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Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1997;40(3): 402-408. |
| Neurogenic Inflammation Induced by Hypertonic Saline in Rat Nasal Mucosa. |
| Heung Man Lee, Sang Hag Lee |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Korea University College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 흰쥐 비점막에서 고장식염수에 의한 신경성 염증에 관한 연구 |
| 이흥만 · 이상학 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| ABSTRACT |
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The purpose of this study was to investigate whether inhaled hypertonic aerosols could increase vascular permeability in the rat nasal mucosa which was mediated by the release of sensory neuropeptides. Sprague Dawley rats were divided into following groups: hypertonic saline(3.6-14.4%NaCl) inhalation group, phosphoramidon(2.5mg/kg, i.v.) pretreated group, capsaicin desensitized group, substance P inhalation(10-4 M) group with or without capsaicin pretreatment group. Rats were exposed to ultrasonically nebulized aerosols. The magnitude of the increase in vascular permeability of nasal mucosa was observed using fluorescent microscope and measured by quantifying the extravasation of Evans blue dye. Hypertonic saline aerosols increased vascular permeability dose-dependently compared with 0.9% NaCl(p<0.05). The neutral endopeptidase inhibitor, phosphoramidon potentiated the increase of vascular permeability(p<0.01) and desensitization of sensory nerve endings by pretreatment with capsaicin reduced the usual increase in vascular permeability induced by 3.6% NaCl(p<0.01). However, the increase in vascular permeability induced by aerosolized substance P was unchanged(p>0.05).
Therefore, these results suggest that aerosols of hypertonic saline increase the plasma extravasation by stimulating the release of neuropeptides from the sensory nerves in the rat nasal mucosa. |
| Keywords:
Neurogenic inflammationㆍHypertonic salineㆍNeuropeptide |
서론
신경성 염증은 비점막에 존재하는 capsaicin에 예민한 c섬유를 갖고 있는 지각신경을 기계적이나 전기적으로 또는 capsaicin등과 같은 화학적 물질로 자극하면 지각신경 종말에서 substance P, calcitonin gene-related peptide(CGRP), neurokinin A등의 신경펩티드가 분비되어 혈관투과성을 증가시켜 혈장의 혈관외유출과 비점막의 부종을 일으키는 현상을 일컫는다.14)16)18)19) 지각신경 종말에서 분비된 신경펩티드는 생체내에 존재하는 neutral endopeptidase 등에 의하여 분해되어 비활성화되는 것으로 알려져 있고 따라서 neutral endopeptidase의 억제제인 phosphoramidon을 투여하면 신경성 염증이 증가한다.20)
Schoeffel등25)은 천식 환자에서 초음파 분무기로 발생되는 고장식염수는 1초간 강제호기량(FEV1)을 감소시키지만 등장식염수로는 감소시키지 않으며 정상인에서는 변화가 없다고 하여 면역학적으로 매개되지 않는 기관지 과반응성의 진단에 유용하다고 보고하였다.
Jancso12)은 눈에 고장식염수를 점적하여 신경성 염증이 일어나는 것을 관찰하였으며, Eschenbacher 등8)은 고장식염수를 흡입하면 기관지에서 신경성 염증을 일으켜 기침이 유발된다고 보고하였다. 그러나 비점막에서는 고장식염수 흡입에 의한 신경성 염증에 대한 보고는 없었다.
본 연구의 목적은 흰쥐 비점막에서 고장식염수의 흡입으로 신경성 염증을 발생시키는 기전을 밝히고자 하였다.
실험 재료 및 방법
1. 실험 재료
실험동물은 건강한 Sprague-Dawley계 흰쥐(체중 200∼300g) 54마리를 사용하였다. 실험군은 다음과 같이 나누었다.
제 1 군은 대조군으로 0.9% 생리식염수를 흡입한 군(6마리).
