내로 IL-10 m RNA의 발현이 유도되어 급성 중이염에서는 IL-10의 출현이 좀 더 빠른 것으로 보고되었다.^15,16)
   IL-10은 삼출성 중이염으로 환기관 삽입술을 시행받은 환아들의 중이 삼출액에서 발견되었고, 그 평균 농도는 56±58.7 pg/mL으로 보고되었는데,¹⁹⁾ 본 실험에서는 외부에서 투여한 IL-10이 농도 의존적인 양상으로 중이 점막에 작용하여 조직 차원에서 급성 염증의 소견을 감소시킴을 보여주었다. 과량의 외부 IL-10의 주입에도 농도 의존적으로 중이 점막 조직의 급성 염증 소견이 소실된 결과로 보아 중이 조직에서의 IL-10 수용체는 포화된 상태가 아님을 추측할 수 있었다.
   IL-10은 세균감염에 의해 유도되는 중이 염증 반응의 조절에 관련되어 있다.⁴⁾ 급성중이염에서 IL-10의 발현은 TNF-a이나 IL-6과 같은 전염증(proinflammatory) 싸이토카인의 발현 직후 또는 거의 동시에 나타난다.⁴⁾ 즉, 중이점막에서 면역조절개시의 증거는 IL-10이 주된 항염 싸이토카인으로서 염증세포의 발생과 응집과 TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-8과 같은 전염증(proinflammatory) 싸이토카인의 생산을 하향 조절하여 염증의 해소를 촉진하는 것으로 알려져 있다.⁴⁾ 본 실험에서의 결과로 보아도 중이염의 초기 단계에서 과량의 IL-10의 중이강내 주입이 0.1 ng/mL에서 100 ng/mL의 농도까지는 LPS에 의해 발생한 중이염의 염증반응을 억제하는 효과를 보였고, 이는 적어도 중이염 초기의 급성 염증 반응 단계에서는 중이염의 해소에 도움이 되는 것으로 생각된다.
   급성 중이염에서의 초기 염증의 조절에 대한 싸이토카인의 외부적 개입이 질환 자체에 대해 어떠한 영향을 줄 것인지에 대한 향후 추가적 연구가 필요할 것이고 IL-10이 중이염의 만성화에도 관련성이 제시되는 바 이에 대한 연구도 필요하리라 생각된다. 또한 급성기 염증을 감소시키는 것이 중이염의 치료에 도움이 되는 지의 여부, 중이염과 관련된 여러 싸이토카인들에 대한 IL-10과의 상호 작용과 IL-10의 중이내 국소투여가 생체에 미칠 전신적인 영향에 대한 추가적 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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