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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(2): 277-285. |
| Noise Induced Changes of Glucocorticoid Receptors in Rat Cocohlea. |
| Jong Seon You, Hyun Ho Lim, Jong Ouck Choi |
| Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. |
| 소음자극 후 흰쥐 와우에서 Glucocorticoid 수용체 발현의 변화 |
| 유종선 · 임현호 · 최종욱 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| ABSTRACT |
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It has been suggested that glucocorticoid receptors are present in inner ear tissues and may act in stress related mechanism of cochlea. The purpose of this study was to determine whether stress to auditory system could change glucocorticoid receptors(GR) in the cochlear tissues and to hypothesize the relationship between heat shock protein and glucococorticoid receptors which may involve in stress related mechanism of cochlea. Sprague-Dawley rats were exposed to intense broad band noise(110dB SPL) as a stressful condition to auditory system and immunohistochemical and western blot analyses were used to compare the expression patterns of glucocorticoid receptors between noise exposed and normal rat cochlea. In western blot analysis, immunoreactive bands of noise exposed cochlear tissues were weaker than those of normal non-noise exposed cochlear tissues. In immunohistochemistry, GR immunostaining was observed in spiral ligament, stria vascularis, and outer hair cells of both noise exposed and normal cochlear tissues. Density of immunoreactive staining was decreased after noise exposure. With these results was could hypothesize the relationship between glucocorticoid receptor and heat shock proteins under stressful condition in the cochlea. If the cochlea is exposed to stress such as noise trauma, glucocorticoid hormone would be released and enter the cell to bind to glucocorticoid receptors with dissociation of heat shock proteins from the DNA binding sites. Then the levels of glucocorticoid receptors in the cytoplasm would be decreased and resultant increased expression of heat shock proteins may occur. This study suggest that glucocorticoid receptors may participate in stress response of the cochlea alone or in conjunction with heat shock proteins. |
| Keywords:
Glucocorticoid receptorㆍNoiseㆍCochlea |
서론
생물체에 가하여지는 스트레스는 다양한 환경적, 물리적, 감정적인 요소들로 이루어져 있으며, 이들로부터 생물체가 적응하기 위하여 여러 반응들이 나타나게 된다.
스트레스 호르몬으로 불리우는 glucocorticoid는 부신피질에서 생성되며, 생물체에 가해지는 다양한 종류의 스트레스에 대하여 적응해 나갈 수 있도록 하는 기능을 가지고 있다. 조직에서 glucocorticoid 호르몬의 생물학적 기능은 세포내에 존재하는 glucocorticoid receptor(GR)의 숫자에 의존된다고 알려져 있다.2)25) 스트레스의 조건에 생물체가 노출되면 혈중 glucocorticoid 호르몬이 증가하게 되고 표적세포 내의 GR의 수와 그에 대한 친화력이 변화된다.12)13) 세포 내에 존재하는 GR은 스테로이드 호르몬과 결합하는 부분(steroid binding domain)과 핵산과 결합하는 부분(DNA binding domain), 그리고 면역원성의 부분(immunogenic domain)으로 구성되어 있으며, 일반적으로 glucocorticoid 호르몬에 의한 세포의 반응은 steroid가 우선 세포질 내의 특이단백인 호르몬의 수용체와 결합하고, 이 호르몬-수용체 복합체(hormone-receptor complex)가 핵 내로 전달되어 특이한 DNA 염기 배열과 반응하여 유전자의 복제가 시작되고, 또한 유전자 생성물의 유전정보 해독 후 변화(posttranslational modification)에도 영향을 주어 결과적으로 세포나 조직에서 다양한 반응을 일으키게 한다. 포유동물의 말초 청각기관인 와우는 여러가지 스트레스에 노출되어 있고 내이에 가하여지는 스트레스의 강도에 따라 일시적 혹은 영구적으로 기능이 손상되어7) 청각장애와 더불어 평형기능장애가 나타나게 된다. 이러한 여러가지 스트레스 또는 자가면역현상 등에 의하여 초래되는 청각장애와 평형기능장애의 치료에 스트레스 호르몬인 glucocorticoid가 사용되고 있으나, 내이에서 이 호르몬의 작용기전은 아직 정확하게 알려져 있지 않은 실정이다. 청각기관에서의 GR의 분포에 관하여는 항원-항체 결합반응을 이용한 western blot 분석법26), ELISA 법17), 면역조직화학적 염색법9)27) 등의 방법을 이용하여 와우와 전정기의 조직에서 존재를 확인한 보고들이 있다. 특히 청각기관인 와우에서는 측벽조직인 나선인대와 혈관조에서 GR이 발현된다고 보고되었으며27) 이와 같은 결과는 GR이 이들 조직에서 이온 및 체액역동에 어떠한 역할을 할 것이라는 가능성을 제시하였다. 또한 감각신경세포가 존재하는 코르티기관에서는 외유모세포에서 많이 분포하는 것으로 보고하여9) 소음성난청, 이독성난청에서 가장 손상을 많이 받는 것으로 알려져 있는 외유모세포에서 스트레스 후에 GR이 감각세포의 손상 및 변화에 어떤 역할을 하지 않나 생각되고 있다.