제 2 군은 고장식염수에 의한 혈관투과성을 관찰하기 위하여 3.6%, 7.2%, 14.4% 고장식염수를 흡입시킨 군(각각 6마리)
제 3 군은 neutral endopeptidase를 억제시키는 phosphoramidon(2.5mg/kg, Sigma, USA)를 정맥주사한 후 3.6% 고장식염수를 흡입시킨 군(6마리)
제 4 군은 과량의 capsaicin(Sigma, USA)을 피하주사하여 지각신경 종말을 탈감작시킨 후 3.6% 고장식염수를 흡입시킨 군(6마리)
제 5 군은 substance P(10 -4 M, Sigma, USA)만을 흡입시킨 군(6마리)과 capsaicin으로 탈감작시킨 후 substance P를 흡입시킨 군(6마리)으로 하였다.
제 6 군은 조직내로 유출된 Evans blue를 관찰하기 위하여 0.9% 생리식염수로 흡입시킨 3마리와 14.4% 고장식염수로 흡입시킨 3마리를 사용하였다.
2. 실험 방법
Urethane(Aldrich, USA)을 25% w/v으로 희석하여 6∼8ml/kg를 복강내로 투여하여 마취한 후 20리터의 용기에 넣은 흰쥐는 초음파 분무기(AND UN-131, Japan)를 사용하여 생리식염수 혹은 3.6%, 7.2%와 14.4%의 고장식염수를 흡입시켰다. 초음파 분무기에서 발생한 입자의 크기는 3μm이었고 흰쥐에게 분당 0.6ml씩 5분간 흡입시켰다.
Neutral endopeptidase의 억제제인 phosphoramidon은 0.9% 생리식염수에 녹여 사용하였고 3.6% 고장식염수를 흡입하기 5분전 꼬리정맥으로 주사하였다.
흰쥐의 지각신경을 탈감작시키는 방법은 Jancso12)의 방법에 따라 capsaicin 4mg/kg, 8mg/kg, 15mg/kg을 24시간 간격으로 3일간 피하주사하였다. Capsaicin은 10% ethanol, 10% Tween 80과 0.9% 생리식염수에 녹여 사용하였으며 마지막 주사한 7일후에 3.6% 고장식염수를 5분간 흡입시켰다. 또한 capsaicin이 혈관에 미치는 영향은 흰쥐를 capsaicin으로 전처치 후 substance P를 초음파 분무기로 흡입시켜 혈관투과성을 관찰하였다. Substance P는 0.01N 초산에 녹여 사용하였다.
혈장의 혈관외유출량은 모든 실험군에서 각각의 용액을 흡입시키기 5분전에 Evans blue(30mg/kg, Sigma, USA)를 꼬리정맥으로 주사한 후 측정하였다.
3. 형광현미경 검사
Evans blue가 혈관외로 유출된 형태의 관찰은 흰쥐를 마취한 후 비중격의 점막을 채취하여 10% 포르말린과 인산완충액(1.0 M, pH7.4)에서 2시간, 인산완충식염수와 5% 자당을 혼합한 용액에 24시간 냉장 보관한 후에 20μl의 두께로 냉동절편을 만들어 그리세린과 인산완충식염수를 3：1로 섞은 용액으로 봉입하여 형광현미경(Olympus, Vanox, Japan)으로 430nm 파장으로 관찰하여 적색의 형광물질을 나타내는 범위를 대조군과 비교하여 검색하였다.