GR은 강한 자극으로부터 세포를 보호하는 방어 기전에 관여하는 heat shock protein(HSP) 중 HSP 90 및 HSP 70과 복합체를 형성하고 있다고 알려져 있다.5)20)22) HSP는 열 자극3), 일시적 허혈자극14), 강한 소음자극8) 후 와우에서도 발현이 유도되며, 소음자극 후 외유모세포에서 HSP 728), HSP 90의 발현이 증가하여10), 일시적 청각역치 상승이 영구적인 기능장애로 이행되는 것을 방어한다는 가설11)로 미루어 heat shock protein이 청각기관의 방어 기전에도 중요한 역할을 할 것으로 생각할 수 있다. 특히 소음자극 후에 외유모세포에서의 HSP 72의 발현 양상은 정상 와우의 외유모세포에서 발현된 GR의 소견과 매우 흡사하게 표현되고 있음을 알 수 있고 이와 같은 결과는 GR-HSP 복합체가 와우의 조직 내에서 스트레스에 대한 생리적인 방어 기전에 관여하고 있다는 것을 암시하여 주고 있다. 따라서 말초 청각기관에 특이한 스트레스로 인정되고 있는 강한 음자극 후 와우조직에서 GR의 발현의 변화를 관찰하고 HSP와의 관계를 설정하는 것은 스트레스로부터 와우조직의 생리적 방어 기전을 이해하는데 도움을 줄 것이라 생각된다.
이 연구에서 저자는 정상 흰쥐와 소음자극을 받은 흰쥐의 와우조직에서의 GR의 발현의 변화를 비교 관찰하여 스트레스에 대한 와우 조직의 반응을 규명하고자 하였다.
재료 및 방법
1. 실험 동물
실험동물로는 Preyer reflex가 정상이고 정상 고막소견을 보이는 체중 200∼250gm 내외의 Sprague-Dawley계의 성숙된 수컷 흰쥐를 사용하였으며 실험군(소음자극군)과 대조군(정상군) 각 40마리씩(면역조직화학적 염색과 western blot 분석을 위해 각각 20마리)을 사용하였다.
2. 실험 방법
1) 실험동물의 소음자극
실험동물은 외부의 음이 차단된 소음 피폭 상자에서 110 dB SPL의 광역대 잡음으로 4시간씩 2일 동안 자극하였다. 대조군은 소음자극을 주지 않고 조용한 곳에서 2일간 보관한 후 실험군과 같은 시간에 희생시켜 조직을 채취하였다.
2) 시약
면역조직화학적 염색과 wester blot을 위한 일차 항체로 생쥐에서 추출한 항 GR 단일크론항체(Affinity BioReagents사 제품)를 사용하였으며, 또 일차 항체의 항원-항체 결합을 검색하기 위하여 Vectastain ABC kit(Vecta Laboratories, Inc., Burlingame, CA)를 사용하였다. 그 외 전기영동과 면역조직화학적 염색의 과정에 필요한 시약은 특별한 언급이 없는 한 주로 Sigma Chemical Co. 제품을 사용하였다.
3) 전기영동 및 western blot
실험동물을 단두(decapitation)하여 측두골을 얻은 후, 해부입체현미경(dissecting stereomicroscope)을 이용하여 4℃의 Hank’s balanced salt solution(HBSS)에서 해부하여 와우의 조직을 얻었다. 와우의 조직은 와우의 감각상피세포(sensory epithelium) 및 외측벽인 나선인대와 혈관조(spiral ligament and stria vascularis)의 두 부분으로 분리되었다. 얻어진 조직을 균질화 완충 용액[10mM HEPES, pH 7.4, 0.2mM ethylenglycol-bis-(b-aminoethyl ether)N,N,N',N'-tetra-acetic acid(EGTA) with phenylmethylsulfonylfluoride PMFS)]하에서 균질화하여 원심 분리하고, 그 상층액을 SDSPAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 사용하였다. 용해질 내의 단백질 농도는 bovine serum albumin을 이용한 염료결합법으로 측정되었다. 즉, 단백질 30μg 상당의 용해질을 표본완충용액(62.5mM Tris-Hcl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0.003% bromophenol blue)에 섞고 5분간 끓인 후, 8% SDS polyacrylamide gel을 이용하여 35mA의 일정 전류로 약 3시간 동안 전기영동하였다.6) 분리된 단백들은 Towbin 등24)의 방법에 따라 nitrocellulose막(Millipore Corp., Bedford, MA)에 100mA의 일정 전류로 2시간 동안 전기영동하여 전이하였다. 단백질이 이동된 nitrocellulose막은 비특이 반응을 방지하기 위하여 blotto(5% dried milk and 0.2% Tween 20 in 20mM Tris-HCl, 500mM NaCl[TBS], pH 7.5)에서 1시간 동안 처리한 후, 1차 항체(mouse monoclonal antiglucocorticoid receptor antibody, 1：1000)로 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 일차 항체의 반응이 끝난 blot은 TBS 용액에서 10분씩 세 차례 세척 후 biotin-labeled anti-mouse IgG(Vector Lab. 1：400 in TBS) 용액에 1시간 동안 처리하고 TBS로 10분씩 세 차례 세척 후, avidin-biotinylated horseradish peroxidase(HRP) complex(Vector Lab, 1：200 in TBS) 용액에 45분 동안 처리하였다. 동일 방법으로 10분씩 세 차례 수세한 후 DAB(0.05% 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride/0.06% H2O2/0.05M TBS, pH 7.6)에 담가 약 3∼5분간 발색반응을 거친 뒤 증류수로 세척하고 건조시킨 후 발색된 band를 관찰하였다.
4) 면역조직화학적 염색
실험동물에 nembutal(pentobarbital sodium, 60mg/kg)을 복강내 주사하여 깊게 전신마취한 후 개흉하여 심장을 노출시켰다. 좌심실의 끝 부분을 절개하여 그 사이를 통하여 굵은 주사