4. Evans blue 추출량 측정
신경성 염증의 정도를 측정하기 위하여 혈장단백과 결합하여 혈장의 혈관투과 정도를 간접적으로 나타내는 Evans blue(30mg/kg, Sigma, USA)를 각 물질 투여 5분전 꼬리정맥에 주사되어졌다. 각 물질을 투여한 5분후에 혈관내에 있는 Evans blue는 생리식염수(150cc/kg)로 심장을 경유하여 관류시켜 제거하였다. 혈장의 혈관외유출량 측정은 희생시킨 흰쥐의 비중격 점막을 채취하여 무게를 측정하고, 채취한 비점막을 formamide(Aldlich, USA) 2cc에 넣은 후 40℃에서 24시간 보관하여 조직내 Evans blue를 추출한 후 분광광도계(Hitach, U-2000, Japan)를 이용하여 640nm 파장에서 광학밀도를 측정하였고 추출된 Evans blue 양을 농도 0.5∼12nm/ml의 Evans blue 분광표준 곡선을 이용하여 비점막 조직무게당 유출된 Evans blue 양(ng/mg)으로 비점막 혈관투과성 정도를 측정하였다.
5. 통계학적 검증
모든 자료는 Macintosh용 통계 프로그램인 Stat-View Ⅱ(Abacus concepts, USA)를 이용하였으며 mean±SE로 표시하였다. 각 군간의 비교는 ANOVA test로 시행하였으며 p<0.05를 통계적 의미를 두었다.
결과
1. 형광현미경 소견
0.9% 생리식염수를 흡입시킨 대조군(Fig. 1A)에 비하여 14.4% 고장식염수를 흡입시킨 군(Fig. 1B)에서는 적색의 형광물질이 보다 넓게 관찰되었다.
2. 고장식염수 농도에 따른 Evans blue 추출량
대조군에서의 Evans blue 추출량은 22.6±7.6ng/mg이었고, 3.6% 고장식염수 흡입군에서는 90.3±16.2 ng/mg, 7.2% 고장식염수 흡입군에서는 123.1±7.6ng/mg, 14.4% 고장식염수 흡입군에서는 172.3±15.6 ng/mg으로 고장식염수의 농도가 증가함에 따라 농도의존성으로 증가하였다(p<0.05)(Fig. 2).
3. Phosphoramidon 전처치 군과 capsaicin으로 탈감작시킨 군에서의 Evans blue의 추출량
Phosphoramidon으로 전처치한 후 3.6% 고장식염수를 흡입시킨 군에서 Evans blue 추출량은 167.5±11.6ng/mg으로 3.6% 고장식염수만을 흡입시킨 군의 90.3±16.2ng/mg보다 증가하였고(p<0.01), capsaicin으로 지각신경 종말을 탈감작시킨 군에서는 30.5±10.8ng/mg으로 감소하였다(p<0.01)(Fig. 3).
4. Capsaicin 전처치 유무와 substance P 흡입에 따른 Evans blue의 추출량
Sybstance P만을 흡입시킨 군에서 Evans blue의 추출량은 139.2±8.4ng/mg이었고, capsaicin으로 탈감작시킨 후 substance P을 흡입시킨 군에서의 Evans blue 추출량은 140.3±12.4ng/mg로 두군간에는 차이가 없었다(p>0.05)(Fig. 4).