바늘(14 gauge)을 상행대동맥에 삽입하고 결찰한 후 우심방을 절제한 후 heparin(2 I.U/cc)을 첨가한 0.9% 생리식염수로 관류하여 혈액을 씻어내었다. 연속적으로 약 500ml의 4% paraformaldehyde in phosphate buffered saline(PBS)로 약 1시간 동안 관류고정하였다. 고정된 쥐의 두개골을 해부하여 측두골로부터 와우를 얻은 후, 같은 고정액으로 정원창막을 통하여 와우를 국소 고정하고 계속해서 하룻밤 동안 후고정하였다. 고정된 와우는 해부입체현미경하에서 바깥쪽 골부를 제거하고, 와우의 전장에 걸쳐 코르티기관을 보존한 표면조직표본을 얻고, 그 외의 와우들은 4℃의 8% EDTA용액에서 3∼5일간 탈석회화한 후 액화질소로 급속냉동하고 OCT용매에 포매한 후 15μm의 두께로 냉동절편을 만들고 gelatin이 피막된 slide에 부착시켰다. 와우의 표면조직표본 염색시 실험군과 대조군 사이의 염색 과정에 의한 오차를 줄이기 위하여 실험군의 일측 와우조직과 대조군의 반대측 와우조직을 동시에 같은 시약에서 같은 배양시간으로 처리하였다. 면역조직화학적 염색법인 avidin-biotin-peroxidase complex(ABC)법4)을 요약하면 다음과 같다. 먼저 조직을 상온에서 0.3% H2O2/PBS에 10분간 처리한 후 PBS에 5분씩 3회 수세한다. 조직내의 비특이반응을 줄이기 위해 3% normal horse serum(＋0.3% trinton X-100 ＋1% BSA)에 40분간 incubation하고 PBS에 10분씩 3회 수세한 후 1차 항체(mouse monoclonal anti-GR antibody, 1：500)에 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그리고 PBS에 10분씩 3회 수세한 후 2차 항체(biotin-labeled anti-mouse IgG, 1：400 in PBS) 용액에 1시간 동안 처리하고 다시 PBS에 10분씩 3회 수세의 과정을 거친 후 HRP complex(Vector Lab, 1：200 in PBS) 용액에 45분 동안 처리하였다. PBS에 10분씩 세 차례 수세한 후 DAB(0.05% 3,3’-diami-nobenzidine tetrahydrochloride/0.06% H2O2/PBS, pH 7.3)에 담가 약 3∼5분간 발색반응을 거친 뒤 증류수로 수세한다. 와우의 표면조직은 해부입체현미경하에서 다시 한 회전씩 분리한 후 50% glycerol in PBS용액을 떨군 slide 위에 붙이고, 동결절편조직은 건조시킨 후 탈수와 탈지의 과정을 거쳐 봉입하여 광학현미경하에서 관찰하였다.
면역조직화학적 염색이 끝난 20마리의 와우의 표면조직표본과 동결절편조직에서 외유모세포와 외측벽의 조직은 디지털 영상으로 만든 후 화상분석기(Media Cybernetic사의 ImagePro ＋ software)를 이용하여 외유모세포와 혈관조의 광학적 밀도를 측정하여 비교 검토하였으며, 통계적 검증은 student t-test를 시행하였다.
결과
1. western blot 분석에 의한 GR 발현의 비교 검색
각각의 와우조직에서 GR과 반응하여 발색된 띠는 표준 분자량 측정 띠에서 약 95kD의 분자량으로 관찰되었다. 와우의 코르티기관과 측벽의 조직에서 발현된 띠중 실험군에서 대조군의 와우조직에 비하여 현저히 감소된 면역반응을 관찰할 수 있었다(Fig. 1).
2. 면역조직화학적 방법에 의한 GR의 검색
와우의 표면조직표본과 동결절편조직에서의 GR의 면역반응은 대조군과 실험군의 와우조직에서 모두 관찰되었다. 와우 각 부분에서 소음자극 유무에 대한 면역반응의 변화는 다음과 같았다.
1) 코르티기관(Organ of Corti)
대조군의 표면조직표본에서 외유모세포 전장에서 GR에 대한 강한 면역반응을 관찰할 수 있었고, 내유모세포는 일부에서 부분적인 면역염색의 소견을 보일 뿐 거의 대부분의 조직에서 면역반응을 나타내지 않아 외유모세포와 크게 대조되는 소견을 보였다. 반면에 강한 소음자극을 받은 와우조직의 외유모세포에서는 면역반응의 강도가 현저히 약하게 발현되는 염색 소견을 볼 수 있었으며 드문 드문 면역반응을 나타내지 않는 외유모새포들이 관찰되었다(Fig. 2).
2) 와우의 측벽
나선인대(spiral ligament)와 혈관조(stria vascularis)로 이루어져 있는 와우의 측벽에서는 정상 와우조직에서 GR에 대한 면역반응이 관찰되었으며 이와 같은 소견은 소음자극 후에는 미약하게 감소한 소견을 보였다(Fig. 3).
3. 화상 분석을 이용한 GR의 발현의 변화에 대한 검색
소음자극 후의 와우조직과 정상 와우조직의 광학 밀도를 비교한 결과 소음자극을 받은 외유모세포에서는 정상 와우조직에 비하여 약45%(p＝0.0024)의 광학 밀도의 감소를, 혈관조에서는 약12%(p＝0.058)의 감소를 관찰할 수 있었다(Fig. 4).
고안
와우에서 GR의 발현 및 분포에 관하여 생화학적16)15), 조직화학적 연구9)27) 등의 결과가 보고되고 있으며, 이들 결과에 의하면 와우조직 내에서는 측벽의 나선인대와 혈관조, 코르티기관에서는 특히 외유모세포에서 강한 면역반응을 보인다고 보고하였다. 외유모세포는 청각신호 전달체계에 있어서 미세한 주파수 특성을 감지하는데 중요한 역할을 하고 있으며, 와우 측벽의 혈관조는 내이의 체액 및 이온의 항상성 조절에 관여한다고 알려져 있다. 또한 이 조직들은 소음자극에 대하여 매우 민감하여 쉽게 손상됨과 동시에 청각기능의 저하를 초래하게 된다. 따라서 이들 조직에서 GR의 발현은 와우의 소음자극에 대한 반응에 glucocorticoid 호르몬과 수용체의 역할이 매우 중요하다는 것을 예측하게 한다.
말초 청각기관인 와우는 다양한 자극으로부터 와우의 조직을 보존하고 미세 항성성을 유지하기 위하여 여러가지 반응을 나타내고 있다. 소음자극 후 와우의 변화와 반응에 관한 연구로서, Alario등1)은 소음자극 후 혈중 corticosteroid가 증가한다고 하였고 Scheibe등21)은 소음자극의 정도에 따라 와우 내 혈류량이 변화한다고 하였다. 최근 Rarey등19)은 ELISA방법으로 와우에서는 GR의 변화를 관찰하여, 소음자극 후 혈중 cortisone의 증가와 함께 와우의 측벽과 코르티기관에서 GR이 감소한다고 하였다. 본 연구에서는 western blot 분석과 면역조직화학적 염색을 이용하여 소음자극에 의한 와우조직에서 GR 발현 변화와 이와 유사한 발현 양상을 보이는 스트레스단백의 발현과의 상호작용 기전을 이해하고자 하였다.
Western blot과 면역조직화학적 염색을 이용한 이 연구 결과에서는 정상 와우조직에 비하여 강한 소음자극 후 와우의 외유모세포와 측벽의 조직에서 GR의 면역반응이 현저히 감소한 소견을 볼 수 있었다. 이와 같이 수용체 level이 감소한 것은 강한 소음에 의하여 부신 피질에서 분비된 호르몬이 와우조직의 세포 내에서 수용체와 결합함으로써 세포 내에 유리된 GR의 양이 감소되었기 때문이라고 생각된다. 각 조직간의 GR의 변화에는 약간의 차이를 볼 수 있다. 외유모세포에서는 대조군보다 약 45%가 감소한 반면, 측벽의 혈관조에서는 약 12%의 미세한 감소를 관찰할 수 있었다. 이는 소음자극에 대한 와우의 반응에서 외유모세포가 혈관조보다 더욱 예민하게 반응하며, 조직마다 스트레스에 대한 반응이 각기 다르다는 것을 시사해 주고 있다. 코르티기관의 신경 말단부위에서는 유모세포의 기능을 조절하는 원심성 신경 섬유(efferent nerve fiber)가 존재하며, 주로 외유모세포에서 GR이 발현된다는 사실은 외유모세포가 GR의 신경 조절 및 내분비 조절하에 있을 수 있다는 가능성을 예측할 수 있으며, 소음자극 후 올리브-와우 원심성 신경 섬유(olivo-cochlear efferent nerve bundle)를 통한 유모세포의 손상에 대한 방어 기전에 소음자극으로 변화된 GR이 한 역할을 할 것이라 추측할 수 있다. 측벽의 나선인대와 혈관조는 코르티기관과는 달리 섬유세포가 풍부한 결체조직과 혈관이 풍부한 조직으로 이루어져 있다. 이들 조직에서 GR의 역할에 관하여는 정확히 밝혀져 있지 않지만 나선인대에서는 세포외기질 성분의 생산, cyclic AMP의 양, prostaglandin의 유리를 조절하고23), 혈관조에서는 이온과 액체의 항상성 조절에 중요한 역할을 하고 있는 Na,K-ATPase가 glucocorticoid 호르몬에 의해 조절된다고18) 생각되어지고 있다. 그러나 소음자극 후 와우 측벽 조직에서 GR의 변화가 매우 미약한 것은, 소음자극이 이들 조직에는 커다란 영향을 미치지 못하며, 이들 조직에서의 GR은 소음자극 이외의 다른 스트레스 하에서 변화를 보일 수 있을 것이기 때문이라고 생각된다.