고안
비점막에 분포하는 자율신경은 지각신경, 부교감신경 및 교감신경으로 구성되어 있다. 이중 지각신경은 삼차신경을 따라서 분포하며 지각신경 종말에는 substance P, neurokinin A, CGRP등의 tachykinin인 신경펩티드가 존재한다.17) 이러한 신경펩티드는 neutral endopeptidase와 angiotensin converting enzyme 등의 효소에 의하여 분해되고 조절된다.20)23) 신경성 염증은 지각신경을 capsaicin 등을 투여하여 화학적으로 자극하거나 혹은 전기적으로 자극하면 신경종말에서 substance P등의 신경펩티드가 분비되어 혈관확장과 혈장의 혈관외유출을 일으켜 비점막의 부종을 일으키는 것을 말한다.15)17)
알레르기성 및 혈관운동성 비염등과 같은 비점막과민성을 나타내는 질환에서 발생하는 비점막의 부종은 화학전달물질 뿐만 아니라 지각신경에 존재하는 substance P와 같은 신경펩티드가 분비됨으로써 발생한다고 알려져 있고17) 감각신경 전달물질의 일종인 신경펩티드가 최근 면역조직화학적 방법에 의하여 중추, 말초장기 및 혈장에 존재하고 있다는 것이 보고되었다.3)21)
고추가루의 매운 성분인 capsaicin을 비점막에 투여하면 substance P가 감각신경으로부터 고갈되면서 혈관확장 및 혈장의 혈관외유출을 증가시킨다고 보고되어 있다.10)11)16) Substance P가 신경성 염증 반응에 작용하는 기전은 아직 확실하지 않으나, substance P가 비만세포에 연결되어 있어 지각신경을 자극하면 비만세포가 탈과립되어 방출된 화학전달물질이 substance P 수용체와 모세혈관후소정맥(postcapillary venule)에 작용하여 혈관투과성을 항진시킨다는 보고들이 있었다.13)26)
혈관투과성을 측정하는 방법으로 분자무게가 60kD인 Evans blue를 이용할 수 있는데, 이는 혈장 알부민과 밀접하게 결합하여 혈관의 투과성이 증가되면 혈관으로부터 조직내로 알부민과 함께 유출되므로29), 혈관내 존재하는 Evans blue를 제거하면 결국 Evans blue가 조직이나 기도내 존재하는 양으로 혈장의 혈관외유출 정도를 측정할 수 있다.16)24) 또한 Evans blue가 형광을 띄는 것을 이용하여 형광현미경으로 유출을 관찰할 수 있다. 본 연구에서는 Evans blue를 정맥 주사한 후 혈관내에 존재하는 Evans blue를 생리식염수로 제거하고 혈관을 투과한 Evans blue를 formamide로 추출하여 620nm의 분광광도계로 투과량을 측정하였다.
본 실험에서 고장식염수를 흡입시키면 흰쥐 비점막에서 혈관투과성이 용량 의존성으로 증가하였다. 고장식염수에 의한 혈관투과성이 지각신경 종말에서 방출되는 신경펩티드에 기인한다는 것을 규명하기 위하여 다음의 두가지 실험을 시행하였다. 첫번째는 지각신경 종말에서 방출된 신경펩티드의 효과가 neutral endopeptidase에 의하여 조절되는지의 여부에 관하여 실험하였다. Neutral endopeptidase는 지각신경 종말로부터 방출되는 신경펩티드에 대한 수용체를 갖고 있는 비점막 세포의 세포막에 붙어 있는 효소로 substance P와 같은 신경펩티드를 분해하여 비활성화시켜 신경성 염증의 효과를 억제시킨다. 따라서 본 실험에서는 phosphoramidon 전처치로 neutral endopeptidase의 정상적인 활동을 억제함으로써 3.6% 고장식염수에 의한 혈관투과성이 증가하였고, 이러한 결과는 고장식염수에 의한 혈관투과성의 증가가 neutral endopeptidase에 의하여 분해되지 않는 히스타민, serotonin, prostaglandin 또는 leukotrien 등의 화학매개체에 의한 것보다는 신경펩티드에 의하여 매개되는 것으로 생각된다. 흰쥐에서 neutral endopeptidase의 활성을 감소시키는 Sendai 바이러스 감염22)과 다른 호흡기 감염 등4)은 혈관투과성을 증가시킨다. 