와우조직에서 스트레스에 대한 방어 기전에 관여하는 다른 하나의 요소로 heat shock protein(HSP)이 있다. Heat shock protein은 매우 안정된 세포 내 단백질로서 세포에 손상을 줄 수 있는 여러가지 스트레스(열 자극, 허혈 자극, 대사억제제 등) 후에 세포 내에서의 생성이 증가되어 세포의 방어기전에 작용한다고 알려져 있어 일면 스트레스 단백질이라고도 불리운다. 소음자극 후 유발된 HSP 72의 발현은 주로 외유모세포와 혈관조에서 관찰된다고 보고되었다.8) 이 결과는 정상 와우에서의 GR의 분포와 일치하는 소견을 보인다.9) 본 실험에서 관찰된 소음자극 후 GR 감소는 와우조직에서 소음자극 후 발현된 유발형 HSP 72 및 HSP 90의 증가와 밀접한 관계를 가지고 있을 것으로 생각되며, 세포 내에서의 이들 단백질의 대사 과정을 이해하는 것은 와우조직의 스트레스에 대한 방어 기전을 연구하는데 중요한 자료가 될 것으로 생각한다.
저자들은 본 실험 결과를 토대로 하여, 와우에서 소음자극과 같은 스트레스 조건하의 GR과 heat shock protein 대사 과정에 대하여 다음과 같은 가설로 와우조직에서 glucocorticoid 호르몬의 작용기전과 스트레스 단백질과의 상호 관계를 이해하고자 한다(Fig. 5). 와우조직에 강한 스트레스(소음, 이독성 약제 등)가 가하여지면 이에 대한 반응으로 체내 glucocorticoid 호르몬의 분비가 증가하고, 증가된 호르몬이 세포 내로 들어가면 억제단백질의 역할을 하고 있는 스트레스 단백질이 GR으로부터 분리되며 호르몬이 수용체의 호르몬 결합 부위에 접합하여 호르몬-수용체 복합체를 형성하게 된다. 결과적으로 유모세포의 세포질 내의 호르몬 수용체의 양은 감소하는 반면, 수용체와 결합하고 있던 스트레스 단백질(heat shock protein)의 양은 증가하게 되는 것으로 여겨진다. 이와 같은 작용기전을 통하여 glucocorticoid 호르몬과 스트레스 단백질이 와우조직의 손상을 방어하고 항상성을 유지함으로써 기능과 형태의 보존에 각기 혹은 함께 작용을 하고 있을 것으로 생각된다.
결론
소음자극 후 GR 발현의 변화를 관찰하기 위하여 소음에 피폭된 흰쥐와 대조군 흰쥐의 와우에서 항 GR 단일크론 항체를 이용한 western blot 및 면역조직화학적 염색을 시행하여 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
강한 소음자극 대한 와우조직의 반응은 강한 소음으로 체내 glucocorticoid 호르몬의 분비가 증가되고, 증가된 호르몬이 세포내로 들어가 GR에 결합을 하게 되며, 결과적으로 세포질 내의 GR의 양은 감소하고 수용체와 결합하고 있던 스트레스 단백질(heat shock protein)의 양이 증가하게 되는 것으로 생각된다.
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