또한 대기오염의 흡입27), 흡연7)은 neutral endopeptidase 활성을 감소시켜 신경펩티드에 대한 기도반응성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 정상적인 neutral endopeptidase 활동하에서 신경펩티드의 농도는 낮게 되어 따라서 신경성 염증 반응이 미미하여 임상적으로 중요하지 않다. 그러나, neutral endopeptidase 활성이 감소되면 이러한 반응은 증가되어 천식과 같은 질병과 비점막과민성을 증가시킨다.16) 두번째 실험으로는 capsaicin을 이용하여 화학적으로 지각신경 종말에서 substance P등의 신경펩티드를 고갈시켜 탈감작시켰다. Jancso12)는 capsaicin 전처치로 지각신경이 탈감작되어 여러 자극에 반응이 없다고 하였다. 본 실험에서 capsaicin으로 지각신경 종말을 탈감작시키면 3.6% 고장식염수에 의하여 유발된 혈관투과성은 억제되었다. 또한 capsaicin을 전처치한 후 substance P를 투여하여 혈관투과성에 변화가 없는 것은 혈관이 신경펩티드에 반응할 수 있는 능력이 정상이라는 것을 암시한다. 고장식염수가 혈관투과성을 증가시켰지만 이러한 기전이 오스몰농도(osmolarity)의 변화에 기인하는 것인지, 혹은 특수한 이온의 변화에 기인하는 것인지는 본 실험에서는 확인할 수 없었다. Allegra등1)은 천식 환자에서 증류수를 초음파 분무기로 흡입하면 기도 저항이 증가한다고 보고하였고, Schoeffel등25)은 등장액을 제외한 저장식염수 및 고장식염수 흡입은 천식 환자에서 유의하게 1초간 강제성 호기량을 감소시켰으나 정상 대조군에서는 반응이 없다고 하였다. 오스몰농도 변화가 1초간 강제성 호기량을 감소시키는 기전에 대하여는 첫째는 기도를 덮고 있는 용액의 오스몰농도 변화가 자극수용체를 직접 자극하는 경우이고, 둘째는 기관점막의 표면층에 놓여 있는 비만세포에 의하여 국소적으로 히스타민이 분비에 의한 경우이다. 저장식염수를 흡입하면 비만세포 주위의 삼투압이 변화되어 물은 세포내로 이동하여 비만세포로부터 히스타민이 분비되고13), 고장식염수를 흡입하면 물을 세포 밖에서 이동시켜 호염기세포를 자극하여 히스타민을 분비하여 기도 평활근에 직접, 혹은 미주신경을 통하여 반사적으로 평활근을 수축시킨다.9)
알레르기성 비염은 비점막과민성을 특징으로하는 질환으로 비점막과민성을 측정하고 그 기전을 이해함은 알레르기성 비염의 병태생리를 밝히는데 중요한 역할을 한다. 이러한 비점막과민성을 보는 유발시험에는 감작된 특이 항원을 이용한 특이적 비점막과민성과 methacholine, 히스타민 등의 약물이나 운동, 찬공기 등의 물리적 자극에 의해 유발되는 비특이적 비점막과민성이 있다.2)5)6)28) 따라서 이러한 고장식염수를 사용한 유발 반응을 이용한 비점막과민성의 측정은 빠르고, 간편하고, 경제적이며, 면역학적으로 매개되지 않는 비점막과민성을 진단하는데 유용할 것으로 생각된다.
결론
저자는 흰쥐 비점막에서 고장식염수의 흡입이 혈장의 혈관외유출을 증가시키는지, 이러한 반응에서 신경펩티드 방출이 관여되는지를 관찰하기 위하여 흰쥐에서 Evans blue를 사용하여 혈장의 혈관외유출량을 분광광도계로 측정하였다. 흡입된 고장식염수의 농도가 증가함에 따라 Evans blue 추출량은 농도의존성으로 증가하였고, phosphoramidon으로 전처치한 군에서는 증가하였으며 capsaicin으로 전처치하여 지각신경 종말을 탈감작시킨 군에서는 감소되었다. Substance P만을 흡입시킨 군과 capsaicin으로 전처치한 후 substance P을 흡입시킨 군에서의 Evans blue 추출량에는 차이가 없었다. 따라서 흰쥐의 비점막에서 고장식염수는 지각신경을 자극하여 신경펩티드를 방출하여 혈관의 투과성을 증가시킴을 알 수 있었고, 고장식염수의 흡입에 의한 유발반응 검사는 비점막 과민증의 진단에 유용할 것으로 생각된다.
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